引用本文： 周強, 權正學, 羅小輯, 唐可, 周栩, 張圓, 雷濤. 分化抑制因子1基因對BMP-2促進兔椎間盤軟骨終板細胞軟骨特性基因表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(12): 1547-1552. doi: 10.7507/1002-1892.20150330 復制
椎間盤是人體最大的無血管組織，其營養主要經過終板滲透獲得[1]。軟骨終板對椎間盤營養供給、維持椎間盤形態以及椎間盤內細胞正常生理功能均有重要作用，Gu等[2]研究發現椎間盤營養供給減少可誘發椎間盤退變。再生治療即通過轉入基因或細胞，增加細胞外基質合成，延緩或逆轉椎間盤退變，是退變性椎間盤疾病治療的研究熱點，目前多以髓核細胞為研究對象，對椎間盤營養供應途徑中起重要作用的軟骨終板研究較少。研究發現BMP-2有促進椎間盤軟骨終板細胞合成Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的作用[3]。Ad-BMP-2轉染椎間盤軟骨終板細胞后，分化抑制因子1（inhibitor of differentiation 1，Id1）基因表達上調[4-5]。目前對于Id1基因表達變化后，對BMP-2促進椎間盤軟骨終板細胞軟骨特異性基因表達的影響尚不清楚。為此，本實驗通過慢病毒干擾兔軟骨終板細胞Id1基因表達，研究Id1基因表達變化后對BMP-2促進椎間盤終板軟骨細胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
取2～3歲新西蘭大白兔10只，雌雄各半，體質量2.5～4.0 kg，購于重慶醫科大學實驗動物中心。
BMP-2慢病毒、 Id1慢病毒、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）慢病毒（病毒滴度均為3×108 TU/mL；重慶高圣生物醫藥有限責任公司）；引物（上海生工生物工程有限公司）；FBS、DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）； PrimeSTAR?HSDNAPolymerase、RNase抑制劑、Trizol（TaKaRa公司，日本）；DEPC（Sigma公司，美國）；兔Ⅱ型膠原ELISA試劑盒、兔蛋白多糖ELISA試劑盒（Roche公司，瑞士）；Id1抗體、BMP-2抗體（Abcam公司，英國）。
電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；凝膠成像儀穩壓DNA電泳儀（Tianneng公司，美國）；梯度PCR儀（Eppendorf MG公司，德國）；微量DNA/RNA定量儀（GeneGuent Pro公司，美國）；GDS8000凝膠掃描系統（UVP公司，美國）；GS-15R低溫高速離心機（Beckman公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Tek公司，美國）。
1.2 兔椎間盤軟骨終板細胞分離及培養
取新西蘭大白兔L1、2～L6、7節段的椎間盤終板標本，置于含10%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM/F12培養基。顯微鏡下分離軟骨終板組織，將其剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小，置于0.25%胰蛋白酶中震蕩消化30 min；以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min，移除上清液后，加入0.02%Ⅱ型膠原酶消化30 min；再以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min，移除上清液后加入0.02%Ⅱ型膠原酶消化4 h。4 h后用200目細胞篩過濾消化液，濾過液以離心半徑20 cm、800 r/ min離心5 min×2次，加入含10%FBS、青霉素100 U/ mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM/F12培養基，懸浮細胞后轉入培養瓶。待10 d左右細胞鋪滿瓶底后進行傳代，選取生長良好的第2代椎間盤軟骨終板細胞 進 行實驗。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變 化。
1.3 慢病毒轉染軟骨終板細胞效率及對細胞Id1基因表達的影響
1.3.1 實驗分組及熒光顯微鏡觀察
實驗分為4 組：A組為正常軟骨終板細胞組；B組為細胞 +20 μL GFP慢病毒轉染組；C組為細胞+20 μL高表達Id1基因慢病毒轉染組；D組為細胞+20 μL RNA干擾（RNA interference，RNAi）Id1基因慢病毒轉染組。細胞轉染步驟：取第2代椎間盤軟骨終板細胞，加入培養基懸浮細胞，調整細胞密度為3×105 個 / mL，轉移入24孔板中進行培養。培養3 d后細胞完全貼壁，加入各組對應的20 μL病毒懸液，適度混勻后，于細胞培養箱內培養。轉染72 h后采用熒光顯微鏡觀察B、C、D組轉染情況。
