引用本文： 曹杰, 王旻, 解慧琪, 魏人前. 小腸黏膜下層-蠶絲復合前交叉韌帶重建支架的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(12): 1534-1540. doi: 10.7507/1002-1892.20150328 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是維持膝關節穩定性的重要韌帶，撕裂后自我修復能力較差，多數需要通過手術重建，以恢復膝關節穩定性。目前，臨床常用的韌帶移植物包括自體肌腱、同種異體移植物和人工韌帶，但應用時存在損害人體正常組織、免疫排斥反應、潛在的疾病傳播風險以及疲勞斷裂等缺點[1-3]；此外，還存在重建后關節液滲入骨隧道影響腱-骨愈合[4-5]等問題。因此，尋找一種更理想的ACL重建移植物成為研究熱點。蠶絲是一種天然生物材料，因其彈性和強度的理想結合以及具有良好的生物相容性，成為理想的韌帶組織工程支架材料[6]。2002年，Altman等[6]研究表明蠶絲纖維能促進人BMSCs的增殖和分化，并上調韌帶相關基因的表達。之后有研究通過在蠶絲支架內添加微孔蠶絲海綿[7-8]和復合Ⅰ型膠原[9]等方法改進蠶絲支架，于動物體內重建ACL后均達到了較好效 果。
小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）是一種天然的細胞外基質衍生材料，富含Ⅰ、Ⅲ型膠原[10]，并含有VEGF、FGF、TGF、EDGF等多種細胞活性因子[11]。SIS的生物相容性好、免疫原性低[12]，體內移植后能迅速誘導細胞浸潤，刺激血管生成，使修復部位早期血管化，誘導特定部位的組織重塑[13-15]，在組織工程肌腱、軟骨、骨膜、皮膚等領域[16-20]獲得廣泛應用。
韌帶支架的早期血管化能為支架盡早提供血運，加速支架體內韌帶化過程[21-22]。據此，本實驗擬在蠶絲支架上添加能促進早期血管化的SIS，構建SIS-蠶絲復合支架，探究其生物力學性能和是否具有早期血管化能力，以及能否解決ACL重建后關節液滲入骨隧道造成腱-骨愈合不良的問題。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
28周齡雄性新西蘭大白兔20只，體質量2.5～ 3.0 kg；6周齡雄性SD大鼠30只，體質量180～200 g；均由四川大學動物實驗中心提供。
蠶絲（四川大學紡織學院）；新鮮豬小腸（成都肉聯廠）；L-DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶、人用淋巴細胞分離液（GIBCO公司，美國）；鈣黃綠素（calcein-acetoxymethylester，Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；株式會社同仁化學研究所，日本）。
液壓式伺服動靜態生物力學測試系統（Instron公司，美國）；Model X-630 型掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；CO2細胞培養箱（SANYO公司，日本）；超凈工作臺（Thermo公司，美國）；E600型熒光顯微鏡、TE2000-U型光學顯微鏡（Nikon公司，日本）；連續光譜微孔板測讀儀（Molecular Devices公司，美國）；DT9205A數字萬用表（HT公司，日本）。
1.2 支架材料制備及相關觀測
1.2.1 SIS制備
參考文獻[10]方法將新鮮豬小腸沖洗干凈，剪成15 cm左右的小段，沿長軸剖開，用紗布包繞手術刀柄，刮除小腸黏膜層、肌層、漿膜層，將獲得的黏膜下層依次經過脫脂、脫細胞、去病毒處理后冷凍，最后凍干備用。
1.2.2 蠶絲支架制備
將蠶絲纏繞固定于玻璃支架上，置于0.02 mol/L碳酸鈉溶液中，100℃水浴1.5 h，完全脫去表面絲膠蛋白[23]；最后雙蒸水沖洗10次，通風柜風干備用。脫膠后蠶絲以雙蒸水潤濕后纏繞于相距7 cm的固定針頭兩端，共纏繞40圈，將一端針頭固定，另一端針頭反方向旋轉10圈，從中間折疊扭曲制成直徑2 mm、長30 mm、具有螺旋結構的編織蠶絲束。蠶絲束兩端分別用2根2-0滌綸線以鎖邊縫合法縫合編織成長10 cm的雙股牽引線，風干，環氧乙烷滅菌備用。
1.2.3 復合支架制備
