引用本文： 徐樂勤, 丁道芳, 李曉鋒, 施杞, 王擁軍, 周重建. 過表達Mash-1基因促進小鼠胚胎干細胞向神經細胞分化的研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(12): 1553-1559. doi: 10.7507/1002-1892.20150331 復制
胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）是來源于哺乳動物早期胚胎內細胞團中的一種二倍體細胞，具有保持未分化狀態無限增殖的特點[1]。在特定條件下，ESC能向3個胚層（內、中、外胚層）細胞分化[2-4]，目前，ESC移植治療神經系統疾病的研究越來越受到關注。研究表明，移植的ESC可為神經系統提供神經營養因子、減少損傷后的炎性反應，或分化成少突膠質細胞參與髓鞘的再生，或分化成神經元形成新的神經連接，從而促進神經功能的恢復[5-8]。誘導ESC向神經細胞分化的方法較多，但仍存在誘導時間長、步驟復雜、細胞分化程度不一致等問題，而利用感染或其他技術向ESC引入某些基因，可實現ESC定向分化，并用于疾病治療[9-14]。其中，在ESC維持全能性時，Mash-1基因的轉錄受到抑制；一旦神經分化發生，Mash-1基因的轉錄則被上調[12]。敲除Mash-1基因可導致神經發育不全或特定神經元亞型的缺失[13-14]。本課題組前期實驗表明，在大鼠膠質細胞中過表達Mash-1基因可使其向神經元轉化[15]，提示Mash-1基因在神經系統發育過程中有著至關重要的作用。本次實驗旨在進一步觀察過表達Mash-1基因對小鼠ESC向神經細胞分化的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
T載體、MSCV載體及293T細胞（上海中醫藥大學脊柱病研究所）；小鼠ESC（CE3細胞；中國科學院上海生命研究院）；Trizol、脂質體2000、大腸桿菌（Invitrogen公司，美國）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；Taq酶、dNTP、MgCl2、BglⅡ限制性內切酶、XhoⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶（New England Biolabs公司，美國）；質粒抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；DMEM、DMEM/F12、神經干細胞培養基、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；FBS（BIOCHROM公司，英國）；巢蛋白（nestin）、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）抗體（Abcam公司，英國）；山羊抗小鼠IgG二抗（KPL公司，美國）。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；紫外分光光度計（Thermo公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 CE3細胞培養及分組
將CE3細胞置于由0.2%明膠包被的培養皿中，采用ESC完全培養液（每1 000 毫升培養液中含DMEM 83 mL、FBS 15 mL、NEAA 1 mL、L-谷氨酰胺1 mL、β-巰基乙醇100 μL、LIF 100 μL）培養，每天換液1次。待細胞生長至80%融合時，以0.125%胰蛋白酶消化，按1∶6比例傳代。取第5代細胞進行實驗觀察。根據處理方法不同，將CE3細胞分為3組，分別為感染MSCV-Mash-1組（MSCV-Mash-1-CE3組）、感染MSCV空載體組（MSCV-CE3組）及未感染組（CE3組）。
1.2.2 構建MSCV-Mash-1質粒
從2周齡C57 BL/6小鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）腦組織中抽提總RNA，通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。以此cDNA為模板，采用PCR擴增Mash-1基因。將逆轉錄病毒載體質粒MSCV和Mash-1基因用BglⅡ和XhoⅠ限制性內切酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收反轉錄病毒載體MSCV和Mash-1基因的 DNA 片段，再經T4 DNA 連接酶連接過夜；連接產物轉化感受態大腸桿菌，經含氨芐青霉素（60 μg/mL）的LB平皿篩選克隆、提取質粒后，用BglⅡ和XhoⅠ限制性內切酶雙酶切和BglⅡ限制性內切酶單酶切鑒定，再送大連TaKaRa生物公司測序。測序正確的菌株于37℃擴增搖菌100 mL，提取重組反轉錄病毒表達載體陽性質粒，命名為 MSCV-Mash-1，測定其核酸濃度，于-20℃保存備 用。
1.2.3 病毒包裝及感染
常規293T細胞培養，待生長達90%融合時，使用脂質體2000將MSCV-Mash-1或MSCV空載體質粒感染至293T細胞；分別于感染后24、48 h取病毒上清混合，置于-80℃保存備用。