1.3.2 實時熒光定量PCR檢測Id1基因表達
各組轉染后3 d去除培養基，將Trizol試劑1 mL加入培養板中，按說明書步驟提取RNA備用。反轉錄體系：模板（RNA）5 μL、2×RT緩沖液10 μL、隨機六聚體引物（100 pmol/μL）1 μL、RTmix 1 μL、DEPC水3 μL；反轉錄條件：25℃、10 min，42℃、53 min，86℃、5 min。PCR反應體系：2× PCR緩沖液25 μL、Prim ers（25 pmol/μL）1 μL×2、cDNA模板2 μL、DEPC 水20.5 μL、SYBR GreenⅠ（20）0.5 μL；PCR反應條件：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，35個循環，檢測溫度72℃。以β-actin為內參照，采用2-ΔΔCt計算Id1基因相對表達量，每個樣本重復測量3次。相關基因引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。見表 1。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes
1.3.3 Western
blot檢測Id1蛋白表達 各組轉染后3 d去除培養基，PBS洗1遍；懸浮細胞，以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min，收集細胞，PBS洗1 遍。按試劑盒說明提取蛋白。用封閉液稀釋Id1蛋白抗體（1∶1 000），內參一抗GAPDH （1∶3 000），室溫孵育1.5 h；用封閉液稀釋二抗（1∶5 000），室溫孵育1.5 h。將膠片處理后進行掃描，用UVP凝膠圖像處理系統自帶Labworks4.6軟件分析條帶灰度值。
1.4 Id1基因表達變化對BMP-2促進軟骨終板細胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖的影響
1.4.1 Western
blot檢測BMP-2慢病毒轉染椎間盤軟骨終板細胞后BMP-2蛋白表達 取第2代椎間盤軟骨終板細胞于4孔板中培養5 d后分為2組，分別為細胞+10 μL BMP-2慢病毒轉染組（A組）和正常軟骨終板細胞組（B組）。A組同上法轉染BMP-2慢病毒后3 d去除培養液，B組同時間點去除培養液；以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min，收集細胞，按試劑盒說明提取蛋白。用封閉液稀釋BMP-2蛋白抗體（1∶1 000），內參一抗GAPDH（1∶3 000），室溫孵育1 h；用封閉液稀釋二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。將膠片處理后進行掃描，用UVP凝膠圖像處理系統自帶Labworks4.6軟件分析條帶灰度值，檢測兩組BMP-2蛋白表達情況。
1.4.2 實時熒光定量PCR檢測BMP-2與不同慢病毒共轉染后軟骨終板細胞Ⅱ型膠原、蛋白多糖及Id1基因表達
取第2代椎間盤軟骨終板細胞于24孔板中培養5 d后分為6組：A組為細胞+10 μL GFP慢病毒轉染組，B組為細胞+10 μL BMP-2慢病毒轉染組，C組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒轉染組，D組為細胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒轉染組，E組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒轉染組，F組為細胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒轉染組。轉染后3 d，同1.3.2方法進行實時熒光定量PCR檢測，計算Ⅱ型膠原、蛋白多糖基因相對表達量。每個樣本重復測量3 次。見表 1。
1.4.3 ELISA檢測Id1基因表達變化對BMP-2促進軟骨終板細胞合成軟骨特異性蛋白的影響