將SIS修剪成4 cm×2 cm的方形膜片，雙蒸水潤濕，包繞在蠶絲支架外圍。用5-0滑線縫合固定SIS邊緣，以維持外圍SIS形成的圓筒狀結構。再用2根2-0滌綸線鎖邊縫合復合支架兩端，作為支架牽引線。
1.2.4 支架觀察
① 大體觀察：取雙蒸水潤濕后的蠶絲支架和復合支架，觀察支架表面形態。② 生物力學性能測定：取蠶絲支架與復合支架用去離子水浸泡過夜，液壓式伺服動靜態生物力學測試系統夾具夾緊支架兩端進行單軸拉力測試。加載速度10 mm/min，每組10個標本，連續記錄并繪制載荷-位移曲線。依據載荷-位移曲線，計算最大載荷、形變量和剛度。
1.3 支架材料細胞相容性評價
1.3.1 兔BMSCs分離培養
參考文獻[24-25]方法，通過密度梯度離心獲取新西蘭大白兔原代BMSCs，用含10%FBS的L-DMEM培養基培養，細胞生長融合至90%時，以胰蛋白酶消化傳代，取第3代細胞凍存備用。
1.3.2 活死細胞染色觀察
蠶絲脫膠后按文獻[7]方法制成蠶絲海綿，以束狀鋪于6孔板孔底，作為蠶絲支架組；將SIS修剪制成直徑為16 mm 的圓片置于6孔板孔底，其上再鋪蠶絲海綿，作為復合支架組。每組設3個復孔，環氧乙烷滅菌。取培養的第3代兔BMSCs，以 1×105個/孔密度分別接種于兩組材料上，在含10%FBS的L-DMEM 培養基中培養；分別于接種后1、5 d吸出培養基，PBS洗2遍，加入2 mL Calcein-AM/PI溶液，室溫下避光染色30 min；PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察細胞形態及生長黏附情況，細胞綠染為活細胞，紅染為死細胞。
1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖活力
支架材料浸提液制備：根據GB/T16886.12標準規定的浸提比例（0.2 g/mL）[19]，將蠶絲支架、復合支架滅菌后浸泡于L-DMEM培養基中，37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中浸提24 h，按照10%比例添加FBS制得蠶絲支架與復合支架浸提液。
取第3代兔BMSCs以2×103個/孔密度接種于96孔板中，于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養4 h，使細胞充分貼壁，棄原液。將細胞分別采用蠶絲支架浸提液（A組）、復合支架浸提液（B組）及正常細胞培養液（C組）培養，于0、1、3、5、7、9 d后每孔加110 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中孵育3 h，采用酶標儀于450 nm波長下測量吸光度（A）值，并繪制細胞生長曲線。
1.4 支架材料組織相容性評價
將30只SD大鼠隨機分為蠶絲支架組（S組）和復合支架組（SS組），每組15只。大鼠以腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后背部去毛，無菌條件下于背部正中作縱切口，深至皮下筋膜層，向兩邊鈍性分離皮下組織；切口兩側各植入2個1 cm長支架材料，縫合皮膚，正常分籠飼養。術后2、4、8 周每組各處死5只大鼠，取材行 HE染色觀察材料組織相容性。每張切片于高倍鏡（×400）下選取5個視野，計數各時間點炎性細胞（細胞核大、藍染）和新生血管，并觀察材料中SIS的降解情況。
1.5 支架材料減緩脛骨隧道關節液滲入能力評價
1.5.1 兔膝關節重建模型制備
取20只新西蘭大白兔，每只均行雙側后肢ACL重建，左后肢為蠶絲支架重建組（S組），右后肢為復合支架重建組（SS組）。兔以耳緣靜脈注射3%戊巴比妥（1.5 mL/kg）麻醉，雙膝關節備皮。無菌條件下行髕骨內緣膝關節切開術，切開關節腔，切除部分髕下脂肪墊，暴露ACL，在股骨、脛骨韌帶止點處完全切除ACL，用2.0 mm鉆頭在韌帶止點處分別鉆取股骨及脛骨隧道，沿牽引線將對應移植物拉入骨隧道，移植物末端用松質骨螺釘固定，屈曲30°拉緊移植物，擰緊兩端螺釘。關節腔沖洗后逐層縫合，關閉切口。在ACL重建模型完成后即刻，于脛骨平臺下1 cm處，在脛骨隧道前內側作大小為1.0 cm×0.5 cm的骨窗，顯露移植物，分別取10只動物用于電解液灌注后移植物電阻值測定和墨水灌注滲出時間測定。
1.5.2 電解液灌注后移植物電阻值測定
