引用本文： 謝國明, 董士奎, 皇甫小橋, 趙金忠. 保留脛骨殘端重建前交叉韌帶對韌帶重塑相關基因表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(1): 15-20. doi: 10.7507/1002-1892.20160004 復制
近年來，隨著關節鏡技術的飛速發展，保留脛骨殘端重建前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）取得了令人滿意的臨床療效。與不保留脛骨殘端重建ACL相比，雖然保留脛骨殘端ACL重建在膝關節穩定性和功能方面都取得了滿意效果[1]，但相關機制未見報道。許多學者認為，由于保留了ACL組織的血管網絡和神經纖維[2-4]，ACL殘端對重建后移植物的再血管化、細胞增殖、神經再生均有促進作用。然而，ACL重建后移植物重塑過程中的分子變化以及保留脛骨殘端對韌帶重塑、血管再生以及神經再支配相關基因表達的影響尚罕見報道。本研究中，我們通過實時熒光定量PCR觀察了Ⅰ型膠原前膠原α1基因（collagen type 1A1，COL1A1）、Ⅲ型膠原前膠原α1基因（collagen type 3A1，COL3A1）、TGF-β1、VEGF、生長相關蛋白43（growth-associated protein 43，GAP-43）和神經營養因子3（neurotrophin 3，NT-3）等基因在兔ACL重建后不同時間點的表達水平，并比較保留與不保留脛骨殘端重建ACL移植物重塑過程中基因表達差異，旨在探討保留脛骨殘端能否促進各相關基因的表達。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑 、儀器
健康成年新西蘭大白兔60只，雌雄不限，體質量2.5～3.2 kg，由上海交通大學附屬第六人民醫院實驗動物中心提供。動物造模前單籠適應性飼養2 周。
Trizol（Invitrogen公司，美國）；M-MLV 逆轉錄酶、核糖核酸酶抑制劑（Takara公司，日本）。低溫高速臺式離心機（上海醫用分析儀器廠）；紫外可見分光光度儀（島津公司，日本）；瓊脂糖凝膠電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將60只新西蘭大白兔隨機分為4組，分別為正常對照組（A組，n=6）、假手術組（B組，n=18）、不保留殘端組（C組，n=18）和保留殘端組（D組，n=18）。術前行雙側膝關節前抽屜試驗與Lachman試驗，均正常。每只兔均選取左側膝關節行ACL重建手術。
A組不做任何處理。B、C、D組動物以3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）耳緣靜脈緩慢注射麻醉，沿髕骨旁內側緣作一長約3.5 cm縱切口，依次切開皮膚、皮下組織、內側支持帶及關節囊，將髕骨翻向外側，暴露ACL。B組僅打開膝關節暴露ACL，不進行其他手術操作，閉合傷口。C組將ACL完全切斷，去除脛骨止點殘端纖維重建ACL；D組自股骨端止點處將ACL切斷，不去除脛骨止點殘端纖維。取同側半腱肌肌腱作為移植物，折成雙股，用3-0肌腱線編織縫合；建立脛骨隧道，外口在脛骨近端內側副韌帶遠方，內口位于脛骨髁間棘ACL止點處，膝關節屈曲70～90°，建立股骨隧道，然后在牽引線引導下植入移植物，股骨干遠端平行鉆2個骨洞，形成骨橋，下止點同樣鉆脛骨骨橋，移植物張力適中，兩端打結固定[5]。其中D組保留約0.5 cm的ACL脛骨殘端，縫合于移植物上并給予適當牽張。見圖 1。聚維酮碘溶液、慶大霉素生理鹽水沖洗關節腔3次，將髕骨復位，1號絲線逐層縫合切口。術后切口不給予包扎，不進行膝關節固定，自由活動。每天肌肉注射青霉素20萬U/d，持續7 d。
圖1
兔ACL 重建模型
? 正常ACL ? ACL 脛骨殘端 ? 不保留脛骨殘端重建 ? 保留脛骨殘端重建
Figure1. ACL reconstruction in a rabbit model? Normal ACL ? ACL tibial remnant ? ACL reconstruction without remnant preservation ? ACL reconstruction with remnant preservation
B、C、D組分別于術后2、6、12周過量麻醉處死6只實驗動物，立即打開膝關節，暴露并切取各組ACL移植物與殘端組織，液氮冷凍后—80℃貯存。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察實驗動物一般狀況、膝關節活動范圍以及切口愈合情況。
1.3.2 實時熒光定量PCR
檢測采用Trizol法提取組織總RNA，經逆轉錄酶轉錄合成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix在實時熒光定量PCR 儀上行PCR 反應，引物序列見表 1。反應體系15 μL：2×SYBR Green緩沖液10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌去離子水補齊至15 μL。擴增條件：95℃、10 min，95℃、15 s，72℃、20 min，40個循環。以GAPDH 為對照基因，采用2-ΔΔCt 法計算各目的基因mRNA相對表達量；將A組各基因表達量設為1。
表1
各目的基因引物序列
Table1.