取第2 代椎間盤軟骨終板細胞于24孔板中培養5 d后分為10組：A組為正常軟骨終板細胞組，B組為細胞+10 μL慢病毒轉染組，C組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒轉染組，D組為細胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒轉染組，E組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒組，F組為細胞 +10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒轉染組，G組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒轉染組，H組為細胞 +10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒轉染組，I組為細胞+10 μL GFP慢病毒轉染組，J組為細胞 +10 μL BMP-2慢病毒轉染組。同上法細胞轉染72 h后，獲取細胞外液，按ELISA試劑盒步驟進行檢測，繪制標準曲線，計算Ⅱ型膠原和蛋白多糖濃度。
1.5 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 椎間盤軟骨終板細胞形態學觀察
兔椎間盤軟骨終板細胞于培養后5～7 d開始貼壁，10 d左右可鋪滿瓶底。原代和傳代后細胞均呈三角形或多角形。見圖 1。
圖1
原代椎間盤軟骨終板細胞培養10 d形態觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? ?2.2 慢病毒轉染軟骨終板細胞效率和對細胞Id1基因表達的影響
2.2.1 熒光顯微鏡觀察
轉染72 h后熒光顯微鏡下可見B、C、D組慢病毒均能轉染兔椎間盤終板軟骨細胞，轉染率達90%以上。見圖 2。
2.2.2 實時熒光定量PCR檢測
A、B、C、D組Id1基因相對表達量分別為1.000±0.110、0.996±0.025、2.397±0.319、0.277±0.105。與A組比較，B組GFP慢病毒轉染對Id1基因表達無明顯影響，差異無統計學意義（P＞0.05）；C組高表達Id1基因慢病毒轉染細胞后Id1基因表達顯著提高，D組RNAi Id1基因慢病毒轉染后Id1基因表達明顯降低，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
2.2.3 Western
blot檢測 A、B、C、D組Id1蛋白相對表達量分別為0.767±0.066、0.769±0.060、1.060± 0.043、0.345±0.015。與A組比較，B組GFP慢病毒轉染對Id1蛋白表達無明顯影響，差異無統計學意義（P＞0.05）；C組高表達Id1基因慢病毒轉染細胞后Id1蛋白表達顯著提高，D組RNAi Id1基因慢病毒轉染后Id1蛋白表達明顯降低，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3。
2.3 Id1表達變化對BMP-2促進軟骨終板細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達的影響
2.3.1 Western
blot檢測 BMP-2慢病毒能夠有效轉染椎間盤軟骨終板細胞，并提高BMP-2表達。A、B組BMP-2蛋白相對表達量分別為0.721±0.023、0.198±0.013，比較差異有統計學意義（t=34.946，P=0.000）。見圖 4。
2.3.2 實時熒光定量PCR檢測
與A、D組比較，B、C、E組蛋白多糖、Ⅱ型膠原、Id1基因的表達顯著提高；A、D組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。C組各基因相對表達量顯著高于B、E組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B、E組間差異無統計學意義（P＞0.05）。F組各基因表達較其余各組均明顯下調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
實時熒光定量PCR檢測各組軟骨終板細胞Ⅱ型膠原、蛋白多糖及Id1基因表達（n=3，2.3.3 ELISA檢測
與A組比較，B、I組Ⅱ型膠原、蛋白多糖表達差異無統計學意義（P＞0.05）；C、E、G、J組表達明顯增加，D、H組表達明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）；E組Ⅱ型膠原、蛋白多糖表達顯著高于C、F、G、J組，差異有統計學意義（P＜0.05）；F組兩指標表達較C、J組顯著降低，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
ELISA檢測Id1表達變化對BMP-2促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖合成的影響（n=3，3 討論