參照文獻[26]方法，用生理鹽水浸泡新鮮制備的蠶絲支架與復合支架1 min 后，用電阻儀分別測量兩組支架上1 cm距離的電阻值，定為初始電阻。再將測量后的蠶絲支架與復合支架浸泡于10%NaCl溶液中1 min，再次測量電阻值，定為飽和電阻。將兔膝關節ACL重建模型固定于鐵架臺上，保持脛骨關節面與地面平行。將電阻儀正極置于骨窗最上端移植物表面，負極置于相距1 cm的下端移植物表面。向關節腔內緩慢注入10%NaCl溶液5 mL，于停止注射后0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 min測量電阻值。每個時間點完成測量后均屈伸膝關節3 次，每個時間點測量3次，取均值，并繪制電阻-時間曲線 圖。
1.5.3 墨水灌注滲出時間觀察
在500 mL生理鹽水中注入5 mL碳素墨水，高溫高壓消毒，制成黑色生理鹽水染液。兔膝關節ACL重建模型建立后，向兔關節腔內緩慢注入5 mL黑色生理鹽水染液，每隔5 min屈伸膝關節3次。用相機錄像模式記錄滲出過程，觀察墨水從骨窗開始滲出時間及流注時間（滲出結束時間點），并計算兩者時間差（滲出持續時 間）。
1.6 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料相關觀測
2.1.1 大體觀察
蠶絲支架為雙股蠶絲束螺旋纏繞而成；復合支架內為雙股螺旋蠶絲束，外圍膜狀SIS呈圓筒狀包繞。見圖 1。
圖1
支架材料大體觀察 ? 蠶絲支架 ? 復合支架 ? ?2.1.2 生物力學性能測定
蠶絲支架和復合支架的最大載荷分別為（138.62±11.41）、（137.05±16.95） N，剛度分別為（24.65±2.62）、（24.21±2.39）N/mm，形變量分別為9.40、10.67，比較差異均無統計學意義（t=0.242，P=0.814；t=0.381，P=0.702；Z=0.493，P=0.622）。
2.2 支架材料細胞相容性評價
2.2.1 活死細胞染色觀察
熒光顯微鏡觀察示，蠶絲支架與復合支架上細胞以綠染的活細胞為主，紅染死細胞極少，且活細胞形態良好，外形輪廓清晰；隨著時間推移，兩種支架材料上的活細胞密度逐漸增大，其中復合支架上BMSCs伸展性更好，細胞通過偽足相互連接成網狀。見圖 2。
2.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力
3組A值均隨培養時間延長而升高，呈時間依賴性。各時間點A、B、C組A值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 3。
2.3 支架材料組織相容性評價
HE染色示，術后2周，SS組外圍SIS降解不明顯，4周時明顯降解，8周時SIS降解完全。術后2、4、8周，兩組均可見炎性細胞浸潤，且隨時間延長，浸潤程度均呈逐漸減輕趨勢；各時間點SS組炎性細胞數均少于S組，差異有統計學意義（P＜0.05）。
SS組術后2周新生血管極少，4周支架外緣可見較多新生血管形成，8周支架中間部分出現較多新生血管；而S組術后各時間點均未見明顯新生血管。術后各時間點兩組新生血管數比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4及表 1。
表1
術后各時間點兩組炎性細胞數及新生血管數比較（n=5，2.4 支架材料減緩脛骨隧道關節液滲入能力評價
2.4.1 電解液灌注后移植物電阻值測定
S組和SS組初始電阻值分別為（4 355.6±689.4）Ω和（3 466.7±412.3）Ω，飽和電阻值分別為（2 233.0± 193.6） Ω和（2 200.0 ± 327.9）Ω。
10%NaCl灌注后0 ～20 min內兩組電阻值均未發生變化，20 min后S組電阻值急劇下降，至40 min時下降至（2 233.0 ± 227.1） Ω后達到平衡。而SS組于40 min后電阻值開始降低，下降較緩慢，80 min后降至（2 200.0±232.7） Ω，達到平衡。S組電阻值開始下降時間點為（20±3）min，SS組為（40±4）min，差異有統計學意義（t= -2.821，P=0.018）。SS組電阻值擬合曲線的斜率明顯小于S組，差異有統計學意義（Z= -2.403，P=0.016）。見圖 5。
圖5
膝關節ACL重建后兩組移植物電阻值變化曲線圖
Figure5.