待第5代CE3細胞生長至70%～80%融合時，吸除細胞培養液，加入收集的混合病毒上清2 mL，置于37℃細胞培養箱中，感染4 h后更換為ESC完全培養液培養。次日同上法再感染1次。于第2次感染后72 h，采用含潮霉素（100 μg/mL）的ESC完全培養液篩選陽性細胞。由于MSCV載體帶有潮霉素抗性，因此成功感染MSCV-Mash-1或MSCV空載體質粒的CE3細胞具有潮霉素抗性，而未感染的CE3細胞將被潮霉素殺死。抽提感染MSCV-Mash-1和MSCV空載體質粒的CE3細胞以及正常CE3細胞RNA，通過逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA，然后進行PCR鑒定細胞Mash-1基因的表達情況。
1.2.4 體外誘導CE3細胞向神經細胞分化培養及觀察
待3組細胞生長至80%融合時，用0.125%胰蛋白酶消化成單細胞，以離心半徑13.5 cm，800 r/ min離心5 min，然后用擬胚體（embryonic body，EB）培養液（每1 000毫升培養液中含DMEM 83 mL、FBS 15 mL、NEAA 1 mL、L-谷氨酰胺1 mL、β-巰基乙醇100 μL）重懸細胞，調整細胞密度為1×105 個/ mL。然后用20 μL移液槍將細胞懸液均勻滴在直徑10 cm的細菌培養皿蓋上，將皿蓋翻轉蓋于培養皿上，于培養皿中加入10 mL PBS，置于37℃、5%CO2細胞培養箱懸滴培養。培養2 d后，在懸滴底部觀察到EB形成，用1 mL槍頭將EB轉至直徑10 cm的細菌培養皿中，加入10 mL EB培養液懸浮培養。培養2 d后，將EB轉移至預先包被0.2%明膠的培養皿中，進行貼壁培養；待EB貼壁后，將培養液更換為神經培養液（每1 000毫升培養液中含DMEM/F12 47.8 mL、神經干細胞培養基 47.8 mL、NEAA 1 mL、L-谷氨酰胺 1 mL、N2 500 μL、B27 1 mL、丙酮酸鈉 1 mL），每3 天換液1次。于誘導培養7、21 d倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
1.2.5 免疫熒光染色檢測神經細胞特異性蛋白的表達
于貼壁后誘導培養7 d時檢測3組細胞nestin的表達情況，21 d時檢測細胞β-tubulinⅢ的表達情況。各時間點取3組細胞經PBS清洗2次，預冷4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗2 min×3次，0.5%PBST通透20 min，PBS洗2min×3次，加入5%牛血清白蛋白封閉20 min，分別加nestin或β-tubulinⅢ一抗（1∶500稀釋），4℃孵育過夜；37℃恒溫箱孵育1 h，PBS洗5 min×3次，加紅色熒光標記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1 h，PBS洗5 min×3 次，加入1 μg/mL DAPI室溫孵育10 min，PBS洗2 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。每組細胞隨機選取6個200倍視野進行陽性細胞計數，并按照以下公式計算陽性率： （陽性細胞數/細胞總數）×100%，其中陽性細胞為紅色熒光標記細胞，細胞總數為DAPI顯色的藍色熒光標記細胞。
1.2.6 細胞誘導分化后3個胚層標記基因和干細胞標記基因的表達
取貼壁后誘導培養0、1、7、14、21 d的3組細胞，PBS清洗2次，加入1 mL Trizol裂解細胞，將裂解液轉移至1.5 mL EP管中。常規提取RNA后，經紫外分光光度計測定RNA的純度和含量，將其逆轉錄成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR檢測甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）（內胚層標記基因）、Brachyury（中胚層標記基因）、FGF-5（外胚層標記基因）、Oct3/4（ESC標記基因）、nestin（神經干細胞標記基因）和β-tubulinⅢ（神經元標記基因）表達改變情況。以β-actin作為對照。根據GenBank檢索目的基因序列設計引物，采用Primer5設計擴增引物序列，由華大基因公司合成。各基因名稱和引物序列見表 1。采用ΔCt法計算各基因相對表達量。
表1
各基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product size of genes
1.3 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示。組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Mash-1基因表達
MSCV-Mash-1-CE3組細胞在700 bp處可見一亮條帶；而MSCV-CE3組及CE3組細胞在700 bp處無明顯條帶（圖 1）。提示感染MSCV-Mash-1的CE3細胞其Mash-1基因的表達明顯高于其他兩種細胞，表明基因修飾后可使CE3細胞高表達Mash-1基因。
圖1
3組細胞Mash-1基因表達 M： Marker 1：CE3組 2：MSCV-CE3組 3： MSCV-Mash-1-CE3組
Figure1.