軟骨終板在椎間盤營養供給中起重要作用[6]。軟骨終板是典型透明軟骨，由細胞和基質構成。軟骨細胞和成纖維細胞是其主要細胞成分，基質主要為蛋白多糖和Ⅱ型膠原，主要由軟骨終板的細胞成分合成[7]。軟骨終板中還含有Ⅹ型膠原纖維，隨著退變和年齡增加其含量逐漸上升；Ⅹ型膠原被認為和軟骨終板的鈣化相關[8]。徐宏光等[9]研究發現隨著軟骨終板退變的加重，椎間盤退變隨之加重，表明終板退變可能引起椎間盤退變。目前也有研究認為終板損傷是引起嚴重腰痛的獨立病因[10]。椎間盤軟骨終板破壞后會引起椎間盤一系列改變，如椎間盤力學環境的改變，局部炎性介質釋放及微環境的改變。這些因素會引起椎間盤髓核基質的合成和降解失衡，更重要的是會引起椎間盤營養途徑的破壞，引起細胞數量減少[11]。椎間盤退變性疾病是臨床常見疾病，目前研究集中于通過各種方法增加髓核基質的合成，同時減少其降解。但這些方法不能從根本上恢復椎間盤營養途徑的功能，且體外實驗大都未模擬體內髓核營養缺乏的環境。通過注入細胞或增加某種基因表達來治療椎間盤退變的方法必然會引起營養物質相對匱乏，進而影響椎間盤再生的治療效果[12]。因此，維持軟骨終板的正常結構和功能，對于提高椎間盤再生治療效果具有重要意義。既往研究發現，BMP-2有促進椎間盤軟骨終板細胞合成Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的作用[3]，Ad-BMP-2轉染椎間盤終板細胞后Id1基因表達上調[4-5]。目前對于Id1基因表達變化后，對BMP-2促進椎間盤軟骨終板細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖基因表達的影響尚不清楚，因此本實驗旨在研究兩者之間的關系。
Id基因有Id1、Id2、Id3、Id4共4種亞型，為堿性螺旋環螺旋的分子，缺乏與DNA結合的結構，起到抑制細胞分化、促進細胞增殖的作用[13]。其中，對Id1基因的研究較為透徹。目前使用較多的椎間盤基因治療載體為腺相關病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒具有基因載荷大、可高效感染分裂期和非分裂期細胞、并可整合入細胞基因組的優點，是椎間盤再生治療的理想載體[14]。因此本實驗選用慢病毒為基因載體，研究Id1、BMP-2共轉染對軟骨終板細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖基因表達的影響。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，兩種慢病毒均能有效轉染椎間盤軟骨終板細胞。其中，高表達Id1基因慢病毒轉染后，椎間盤軟骨終板細胞Id1基因表達較正常軟骨終板細胞及GFP慢病毒、RNAi Id1基因慢病毒轉染細胞明顯升高，而RNAi Id1基因慢病毒轉染后細胞Id1基因表達明顯降低。Western blot結果表明，高表達Id1基因慢病毒轉染后，軟骨終板細胞Id1蛋白合成增加，RNAi Id1基因慢病毒轉染后Id1蛋白合成明顯下降。提示不同慢病毒載體轉染軟骨終板細胞能獲得穩定表達，并影響Id1的合成。
多基因聯合轉染是目前椎間盤再生治療新的研究方向，Moon等[15]以TGF-β1和IGF-1腺病毒同時轉染椎間盤細胞后發現，共轉染能夠顯著提高椎間盤細胞蛋白多糖的合成。BMP是TGF-β超家族的一種多功能細胞因子，其中BMP-2是一種被廣泛研究的細胞因子。Li等[16]的研究表明，BMP-2能夠增加鼠纖維環及移行區細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖基因的合成，同時能夠促進BMP-7基因的表達。Kim等[17]的研究發現，BMP-2能增加椎間盤細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成。椎間盤退變過程中，椎間盤細胞外基質Ⅱ型膠原及蛋白多糖的分解增加、合成減少。Neumann等[18]發現BMP-2具有促進關節軟骨前體細胞軟骨特異性基因表達，而不增加Ⅹ型膠原合成的作用。軟骨終板及髓核被認為是類軟骨樣組織，因此BMP-2目前作為一種治療椎間盤退變行疾病的細胞因子而被廣泛研究。既往研究表明，BMP-2轉染細胞后Id1基因在早期表達增加[19]。但目前Id1基因表達變化對于BMP-2促進椎間盤軟骨終板細胞合成Ⅱ型膠原及蛋白多糖的影響尚未明確。本實驗采用高表達Id1基因和RNAi Id1基因慢病毒分別與BMP-2慢病毒共同轉染椎間盤終板軟骨細胞后發現，與BMP-2慢病毒單獨轉染比較，BMP-2慢病毒與高表達Id1基因慢病毒共轉染能夠顯著增加Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，表明Id1能夠增強BMP-2促進軟骨終板合成軟骨特異性基因的作用。RNAi Id1基因慢病毒抑制Id1基因表達后，軟骨終板內Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成亦隨之下降。表明共轉染能夠提高細胞因子促進軟骨特異性基因合成的效果，但BMP-2通過何種信號途徑引起椎間盤細胞軟骨特異性基因表達增加的機制尚未完全闡明，還需進一步研究。