Curve graph of the electric resistance of the scaffold after ACL reconstruction
2.4.2 墨水灌注滲出時間觀察
SS組墨水灌注滲出時間及流注時間均較S組明顯延遲，時間差明顯大于S組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
ACL重建術中S組與SS組墨水滲漏情況比較（n=10，s，3 討論
為解決自體、同種異體以及人工韌帶材料臨床應用時存在的一些不足，組織工程韌帶支架材料成為當前ACL重建支架研究的熱點。在移植早期，新生韌帶組織尚不具有相應力學性能時，需要移植物提供足夠的力學支撐以保證膝關節穩定性，因此韌帶組織工程支架要求材料的力學強度、彈性、硬度以及整體結構性優化結合[27]。基于以上考慮，本研究添加了易于編織且生物力學性能優異的脫膠蠶絲，通過螺旋結構的編織方法制備了最大載荷達（137.05±16.95）N、剛度達（24.21±2.39）N/mm的復合支架。結合文獻報道[7, 28]的兔ACL破壞力約為40 N（兔體質量按2.5～3.0 kg計算），提示本研究體外構建的復合支架可在ACL重建早期提供足夠的力學強度；同時蠶絲在體內降解慢[9, 29]，能夠在移植后較長一段時間內提供合適的力學強度。本研究構建的復合支架可滿足兔ACL重建的力學要求，為動物實驗奠定了基礎。
韌帶移植物體內移植后主要經過移植物壞死降解、再細胞化及再血管化、組織重塑等過程[30]。在早期移植物未血管化之前，移植物壞死降解后，生物力學性能會迅速下降，因此移植早期支架血管化對于ACL重建至關重要[22]。支架早期血管化能促進支架內BMSCs、成纖維細胞等細胞的修復活動，加快后期體內韌帶化過程[21-31]。本研究選擇了移植后能促細胞化、血管化的SIS包繞蠶絲支架，以期使移植后支架表面能早期再血管化。這種設計模擬了正常韌帶表面滑膜血管提供韌帶血運的結構。本研究細胞增殖曲線及活死細胞染色結果表明，復合支架更有利于細胞黏附、增殖。同時皮下植入結果表明，術后各時間點復合支架的新生血管明顯多于蠶絲支架，且復合支架從邊緣到內部逐漸達到了血管化。
臨床研究發現[32]，ACL重建后早期關節液中多種細胞因子水平升高，如基質金屬蛋白酶、金屬蛋白酶組織抑制劑、TNF-α和低密度白介素受體拮抗劑等，這些細胞因子使移植組織壞死范圍擴大，影響移植物再血管化。也有研究[33]發現無關節滑液環境下的腱-骨愈合明顯優于有關節滑液環境，說明關節滑液不利于ACL重建后腱-骨愈合。為減少關節滑液滲入骨隧道，臨床ACL重建多采用保留殘跡法[34]，本研究擬通過SIS包裹蠶絲構建的復合支架重建ACL，減少關節液滲入骨隧道。通過導電性能差別較大的兩種不同電解質液對兩種狀態進行模擬定量，分別作滲漏狀態下的初始電阻值以及滲液飽和狀態下的電阻值，結果提示關節液滲漏過程的電阻值介于2 200.0～4 355.6 Ω之間，可認為滲出越多，支架體內重建后的電阻值越接近2 200.0 Ω。同時本研究模擬了關節液滲漏的極限狀態，即在兔活體ACL重建后，關節內注射5 mL液體，使膝關節完全充盈后立即進行測試，并在測試過程中不斷進行膝關節完全屈伸運動。通過電阻值變化與墨水滲出時間兩個指標發現同一趨勢：在極限狀態下，蠶絲支架與復合支架重建兔ACL后，均有關節液滲入，但復合支架組關節液滲入脛骨隧道時間較蠶絲支架組明顯推遲。
綜上述，本研究制備的SIS-蠶絲復合支架具有良好的生物力學性能、細胞相容性與組織相容性，并能減緩兔ACL重建后關節液滲入脛骨隧道，有望成為一種良好的ACL重建材料。
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是維持膝關節穩定性的重要韌帶，撕裂后自我修復能力較差，多數需要通過手術重建，以恢復膝關節穩定性。目前，臨床常用的韌帶移植物包括自體肌腱、同種異體移植物和人工韌帶，但應用時存在損害人體正常組織、免疫排斥反應、潛在的疾病傳播風險以及疲勞斷裂等缺點[1-3]；此外，還存在重建后關節液滲入骨隧道影響腱-骨愈合[4-5]等問題。因此，尋找一種更理想的ACL重建移植物成為研究熱點。蠶絲是一種天然生物材料，因其彈性和強度的理想結合以及具有良好的生物相容性，成為理想的韌帶組織工程支架材料[6]。2002年，Altman等[6]研究表明蠶絲纖維能促進人BMSCs的增殖和分化，并上調韌帶相關基因的表達。之后有研究通過在蠶絲支架內添加微孔蠶絲海綿[7-8]和復合Ⅰ型膠原[9]等方法改進蠶絲支架，于動物體內重建ACL后均達到了較好效 果。