Expression of Mash-1 gene in 3 groups M: Marker 1: CE3 group 2: MSCV-CE3 group 3: MSCV-Mash-1-CE3 group
2.2 體外誘導CE3細胞向神經細胞分化觀察
EB經神經培養液誘導培養7 d時，MSCV-Mash-1-CE3組中可見細胞呈神經干細胞樣形態，即細胞核回縮呈圓形、折光性增強，胞體呈雙極或多極形態； MSCV-CE3組和CE3組偶見細胞呈神經細胞樣形態。21 d時，MSCV-Mash-1-CE3組可見細胞長出細長軸突，出現單極、雙極或多極形態，呈神經元細胞形態；而MSCV-CE3組和CE3組僅能觀察到少數細胞長出細長軸突。見圖 2。
圖2
神經培養液誘導培養7、21 d細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×200） ? CE3組培養7 d ? MSCV-CE3組培養7 d ? MSCV-Mash-1-CE3組培養7 d ? CE3組培養21 d ? MSCV-CE3組培養21 d ? MSCV-Mash-1-CE3組培養21 d ? ?2.3 免疫熒光染色檢測神經細胞特異性蛋白的表達
免疫熒光染色示，MSCV-Mash-1-CE3組細胞經神經誘導分化后，其nestin和β-tubulinⅢ陽性細胞明顯多于MSCV-CE3組和CE3組細胞。見圖 3、4。MSCV-Mash-1-CE3組nestin和β-tubulinⅢ陽性率分別為79.22%±9.52%和84.24%±5.49%，MSCV-CE3組分別為22.38%±5.36%和15.92%±3.76%，CE3組分別為19.43%±2.76%和17.97%±1.32%。MSCV-Mash-1-CE3組nestin和β-tubulinⅢ陽性率均顯著高于MSCV-CE3組和CE3組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。
圖4
神經培養液誘導培養21 d后各組β-tubulinⅢ免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200） 從左至右分別為β-tubulinⅢ陽性染色、DAPI染色、β-tubulinⅢ與DAPI重疊 ? CE3組 ? MSCV-CE3組 ? MSCV-Mash-1-CE3組 ? ?2.4 細胞誘導分化后3個胚層標記基因以及干細胞標記基因的表達
各時間點，3組AFP及Oct3/4表達比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與CE3組和MSCV-CE3組相比，從1 d開始MSCV-Mash-1-CE3組Brachyury表達明顯降低，FGF-5、nestin明顯增高且7 d時達峰值，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；β-tubulin Ⅲ表達呈逐漸增高趨勢，于7 d后明顯高于CE3組及MSCV-CE3組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。而各時間點CE3組與MSCV-CE3組間以上指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5。
3 討論
建立穩定高效的神經分化體系，將為神經系統疾病治療藥物的篩選以及基因工程藥物的開發等研究奠定基礎，同時為細胞移植提供可靠的細胞來源，推進神經再生醫學從理論走向實踐[8, 16-17]。基因修飾是調控干細胞分化常用的生物學方法[18]，它是利用生物化學技術來修改細胞的DNA序列，以改變細胞的表型。Mash-1基因又名Ascl-1基因，位于染色體12q22-q23上，是bHLH家族的轉錄因子之一。它在哺乳動物的神經發生過程中具有重要作用，能促進多潛能細胞向神經前體細胞分化，并進一步形成神經元，同時還具有抑制神經前體細胞向星形膠質細胞分化的作用[19-20]。敲除Mash-1基因可導致小鼠端腦皺縮，嗅球和自主運動神經不能正常分化；多潛能干細胞僅能分化為神經前體細胞，不能形成成熟的神經元，導致小鼠出生后死亡[21]。而高表達Mash-1基因可使P19細胞和胚胎前體皮層細胞向神經元方向分化[22]，也可促進MSCs向神經元分化[23]。