綜上述，本研究發現Id1基因可能在BMP-2促進軟骨終板細胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成中起重要作用，但相關的機制和信號通路需進一步研究。此外，本研究尚存在一些不足，如Id1被證實與多種腫瘤的發生和轉移有關[20-22]，實驗未對Id1基因轉染軟骨終板細胞后的安全性進行評估，相關實驗還有待進一步完善。
椎間盤是人體最大的無血管組織，其營養主要經過終板滲透獲得[1]。軟骨終板對椎間盤營養供給、維持椎間盤形態以及椎間盤內細胞正常生理功能均有重要作用，Gu等[2]研究發現椎間盤營養供給減少可誘發椎間盤退變。再生治療即通過轉入基因或細胞，增加細胞外基質合成，延緩或逆轉椎間盤退變，是退變性椎間盤疾病治療的研究熱點，目前多以髓核細胞為研究對象，對椎間盤營養供應途徑中起重要作用的軟骨終板研究較少。研究發現BMP-2有促進椎間盤軟骨終板細胞合成Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的作用[3]。Ad-BMP-2轉染椎間盤軟骨終板細胞后，分化抑制因子1（inhibitor of differentiation 1，Id1）基因表達上調[4-5]。目前對于Id1基因表達變化后，對BMP-2促進椎間盤軟骨終板細胞軟骨特異性基因表達的影響尚不清楚。為此，本實驗通過慢病毒干擾兔軟骨終板細胞Id1基因表達，研究Id1基因表達變化后對BMP-2促進椎間盤終板軟骨細胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
取2～3歲新西蘭大白兔10只，雌雄各半，體質量2.5～4.0 kg，購于重慶醫科大學實驗動物中心。
BMP-2慢病毒、 Id1慢病毒、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）慢病毒（病毒滴度均為3×108 TU/mL；重慶高圣生物醫藥有限責任公司）；引物（上海生工生物工程有限公司）；FBS、DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）； PrimeSTAR?HSDNAPolymerase、RNase抑制劑、Trizol（TaKaRa公司，日本）；DEPC（Sigma公司，美國）；兔Ⅱ型膠原ELISA試劑盒、兔蛋白多糖ELISA試劑盒（Roche公司，瑞士）；Id1抗體、BMP-2抗體（Abcam公司，英國）。
電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；凝膠成像儀穩壓DNA電泳儀（Tianneng公司，美國）；梯度PCR儀（Eppendorf MG公司，德國）；微量DNA/RNA定量儀（GeneGuent Pro公司，美國）；GDS8000凝膠掃描系統（UVP公司，美國）；GS-15R低溫高速離心機（Beckman公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Tek公司，美國）。
1.2 兔椎間盤軟骨終板細胞分離及培養
取新西蘭大白兔L1、2～L6、7節段的椎間盤終板標本，置于含10%FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM/F12培養基。顯微鏡下分離軟骨終板組織，將其剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小，置于0.25%胰蛋白酶中震蕩消化30 min；以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min，移除上清液后，加入0.02%Ⅱ型膠原酶消化30 min；再以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min，移除上清液后加入0.02%Ⅱ型膠原酶消化4 h。4 h后用200目細胞篩過濾消化液，濾過液以離心半徑20 cm、800 r/ min離心5 min×2次，加入含10%FBS、青霉素100 U/ mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM/F12培養基，懸浮細胞后轉入培養瓶。待10 d左右細胞鋪滿瓶底后進行傳代，選取生長良好的第2代椎間盤軟骨終板細胞 進 行實驗。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變 化。
1.3 慢病毒轉染軟骨終板細胞效率及對細胞Id1基因表達的影響
1.3.1 實驗分組及熒光顯微鏡觀察
實驗分為4 組：A組為正常軟骨終板細胞組；B組為細胞 +20 μL GFP慢病毒轉染組；C組為細胞+20 μL高表達Id1基因慢病毒轉染組；D組為細胞+20 μL RNA干擾（RNA interference，RNAi）Id1基因慢病毒轉染組。細胞轉染步驟：取第2代椎間盤軟骨終板細胞，加入培養基懸浮細胞，調整細胞密度為3×105 個 / mL，轉移入24孔板中進行培養。培養3 d后細胞完全貼壁，加入各組對應的20 μL病毒懸液，適度混勻后，于細胞培養箱內培養。轉染72 h后采用熒光顯微鏡觀察B、C、D組轉染情況。