Primer sequence of target genes
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后實驗動物一般狀況均良好，無死亡，切口愈合好，無感染。術后2周均呈跛行步態，術后4周清醒狀態下膝關節被動活動度均達到正常。
2.2 實時熒光定量PCR檢測
2.2.1 COL1A1
術后各時間點A、B組間COL1A1 mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；D組均高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。與A、B組相比：C組COL1A1 mRNA相對表達量于術后6周上升達峰值（P＜0.05），12周降至正常水平（P＞0.05）；D組COL1A1 mRNA相對表達量于術后6、12周顯著增加（P＜0.05），術后6周達峰值。見表 2。
表2
實時熒光定量PCR檢測各組術后各時間點目的基因mRNA相對表達量（n=6，2.2.2 COL3A1
術后各時間點A、B組間COL3A1 mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；D組COL3A1 mRNA相對表達量于術后2、6周顯著高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05），術后12周兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與A、B組相比：C、D組COL3A1 mRNA相對表達量變化相似，均于術后6周達峰值，12周急劇下降，除C組術后2周外，其余各時間點與A、B組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
2.2.3 VEGF
術后各時間點A、B組間VEGF mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。術后2、6周C、D組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），術后12周D組VEGF mRNA相對表達量顯著高于C組（P＜0.05）。與A、B組相比：術后2周，C、D組VEGF mRNA相對表達量差異均無統計學意義（P＞0.05）；C組于術后6周升高、12周恢復正常，D組術后6、12周持續升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
2.2.4 TGF-β1
與A組相比，B組TGF-β1 mRNA相對表達量在術后2、6周顯著增加（P＜0.05），12周恢復正常（P＞0.05）。D組TGF-β1 mRNA相對表達量在術后6、12周均顯著高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；2周時C、D組差異無統計學意義（P＞0.05）。與A組相比：C組術后2周表達升高（P＜0.05），6周表達有所下降（P＜0.05），術后12周恢復正常（P＞0.05）；D組術后6、12周表達水平持續上升（P＜0.05）。與B組相比：C組術后6周表達下降（P＜0.05），D組術后12周表達升高（P＜0.05），其余各時間點差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
2.2.5 GAP-43
術后各時間點GAP-43 mRNA相對表達量B組均高于A組，D組均高于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與A組相比：C組GAP-43 mRNA相對表達量在術后2周升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），于術后6周達峰值（P＜0.05），12周恢復正常；D組各時間點均高于A組（P＜0.05），術后6周達峰值（P＞0.05）。與B組相比：C組GAP-43 mRNA相對表達量在術后12周顯著下降（P＜0.05），其余各時間點差異無統計學意義（P＞0.05）；D組與B組相比，術后2、6周持續增加，并于6周達峰值，差異均有統計學意義（P＜0.05）；術后12周逐漸下降，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
2.2.6 NT-3