本實驗從細胞形態、標記蛋白以及標記基因表達三方面，分析過表達Mash-1基因對CE3細胞向神經細胞分化的影響。nestin[24]和β-tubulinⅢ[25-26]蛋白分別是神經干細胞和神經元的標記蛋白，本實驗中細胞形態和免疫熒光染色觀察表明，經過Mash-1基因修飾的CE3細胞，在體外分化成神經干細胞（nestin陽性）和神經元（β-tubulinⅢ陽性）的比例明顯升高。在基因表達變化方面，Mash-1基因修飾的CE3細胞在經EB分化和神經培養液誘導后，神經外胚層標記基因FGF-5、神經干細胞標記基因nestin以及神經元標記基因β-tubulinⅢ表達明顯升高，中胚層標記基因Brachyury表達下降；而內胚層標記基因AFP和ESC標記基因Oct3/4表達3組間差異無統計學意義，說明表達Mash-1可促進CE3細胞表達神經細胞的標記蛋白和基因。
綜上述，過表達Mash-1基因具有促進小鼠ESC向神經細胞分化的作用。
胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）是來源于哺乳動物早期胚胎內細胞團中的一種二倍體細胞，具有保持未分化狀態無限增殖的特點[1]。在特定條件下，ESC能向3個胚層（內、中、外胚層）細胞分化[2-4]，目前，ESC移植治療神經系統疾病的研究越來越受到關注。研究表明，移植的ESC可為神經系統提供神經營養因子、減少損傷后的炎性反應，或分化成少突膠質細胞參與髓鞘的再生，或分化成神經元形成新的神經連接，從而促進神經功能的恢復[5-8]。誘導ESC向神經細胞分化的方法較多，但仍存在誘導時間長、步驟復雜、細胞分化程度不一致等問題，而利用感染或其他技術向ESC引入某些基因，可實現ESC定向分化，并用于疾病治療[9-14]。其中，在ESC維持全能性時，Mash-1基因的轉錄受到抑制；一旦神經分化發生，Mash-1基因的轉錄則被上調[12]。敲除Mash-1基因可導致神經發育不全或特定神經元亞型的缺失[13-14]。本課題組前期實驗表明，在大鼠膠質細胞中過表達Mash-1基因可使其向神經元轉化[15]，提示Mash-1基因在神經系統發育過程中有著至關重要的作用。本次實驗旨在進一步觀察過表達Mash-1基因對小鼠ESC向神經細胞分化的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
T載體、MSCV載體及293T細胞（上海中醫藥大學脊柱病研究所）；小鼠ESC（CE3細胞；中國科學院上海生命研究院）；Trizol、脂質體2000、大腸桿菌（Invitrogen公司，美國）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；Taq酶、dNTP、MgCl2、BglⅡ限制性內切酶、XhoⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶（New England Biolabs公司，美國）；質粒抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；DMEM、DMEM/F12、神經干細胞培養基、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；FBS（BIOCHROM公司，英國）；巢蛋白（nestin）、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）抗體（Abcam公司，英國）；山羊抗小鼠IgG二抗（KPL公司，美國）。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；紫外分光光度計（Thermo公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 CE3細胞培養及分組