1.3.2 實時熒光定量PCR檢測Id1基因表達
各組轉染后3 d去除培養基，將Trizol試劑1 mL加入培養板中，按說明書步驟提取RNA備用。反轉錄體系：模板（RNA）5 μL、2×RT緩沖液10 μL、隨機六聚體引物（100 pmol/μL）1 μL、RTmix 1 μL、DEPC水3 μL；反轉錄條件：25℃、10 min，42℃、53 min，86℃、5 min。PCR反應體系：2× PCR緩沖液25 μL、Prim ers（25 pmol/μL）1 μL×2、cDNA模板2 μL、DEPC 水20.5 μL、SYBR GreenⅠ（20）0.5 μL；PCR反應條件：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，35個循環，檢測溫度72℃。以β-actin為內參照，采用2-ΔΔCt計算Id1基因相對表達量，每個樣本重復測量3次。相關基因引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。見表 1。
表1
目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences of target genes
1.3.3 Western
blot檢測Id1蛋白表達 各組轉染后3 d去除培養基，PBS洗1遍；懸浮細胞，以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min，收集細胞，PBS洗1 遍。按試劑盒說明提取蛋白。用封閉液稀釋Id1蛋白抗體（1∶1 000），內參一抗GAPDH （1∶3 000），室溫孵育1.5 h；用封閉液稀釋二抗（1∶5 000），室溫孵育1.5 h。將膠片處理后進行掃描，用UVP凝膠圖像處理系統自帶Labworks4.6軟件分析條帶灰度值。
1.4 Id1基因表達變化對BMP-2促進軟骨終板細胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖的影響
1.4.1 Western
blot檢測BMP-2慢病毒轉染椎間盤軟骨終板細胞后BMP-2蛋白表達 取第2代椎間盤軟骨終板細胞于4孔板中培養5 d后分為2組，分別為細胞+10 μL BMP-2慢病毒轉染組（A組）和正常軟骨終板細胞組（B組）。A組同上法轉染BMP-2慢病毒后3 d去除培養液，B組同時間點去除培養液；以離心半徑20 cm、800 r/min離心5 min，收集細胞，按試劑盒說明提取蛋白。用封閉液稀釋BMP-2蛋白抗體（1∶1 000），內參一抗GAPDH（1∶3 000），室溫孵育1 h；用封閉液稀釋二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。將膠片處理后進行掃描，用UVP凝膠圖像處理系統自帶Labworks4.6軟件分析條帶灰度值，檢測兩組BMP-2蛋白表達情況。
1.4.2 實時熒光定量PCR檢測BMP-2與不同慢病毒共轉染后軟骨終板細胞Ⅱ型膠原、蛋白多糖及Id1基因表達
取第2代椎間盤軟骨終板細胞于24孔板中培養5 d后分為6組：A組為細胞+10 μL GFP慢病毒轉染組，B組為細胞+10 μL BMP-2慢病毒轉染組，C組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒轉染組，D組為細胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒轉染組，E組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒轉染組，F組為細胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒轉染組。轉染后3 d，同1.3.2方法進行實時熒光定量PCR檢測，計算Ⅱ型膠原、蛋白多糖基因相對表達量。每個樣本重復測量3 次。見表 1。
1.4.3 ELISA檢測Id1基因表達變化對BMP-2促進軟骨終板細胞合成軟骨特異性蛋白的影響
取第2 代椎間盤軟骨終板細胞于24孔板中培養5 d后分為10組：A組為正常軟骨終板細胞組，B組為細胞+10 μL慢病毒轉染組，C組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒轉染組，D組為細胞+10 μL RNAi Id1基因慢病毒轉染組，E組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒組，F組為細胞 +10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL BMP-2慢病毒轉染組，G組為細胞+10 μL高表達Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒轉染組，H組為細胞 +10 μL RNAi Id1基因慢病毒+10 μL GFP慢病毒轉染組，I組為細胞+10 μL GFP慢病毒轉染組，J組為細胞 +10 μL BMP-2慢病毒轉染組。同上法細胞轉染72 h后，獲取細胞外液，按ELISA試劑盒步驟進行檢測，繪制標準曲線，計算Ⅱ型膠原和蛋白多糖濃度。