術后各時間點A、B組間NT-3 mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；與C組相比，D組NT-3 mRNA相對表達量于術后2、12周顯著增加（P＜0.05），術后6周兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與A、B組相比：C組NT-3 mRNA相對表達量在術后6、12周顯著升高（P＜0.05），并于術后12周達峰值；D組各時間點均顯著升高（P＜0.05）。見表 2。
3 討論
目前ACL損傷后脛骨殘留纖維的作用日益受到重視。國內外許多學者逐漸認識到原ACL殘端對ACL移植物的愈合及本體感覺恢復具有重要促進作用，在不妨礙ACL重建手術操作的前提下，應盡量保留韌帶殘端。
本研究中，我們發現在韌帶重塑過程中保留殘端組與其他組相比，靶基因的改變存在時間依賴性；此外，與其他組相比，保留殘端組許多靶基因的mRNA水平變化在某些時間點差異有統計學意義。既往研究表明[6]，Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成的調控主要在翻譯前水平，在兔ACL損傷模型中，COL1A1和COL3A1 mRNA表達水平在ACL愈合重塑過程中增加。Spindler等[7]發現，人ACL損傷1年后，其ACL殘留纖維仍有Ⅰ型膠原蛋白基因的表達，表明在ACL中殘存細胞活力，ACL損傷后內源性細胞活性增強，可能有利于損傷后韌帶修復。在大鼠模型中，冷凍解凍的肌腱在術后第6周和12周COL3A1基因水平顯著高于假手術組[8]，可能由于韌帶化造成。我們的研究表明，在保留殘端組COL1A1與COL3A1 mRNA表達在大多數時間點均顯著增加，而在不保留殘端組僅在術后6周增加，支持既往學者觀點，即保留脛骨殘留纖維可能創建有利于調節膠原蛋白合成和早期組織修復的微環境。
Petersen等[9]報道，在羊ACL重建模型中，術后6周有VEGF表達，52周減少。同樣，在家兔ACL重建模型中，VEGF參與移植物韌帶重塑過程，在術后2～3周韌帶重塑早期VEGF表達增加，雖然移植物中VEGF陽性細胞率下降，但術后3～8 周移植物新生血管繼續增加[10-11]。VEGF基因表達可受其他生長因子調控而上調[12]。既往研究表明，保留ACL殘留纖維重建ACL可促進移植物的早期血運重建[13]。本研究結果顯示，保留殘端組VEGF表達持續增加，表明保留脛骨殘留纖維在促進血管再生和上調相關生長因子中起著非常重要的作用。
TGF-β1可增加膠原蛋白的合成和細胞增殖，在調控韌帶重塑和愈合過程中起著關鍵作用[14]。研究顯示[15]，在犬ACL重建模型中，采用TGF-β1免疫組織化學染色檢測其表達水平，術后1～6周增加，術后12周降至術前水平。內側副韌帶損傷模型中，TGF-β1表達水平在損傷后3 d～6周增加[16]。本研究結果顯示，保留殘端組TGF-β1 mRNA表達水平持續增加，表明保留脛骨殘留纖維在促進韌帶重塑過程中起著關鍵作用。
GAP-43作為軸突再生的標志物，在神經損傷和外周炎性反應時表達上調。既往研究表明，術后4～16周大鼠髕腱自體移植物中GAP-43表達，提示在移植物愈合過程中其參與神經的再支配[17-18]。本研究中，保留殘端組與不保留殘端組在移植愈合早期階段，GAP-43 mRNA表達水平均顯著增加，可能是由局部炎性反應引起，該結果與既往報道一致。在保留殘端組，GAP-43 mRNA表達水平持續增加，表明保留脛骨殘留纖維可促進軸突再生，導致相關生長因子長期表達上調，并于術后6周達峰值，術后12周逐漸下降，表明存在周圍神經系統的神經再生和重塑。
NT-3作為靶源性神經生長因子，主要營養本體感覺神經元，支配肌肉、肌腱和關節[19]。既往研究表明[20-21]，在大鼠坐骨神經局部應用NT-3可促進神經再生，NT-3 mRNA表達上調表明NT-3在靶器官內合成，以促進神經再生。本研究中，與不保留殘端組相比，保留殘端組NT-3 mRNA表達水平在術后2、12周顯著增加，表明保留脛骨殘留纖維可促進NT-3 mRNA表達上調。
綜上述，ACL移植物中存在促進血管生成、修復以及與神經修復相關的基因表達，并有時間依賴性；保留脛骨殘留纖維重建ACL可明顯促進某些時間點各相關基因的表達。但本研究尚存在一些局限性：如本研究結果可能存在物種特異性；另外我們只對與韌帶重塑密切相關因子的基因表達水平進行了觀測，未檢測其蛋白水平。這些均有待進一步研究明確。