將CE3細胞置于由0.2%明膠包被的培養皿中，采用ESC完全培養液（每1 000 毫升培養液中含DMEM 83 mL、FBS 15 mL、NEAA 1 mL、L-谷氨酰胺1 mL、β-巰基乙醇100 μL、LIF 100 μL）培養，每天換液1次。待細胞生長至80%融合時，以0.125%胰蛋白酶消化，按1∶6比例傳代。取第5代細胞進行實驗觀察。根據處理方法不同，將CE3細胞分為3組，分別為感染MSCV-Mash-1組（MSCV-Mash-1-CE3組）、感染MSCV空載體組（MSCV-CE3組）及未感染組（CE3組）。
1.2.2 構建MSCV-Mash-1質粒
從2周齡C57 BL/6小鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）腦組織中抽提總RNA，通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。以此cDNA為模板，采用PCR擴增Mash-1基因。將逆轉錄病毒載體質粒MSCV和Mash-1基因用BglⅡ和XhoⅠ限制性內切酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收反轉錄病毒載體MSCV和Mash-1基因的 DNA 片段，再經T4 DNA 連接酶連接過夜；連接產物轉化感受態大腸桿菌，經含氨芐青霉素（60 μg/mL）的LB平皿篩選克隆、提取質粒后，用BglⅡ和XhoⅠ限制性內切酶雙酶切和BglⅡ限制性內切酶單酶切鑒定，再送大連TaKaRa生物公司測序。測序正確的菌株于37℃擴增搖菌100 mL，提取重組反轉錄病毒表達載體陽性質粒，命名為 MSCV-Mash-1，測定其核酸濃度，于-20℃保存備 用。
1.2.3 病毒包裝及感染
常規293T細胞培養，待生長達90%融合時，使用脂質體2000將MSCV-Mash-1或MSCV空載體質粒感染至293T細胞；分別于感染后24、48 h取病毒上清混合，置于-80℃保存備用。
待第5代CE3細胞生長至70%～80%融合時，吸除細胞培養液，加入收集的混合病毒上清2 mL，置于37℃細胞培養箱中，感染4 h后更換為ESC完全培養液培養。次日同上法再感染1次。于第2次感染后72 h，采用含潮霉素（100 μg/mL）的ESC完全培養液篩選陽性細胞。由于MSCV載體帶有潮霉素抗性，因此成功感染MSCV-Mash-1或MSCV空載體質粒的CE3細胞具有潮霉素抗性，而未感染的CE3細胞將被潮霉素殺死。抽提感染MSCV-Mash-1和MSCV空載體質粒的CE3細胞以及正常CE3細胞RNA，通過逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA，然后進行PCR鑒定細胞Mash-1基因的表達情況。
1.2.4 體外誘導CE3細胞向神經細胞分化培養及觀察
待3組細胞生長至80%融合時，用0.125%胰蛋白酶消化成單細胞，以離心半徑13.5 cm，800 r/ min離心5 min，然后用擬胚體（embryonic body，EB）培養液（每1 000毫升培養液中含DMEM 83 mL、FBS 15 mL、NEAA 1 mL、L-谷氨酰胺1 mL、β-巰基乙醇100 μL）重懸細胞，調整細胞密度為1×105 個/ mL。然后用20 μL移液槍將細胞懸液均勻滴在直徑10 cm的細菌培養皿蓋上，將皿蓋翻轉蓋于培養皿上，于培養皿中加入10 mL PBS，置于37℃、5%CO2細胞培養箱懸滴培養。