1.5 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 椎間盤軟骨終板細胞形態學觀察
兔椎間盤軟骨終板細胞于培養后5～7 d開始貼壁，10 d左右可鋪滿瓶底。原代和傳代后細胞均呈三角形或多角形。見圖 1。
圖1
原代椎間盤軟骨終板細胞培養10 d形態觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? ?2.2 慢病毒轉染軟骨終板細胞效率和對細胞Id1基因表達的影響
2.2.1 熒光顯微鏡觀察
轉染72 h后熒光顯微鏡下可見B、C、D組慢病毒均能轉染兔椎間盤終板軟骨細胞，轉染率達90%以上。見圖 2。
2.2.2 實時熒光定量PCR檢測
A、B、C、D組Id1基因相對表達量分別為1.000±0.110、0.996±0.025、2.397±0.319、0.277±0.105。與A組比較，B組GFP慢病毒轉染對Id1基因表達無明顯影響，差異無統計學意義（P＞0.05）；C組高表達Id1基因慢病毒轉染細胞后Id1基因表達顯著提高，D組RNAi Id1基因慢病毒轉染后Id1基因表達明顯降低，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
2.2.3 Western
blot檢測 A、B、C、D組Id1蛋白相對表達量分別為0.767±0.066、0.769±0.060、1.060± 0.043、0.345±0.015。與A組比較，B組GFP慢病毒轉染對Id1蛋白表達無明顯影響，差異無統計學意義（P＞0.05）；C組高表達Id1基因慢病毒轉染細胞后Id1蛋白表達顯著提高，D組RNAi Id1基因慢病毒轉染后Id1蛋白表達明顯降低，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3。
2.3 Id1表達變化對BMP-2促進軟骨終板細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達的影響
2.3.1 Western
blot檢測 BMP-2慢病毒能夠有效轉染椎間盤軟骨終板細胞，并提高BMP-2表達。A、B組BMP-2蛋白相對表達量分別為0.721±0.023、0.198±0.013，比較差異有統計學意義（t=34.946，P=0.000）。見圖 4。
2.3.2 實時熒光定量PCR檢測
與A、D組比較，B、C、E組蛋白多糖、Ⅱ型膠原、Id1基因的表達顯著提高；A、D組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。C組各基因相對表達量顯著高于B、E組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B、E組間差異無統計學意義（P＞0.05）。F組各基因表達較其余各組均明顯下調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
實時熒光定量PCR檢測各組軟骨終板細胞Ⅱ型膠原、蛋白多糖及Id1基因表達（n=3，2.3.3 ELISA檢測
與A組比較，B、I組Ⅱ型膠原、蛋白多糖表達差異無統計學意義（P＞0.05）；C、E、G、J組表達明顯增加，D、H組表達明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）；E組Ⅱ型膠原、蛋白多糖表達顯著高于C、F、G、J組，差異有統計學意義（P＜0.05）；F組兩指標表達較C、J組顯著降低，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
ELISA檢測Id1表達變化對BMP-2促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖合成的影響（n=3，3 討論