近年來，隨著關節鏡技術的飛速發展，保留脛骨殘端重建前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）取得了令人滿意的臨床療效。與不保留脛骨殘端重建ACL相比，雖然保留脛骨殘端ACL重建在膝關節穩定性和功能方面都取得了滿意效果[1]，但相關機制未見報道。許多學者認為，由于保留了ACL組織的血管網絡和神經纖維[2-4]，ACL殘端對重建后移植物的再血管化、細胞增殖、神經再生均有促進作用。然而，ACL重建后移植物重塑過程中的分子變化以及保留脛骨殘端對韌帶重塑、血管再生以及神經再支配相關基因表達的影響尚罕見報道。本研究中，我們通過實時熒光定量PCR觀察了Ⅰ型膠原前膠原α1基因（collagen type 1A1，COL1A1）、Ⅲ型膠原前膠原α1基因（collagen type 3A1，COL3A1）、TGF-β1、VEGF、生長相關蛋白43（growth-associated protein 43，GAP-43）和神經營養因子3（neurotrophin 3，NT-3）等基因在兔ACL重建后不同時間點的表達水平，并比較保留與不保留脛骨殘端重建ACL移植物重塑過程中基因表達差異，旨在探討保留脛骨殘端能否促進各相關基因的表達。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑 、儀器
健康成年新西蘭大白兔60只，雌雄不限，體質量2.5～3.2 kg，由上海交通大學附屬第六人民醫院實驗動物中心提供。動物造模前單籠適應性飼養2 周。
Trizol（Invitrogen公司，美國）；M-MLV 逆轉錄酶、核糖核酸酶抑制劑（Takara公司，日本）。低溫高速臺式離心機（上海醫用分析儀器廠）；紫外可見分光光度儀（島津公司，日本）；瓊脂糖凝膠電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將60只新西蘭大白兔隨機分為4組，分別為正常對照組（A組，n=6）、假手術組（B組，n=18）、不保留殘端組（C組，n=18）和保留殘端組（D組，n=18）。術前行雙側膝關節前抽屜試驗與Lachman試驗，均正常。每只兔均選取左側膝關節行ACL重建手術。
A組不做任何處理。B、C、D組動物以3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）耳緣靜脈緩慢注射麻醉，沿髕骨旁內側緣作一長約3.5 cm縱切口，依次切開皮膚、皮下組織、內側支持帶及關節囊，將髕骨翻向外側，暴露ACL。B組僅打開膝關節暴露ACL，不進行其他手術操作，閉合傷口。C組將ACL完全切斷，去除脛骨止點殘端纖維重建ACL；D組自股骨端止點處將ACL切斷，不去除脛骨止點殘端纖維。取同側半腱肌肌腱作為移植物，折成雙股，用3-0肌腱線編織縫合；建立脛骨隧道，外口在脛骨近端內側副韌帶遠方，內口位于脛骨髁間棘ACL止點處，膝關節屈曲70～90°，建立股骨隧道，然后在牽引線引導下植入移植物，股骨干遠端平行鉆2個骨洞，形成骨橋，下止點同樣鉆脛骨骨橋，移植物張力適中，兩端打結固定[5]。其中D組保留約0.5 cm的ACL脛骨殘端，縫合于移植物上并給予適當牽張。見圖 1。聚維酮碘溶液、慶大霉素生理鹽水沖洗關節腔3次，將髕骨復位，1號絲線逐層縫合切口。術后切口不給予包扎，不進行膝關節固定，自由活動。每天肌肉注射青霉素20萬U/d，持續7 d。
圖1
兔ACL 重建模型
? 正常ACL ? ACL 脛骨殘端 ? 不保留脛骨殘端重建 ? 保留脛骨殘端重建
Figure1. ACL reconstruction in a rabbit model? Normal ACL ? ACL tibial remnant ? ACL reconstruction without remnant preservation ? ACL reconstruction with remnant preservation
B、C、D組分別于術后2、6、12周過量麻醉處死6只實驗動物，立即打開膝關節，暴露并切取各組ACL移植物與殘端組織，液氮冷凍后—80℃貯存。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察實驗動物一般狀況、膝關節活動范圍以及切口愈合情況。
1.3.2 實時熒光定量PCR
檢測采用Trizol法提取組織總RNA，經逆轉錄酶轉錄合成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix在實時熒光定量PCR 儀上行PCR 反應，引物序列見表 1。反應體系15 μL：2×SYBR Green緩沖液10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌去離子水補齊至15 μL。擴增條件：95℃、10 min，95℃、15 s，72℃、20 min，40個循環。以GAPDH 為對照基因，采用2-ΔΔCt 法計算各目的基因mRNA相對表達量；將A組各基因表達量設為1。
表1
各目的基因引物序列
Table1.