培養2 d后，在懸滴底部觀察到EB形成，用1 mL槍頭將EB轉至直徑10 cm的細菌培養皿中，加入10 mL EB培養液懸浮培養。培養2 d后，將EB轉移至預先包被0.2%明膠的培養皿中，進行貼壁培養；待EB貼壁后，將培養液更換為神經培養液（每1 000毫升培養液中含DMEM/F12 47.8 mL、神經干細胞培養基 47.8 mL、NEAA 1 mL、L-谷氨酰胺 1 mL、N2 500 μL、B27 1 mL、丙酮酸鈉 1 mL），每3 天換液1次。于誘導培養7、21 d倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
1.2.5 免疫熒光染色檢測神經細胞特異性蛋白的表達
于貼壁后誘導培養7 d時檢測3組細胞nestin的表達情況，21 d時檢測細胞β-tubulinⅢ的表達情況。各時間點取3組細胞經PBS清洗2次，預冷4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗2 min×3次，0.5%PBST通透20 min，PBS洗2min×3次，加入5%牛血清白蛋白封閉20 min，分別加nestin或β-tubulinⅢ一抗（1∶500稀釋），4℃孵育過夜；37℃恒溫箱孵育1 h，PBS洗5 min×3次，加紅色熒光標記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1 h，PBS洗5 min×3 次，加入1 μg/mL DAPI室溫孵育10 min，PBS洗2 min×3次，熒光顯微鏡下觀察。每組細胞隨機選取6個200倍視野進行陽性細胞計數，并按照以下公式計算陽性率： （陽性細胞數/細胞總數）×100%，其中陽性細胞為紅色熒光標記細胞，細胞總數為DAPI顯色的藍色熒光標記細胞。
1.2.6 細胞誘導分化后3個胚層標記基因和干細胞標記基因的表達
取貼壁后誘導培養0、1、7、14、21 d的3組細胞，PBS清洗2次，加入1 mL Trizol裂解細胞，將裂解液轉移至1.5 mL EP管中。常規提取RNA后，經紫外分光光度計測定RNA的純度和含量，將其逆轉錄成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR檢測甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）（內胚層標記基因）、Brachyury（中胚層標記基因）、FGF-5（外胚層標記基因）、Oct3/4（ESC標記基因）、nestin（神經干細胞標記基因）和β-tubulinⅢ（神經元標記基因）表達改變情況。以β-actin作為對照。根據GenBank檢索目的基因序列設計引物，采用Primer5設計擴增引物序列，由華大基因公司合成。各基因名稱和引物序列見表 1。采用ΔCt法計算各基因相對表達量。
表1
各基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product size of genes
1.3 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示。組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Mash-1基因表達
MSCV-Mash-1-CE3組細胞在700 bp處可見一亮條帶；而MSCV-CE3組及CE3組細胞在700 bp處無明顯條帶（圖 1）。提示感染MSCV-Mash-1的CE3細胞其Mash-1基因的表達明顯高于其他兩種細胞，表明基因修飾后可使CE3細胞高表達Mash-1基因。
圖1
3組細胞Mash-1基因表達 M： Marker 1：CE3組 2：MSCV-CE3組 3： MSCV-Mash-1-CE3組
Figure1.