軟骨終板在椎間盤營養供給中起重要作用[6]。軟骨終板是典型透明軟骨，由細胞和基質構成。軟骨細胞和成纖維細胞是其主要細胞成分，基質主要為蛋白多糖和Ⅱ型膠原，主要由軟骨終板的細胞成分合成[7]。軟骨終板中還含有Ⅹ型膠原纖維，隨著退變和年齡增加其含量逐漸上升；Ⅹ型膠原被認為和軟骨終板的鈣化相關[8]。徐宏光等[9]研究發現隨著軟骨終板退變的加重，椎間盤退變隨之加重，表明終板退變可能引起椎間盤退變。目前也有研究認為終板損傷是引起嚴重腰痛的獨立病因[10]。椎間盤軟骨終板破壞后會引起椎間盤一系列改變，如椎間盤力學環境的改變，局部炎性介質釋放及微環境的改變。這些因素會引起椎間盤髓核基質的合成和降解失衡，更重要的是會引起椎間盤營養途徑的破壞，引起細胞數量減少[11]。椎間盤退變性疾病是臨床常見疾病，目前研究集中于通過各種方法增加髓核基質的合成，同時減少其降解。但這些方法不能從根本上恢復椎間盤營養途徑的功能，且體外實驗大都未模擬體內髓核營養缺乏的環境。通過注入細胞或增加某種基因表達來治療椎間盤退變的方法必然會引起營養物質相對匱乏，進而影響椎間盤再生的治療效果[12]。因此，維持軟骨終板的正常結構和功能，對于提高椎間盤再生治療效果具有重要意義。既往研究發現，BMP-2有促進椎間盤軟骨終板細胞合成Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的作用[3]，Ad-BMP-2轉染椎間盤終板細胞后Id1基因表達上調[4-5]。目前對于Id1基因表達變化后，對BMP-2促進椎間盤軟骨終板細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖基因表達的影響尚不清楚，因此本實驗旨在研究兩者之間的關系。
Id基因有Id1、Id2、Id3、Id4共4種亞型，為堿性螺旋環螺旋的分子，缺乏與DNA結合的結構，起到抑制細胞分化、促進細胞增殖的作用[13]。其中，對Id1基因的研究較為透徹。目前使用較多的椎間盤基因治療載體為腺相關病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒具有基因載荷大、可高效感染分裂期和非分裂期細胞、并可整合入細胞基因組的優點，是椎間盤再生治療的理想載體[14]。因此本實驗選用慢病毒為基因載體，研究Id1、BMP-2共轉染對軟骨終板細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖基因表達的影響。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，兩種慢病毒均能有效轉染椎間盤軟骨終板細胞。其中，高表達Id1基因慢病毒轉染后，椎間盤軟骨終板細胞Id1基因表達較正常軟骨終板細胞及GFP慢病毒、RNAi Id1基因慢病毒轉染細胞明顯升高，而RNAi Id1基因慢病毒轉染后細胞Id1基因表達明顯降低。Western blot結果表明，高表達Id1基因慢病毒轉染后，軟骨終板細胞Id1蛋白合成增加，RNAi Id1基因慢病毒轉染后Id1蛋白合成明顯下降。提示不同慢病毒載體轉染軟骨終板細胞能獲得穩定表達，并影響Id1的合成。
多基因聯合轉染是目前椎間盤再生治療新的研究方向，Moon等[15]以TGF-β1和IGF-1腺病毒同時轉染椎間盤細胞后發現，共轉染能夠顯著提高椎間盤細胞蛋白多糖的合成。BMP是TGF-β超家族的一種多功能細胞因子，其中BMP-2是一種被廣泛研究的細胞因子。Li等[16]的研究表明，BMP-2能夠增加鼠纖維環及移行區細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖基因的合成，同時能夠促進BMP-7基因的表達。Kim等[17]的研究發現，BMP-2能增加椎間盤細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成。椎間盤退變過程中，椎間盤細胞外基質Ⅱ型膠原及蛋白多糖的分解增加、合成減少。Neumann等[18]發現BMP-2具有促進關節軟骨前體細胞軟骨特異性基因表達，而不增加Ⅹ型膠原合成的作用。軟骨終板及髓核被認為是類軟骨樣組織，因此BMP-2目前作為一種治療椎間盤退變行疾病的細胞因子而被廣泛研究。既往研究表明，BMP-2轉染細胞后Id1基因在早期表達增加[19]。但目前Id1基因表達變化對于BMP-2促進椎間盤軟骨終板細胞合成Ⅱ型膠原及蛋白多糖的影響尚未明確。本實驗采用高表達Id1基因和RNAi Id1基因慢病毒分別與BMP-2慢病毒共同轉染椎間盤終板軟骨細胞后發現，與BMP-2慢病毒單獨轉染比較，BMP-2慢病毒與高表達Id1基因慢病毒共轉染能夠顯著增加Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，表明Id1能夠增強BMP-2促進軟骨終板合成軟骨特異性基因的作用。RNAi Id1基因慢病毒抑制Id1基因表達后，軟骨終板內Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成亦隨之下降。表明共轉染能夠提高細胞因子促進軟骨特異性基因合成的效果，但BMP-2通過何種信號途徑引起椎間盤細胞軟骨特異性基因表達增加的機制尚未完全闡明，還需進一步研究。
綜上述，本研究發現Id1基因可能在BMP-2促進軟骨終板細胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成中起重要作用，但相關的機制和信號通路需進一步研究。此外，本研究尚存在一些不足，如Id1被證實與多種腫瘤的發生和轉移有關[20-22]，實驗未對Id1基因轉染軟骨終板細胞后的安全性進行評估，相關實驗還有待進一步完善。