Primer sequence of target genes
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后實驗動物一般狀況均良好，無死亡，切口愈合好，無感染。術后2周均呈跛行步態，術后4周清醒狀態下膝關節被動活動度均達到正常。
2.2 實時熒光定量PCR檢測
2.2.1 COL1A1
術后各時間點A、B組間COL1A1 mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；D組均高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。與A、B組相比：C組COL1A1 mRNA相對表達量于術后6周上升達峰值（P＜0.05），12周降至正常水平（P＞0.05）；D組COL1A1 mRNA相對表達量于術后6、12周顯著增加（P＜0.05），術后6周達峰值。見表 2。
表2
實時熒光定量PCR檢測各組術后各時間點目的基因mRNA相對表達量（n=6，2.2.2 COL3A1
術后各時間點A、B組間COL3A1 mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；D組COL3A1 mRNA相對表達量于術后2、6周顯著高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05），術后12周兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與A、B組相比：C、D組COL3A1 mRNA相對表達量變化相似，均于術后6周達峰值，12周急劇下降，除C組術后2周外，其余各時間點與A、B組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
2.2.3 VEGF
術后各時間點A、B組間VEGF mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。術后2、6周C、D組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），術后12周D組VEGF mRNA相對表達量顯著高于C組（P＜0.05）。與A、B組相比：術后2周，C、D組VEGF mRNA相對表達量差異均無統計學意義（P＞0.05）；C組于術后6周升高、12周恢復正常，D組術后6、12周持續升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
2.2.4 TGF-β1
與A組相比，B組TGF-β1 mRNA相對表達量在術后2、6周顯著增加（P＜0.05），12周恢復正常（P＞0.05）。D組TGF-β1 mRNA相對表達量在術后6、12周均顯著高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；2周時C、D組差異無統計學意義（P＞0.05）。與A組相比：C組術后2周表達升高（P＜0.05），6周表達有所下降（P＜0.05），術后12周恢復正常（P＞0.05）；D組術后6、12周表達水平持續上升（P＜0.05）。與B組相比：C組術后6周表達下降（P＜0.05），D組術后12周表達升高（P＜0.05），其余各時間點差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
2.2.5 GAP-43
術后各時間點GAP-43 mRNA相對表達量B組均高于A組，D組均高于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與A組相比：C組GAP-43 mRNA相對表達量在術后2周升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），于術后6周達峰值（P＜0.05），12周恢復正常；D組各時間點均高于A組（P＜0.05），術后6周達峰值（P＞0.05）。與B組相比：C組GAP-43 mRNA相對表達量在術后12周顯著下降（P＜0.05），其余各時間點差異無統計學意義（P＞0.05）；D組與B組相比，術后2、6周持續增加，并于6周達峰值，差異均有統計學意義（P＜0.05）；術后12周逐漸下降，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