Expression of Mash-1 gene in 3 groups M: Marker 1: CE3 group 2: MSCV-CE3 group 3: MSCV-Mash-1-CE3 group
2.2 體外誘導CE3細胞向神經細胞分化觀察
EB經神經培養液誘導培養7 d時，MSCV-Mash-1-CE3組中可見細胞呈神經干細胞樣形態，即細胞核回縮呈圓形、折光性增強，胞體呈雙極或多極形態； MSCV-CE3組和CE3組偶見細胞呈神經細胞樣形態。21 d時，MSCV-Mash-1-CE3組可見細胞長出細長軸突，出現單極、雙極或多極形態，呈神經元細胞形態；而MSCV-CE3組和CE3組僅能觀察到少數細胞長出細長軸突。見圖 2。
圖2
神經培養液誘導培養7、21 d細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×200） ? CE3組培養7 d ? MSCV-CE3組培養7 d ? MSCV-Mash-1-CE3組培養7 d ? CE3組培養21 d ? MSCV-CE3組培養21 d ? MSCV-Mash-1-CE3組培養21 d ? ?2.3 免疫熒光染色檢測神經細胞特異性蛋白的表達
免疫熒光染色示，MSCV-Mash-1-CE3組細胞經神經誘導分化后，其nestin和β-tubulinⅢ陽性細胞明顯多于MSCV-CE3組和CE3組細胞。見圖 3、4。MSCV-Mash-1-CE3組nestin和β-tubulinⅢ陽性率分別為79.22%±9.52%和84.24%±5.49%，MSCV-CE3組分別為22.38%±5.36%和15.92%±3.76%，CE3組分別為19.43%±2.76%和17.97%±1.32%。MSCV-Mash-1-CE3組nestin和β-tubulinⅢ陽性率均顯著高于MSCV-CE3組和CE3組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。
圖4
神經培養液誘導培養21 d后各組β-tubulinⅢ免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200） 從左至右分別為β-tubulinⅢ陽性染色、DAPI染色、β-tubulinⅢ與DAPI重疊 ? CE3組 ? MSCV-CE3組 ? MSCV-Mash-1-CE3組 ? ?2.4 細胞誘導分化后3個胚層標記基因以及干細胞標記基因的表達
各時間點，3組AFP及Oct3/4表達比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與CE3組和MSCV-CE3組相比，從1 d開始MSCV-Mash-1-CE3組Brachyury表達明顯降低，FGF-5、nestin明顯增高且7 d時達峰值，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；β-tubulin Ⅲ表達呈逐漸增高趨勢，于7 d后明顯高于CE3組及MSCV-CE3組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。而各時間點CE3組與MSCV-CE3組間以上指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 5。
3 討論
建立穩定高效的神經分化體系，將為神經系統疾病治療藥物的篩選以及基因工程藥物的開發等研究奠定基礎，同時為細胞移植提供可靠的細胞來源，推進神經再生醫學從理論走向實踐[8, 16-17]。基因修飾是調控干細胞分化常用的生物學方法[18]，它是利用生物化學技術來修改細胞的DNA序列，以改變細胞的表型。Mash-1基因又名Ascl-1基因，位于染色體12q22-q23上，是bHLH家族的轉錄因子之一。它在哺乳動物的神經發生過程中具有重要作用，能促進多潛能細胞向神經前體細胞分化，并進一步形成神經元，同時還具有抑制神經前體細胞向星形膠質細胞分化的作用[19-20]。敲除Mash-1基因可導致小鼠端腦皺縮，嗅球和自主運動神經不能正常分化；多潛能干細胞僅能分化為神經前體細胞，不能形成成熟的神經元，導致小鼠出生后死亡[21]。而高表達Mash-1基因可使P19細胞和胚胎前體皮層細胞向神經元方向分化[22]，也可促進MSCs向神經元分化[23]。
本實驗從細胞形態、標記蛋白以及標記基因表達三方面，分析過表達Mash-1基因對CE3細胞向神經細胞分化的影響。nestin[24]和β-tubulinⅢ[25-26]蛋白分別是神經干細胞和神經元的標記蛋白，本實驗中細胞形態和免疫熒光染色觀察表明，經過Mash-1基因修飾的CE3細胞，在體外分化成神經干細胞（nestin陽性）和神經元（β-tubulinⅢ陽性）的比例明顯升高。在基因表達變化方面，Mash-1基因修飾的CE3細胞在經EB分化和神經培養液誘導后，神經外胚層標記基因FGF-5、神經干細胞標記基因nestin以及神經元標記基因β-tubulinⅢ表達明顯升高，中胚層標記基因Brachyury表達下降；而內胚層標記基因AFP和ESC標記基因Oct3/4表達3組間差異無統計學意義，說明表達Mash-1可促進CE3細胞表達神經細胞的標記蛋白和基因。
綜上述，過表達Mash-1基因具有促進小鼠ESC向神經細胞分化的作用。