2.2.6 NT-3
術后各時間點A、B組間NT-3 mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；與C組相比，D組NT-3 mRNA相對表達量于術后2、12周顯著增加（P＜0.05），術后6周兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與A、B組相比：C組NT-3 mRNA相對表達量在術后6、12周顯著升高（P＜0.05），并于術后12周達峰值；D組各時間點均顯著升高（P＜0.05）。見表 2。
3 討論
目前ACL損傷后脛骨殘留纖維的作用日益受到重視。國內外許多學者逐漸認識到原ACL殘端對ACL移植物的愈合及本體感覺恢復具有重要促進作用，在不妨礙ACL重建手術操作的前提下，應盡量保留韌帶殘端。
本研究中，我們發現在韌帶重塑過程中保留殘端組與其他組相比，靶基因的改變存在時間依賴性；此外，與其他組相比，保留殘端組許多靶基因的mRNA水平變化在某些時間點差異有統計學意義。既往研究表明[6]，Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成的調控主要在翻譯前水平，在兔ACL損傷模型中，COL1A1和COL3A1 mRNA表達水平在ACL愈合重塑過程中增加。Spindler等[7]發現，人ACL損傷1年后，其ACL殘留纖維仍有Ⅰ型膠原蛋白基因的表達，表明在ACL中殘存細胞活力，ACL損傷后內源性細胞活性增強，可能有利于損傷后韌帶修復。在大鼠模型中，冷凍解凍的肌腱在術后第6周和12周COL3A1基因水平顯著高于假手術組[8]，可能由于韌帶化造成。我們的研究表明，在保留殘端組COL1A1與COL3A1 mRNA表達在大多數時間點均顯著增加，而在不保留殘端組僅在術后6周增加，支持既往學者觀點，即保留脛骨殘留纖維可能創建有利于調節膠原蛋白合成和早期組織修復的微環境。
Petersen等[9]報道，在羊ACL重建模型中，術后6周有VEGF表達，52周減少。同樣，在家兔ACL重建模型中，VEGF參與移植物韌帶重塑過程，在術后2～3周韌帶重塑早期VEGF表達增加，雖然移植物中VEGF陽性細胞率下降，但術后3～8 周移植物新生血管繼續增加[10-11]。VEGF基因表達可受其他生長因子調控而上調[12]。既往研究表明，保留ACL殘留纖維重建ACL可促進移植物的早期血運重建[13]。本研究結果顯示，保留殘端組VEGF表達持續增加，表明保留脛骨殘留纖維在促進血管再生和上調相關生長因子中起著非常重要的作用。
TGF-β1可增加膠原蛋白的合成和細胞增殖，在調控韌帶重塑和愈合過程中起著關鍵作用[14]。研究顯示[15]，在犬ACL重建模型中，采用TGF-β1免疫組織化學染色檢測其表達水平，術后1～6周增加，術后12周降至術前水平。內側副韌帶損傷模型中，TGF-β1表達水平在損傷后3 d～6周增加[16]。本研究結果顯示，保留殘端組TGF-β1 mRNA表達水平持續增加，表明保留脛骨殘留纖維在促進韌帶重塑過程中起著關鍵作用。
GAP-43作為軸突再生的標志物，在神經損傷和外周炎性反應時表達上調。既往研究表明，術后4～16周大鼠髕腱自體移植物中GAP-43表達，提示在移植物愈合過程中其參與神經的再支配[17-18]。本研究中，保留殘端組與不保留殘端組在移植愈合早期階段，GAP-43 mRNA表達水平均顯著增加，可能是由局部炎性反應引起，該結果與既往報道一致。在保留殘端組，GAP-43 mRNA表達水平持續增加，表明保留脛骨殘留纖維可促進軸突再生，導致相關生長因子長期表達上調，并于術后6周達峰值，術后12周逐漸下降，表明存在周圍神經系統的神經再生和重塑。
NT-3作為靶源性神經生長因子，主要營養本體感覺神經元，支配肌肉、肌腱和關節[19]。既往研究表明[20-21]，在大鼠坐骨神經局部應用NT-3可促進神經再生，NT-3 mRNA表達上調表明NT-3在靶器官內合成，以促進神經再生。本研究中，與不保留殘端組相比，保留殘端組NT-3 mRNA表達水平在術后2、12周顯著增加，表明保留脛骨殘留纖維可促進NT-3 mRNA表達上調。
綜上述，ACL移植物中存在促進血管生成、修復以及與神經修復相關的基因表達，并有時間依賴性；保留脛骨殘留纖維重建ACL可明顯促進某些時間點各相關基因的表達。但本研究尚存在一些局限性：如本研究結果可能存在物種特異性；另外我們只對與韌帶重塑密切相關因子的基因表達水平進行了觀測，未檢測其蛋白水平。這些均有待進一步研究明確。