小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）是一種天然的細胞外基質衍生材料，富含Ⅰ、Ⅲ型膠原[10]，并含有VEGF、FGF、TGF、EDGF等多種細胞活性因子[11]。SIS的生物相容性好、免疫原性低[12]，體內移植后能迅速誘導細胞浸潤，刺激血管生成，使修復部位早期血管化，誘導特定部位的組織重塑[13-15]，在組織工程肌腱、軟骨、骨膜、皮膚等領域[16-20]獲得廣泛應用。
韌帶支架的早期血管化能為支架盡早提供血運，加速支架體內韌帶化過程[21-22]。據此，本實驗擬在蠶絲支架上添加能促進早期血管化的SIS，構建SIS-蠶絲復合支架，探究其生物力學性能和是否具有早期血管化能力，以及能否解決ACL重建后關節液滲入骨隧道造成腱-骨愈合不良的問題。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
28周齡雄性新西蘭大白兔20只，體質量2.5～ 3.0 kg；6周齡雄性SD大鼠30只，體質量180～200 g；均由四川大學動物實驗中心提供。
蠶絲（四川大學紡織學院）；新鮮豬小腸（成都肉聯廠）；L-DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶、人用淋巴細胞分離液（GIBCO公司，美國）；鈣黃綠素（calcein-acetoxymethylester，Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Sigma公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；株式會社同仁化學研究所，日本）。
液壓式伺服動靜態生物力學測試系統（Instron公司，美國）；Model X-630 型掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；CO2細胞培養箱（SANYO公司，日本）；超凈工作臺（Thermo公司，美國）；E600型熒光顯微鏡、TE2000-U型光學顯微鏡（Nikon公司，日本）；連續光譜微孔板測讀儀（Molecular Devices公司，美國）；DT9205A數字萬用表（HT公司，日本）。
1.2 支架材料制備及相關觀測
1.2.1 SIS制備
參考文獻[10]方法將新鮮豬小腸沖洗干凈，剪成15 cm左右的小段，沿長軸剖開，用紗布包繞手術刀柄，刮除小腸黏膜層、肌層、漿膜層，將獲得的黏膜下層依次經過脫脂、脫細胞、去病毒處理后冷凍，最后凍干備用。
1.2.2 蠶絲支架制備
將蠶絲纏繞固定于玻璃支架上，置于0.02 mol/L碳酸鈉溶液中，100℃水浴1.5 h，完全脫去表面絲膠蛋白[23]；最后雙蒸水沖洗10次，通風柜風干備用。脫膠后蠶絲以雙蒸水潤濕后纏繞于相距7 cm的固定針頭兩端，共纏繞40圈，將一端針頭固定，另一端針頭反方向旋轉10圈，從中間折疊扭曲制成直徑2 mm、長30 mm、具有螺旋結構的編織蠶絲束。蠶絲束兩端分別用2根2-0滌綸線以鎖邊縫合法縫合編織成長10 cm的雙股牽引線，風干，環氧乙烷滅菌備用。
1.2.3 復合支架制備
將SIS修剪成4 cm×2 cm的方形膜片，雙蒸水潤濕，包繞在蠶絲支架外圍。用5-0滑線縫合固定SIS邊緣，以維持外圍SIS形成的圓筒狀結構。再用2根2-0滌綸線鎖邊縫合復合支架兩端，作為支架牽引線。
1.2.4 支架觀察
① 大體觀察：取雙蒸水潤濕后的蠶絲支架和復合支架，觀察支架表面形態。② 生物力學性能測定：取蠶絲支架與復合支架用去離子水浸泡過夜，液壓式伺服動靜態生物力學測試系統夾具夾緊支架兩端進行單軸拉力測試。加載速度10 mm/min，每組10個標本，連續記錄并繪制載荷-位移曲線。依據載荷-位移曲線，計算最大載荷、形變量和剛度。
1.3 支架材料細胞相容性評價
1.3.1 兔BMSCs分離培養
參考文獻[24-25]方法，通過密度梯度離心獲取新西蘭大白兔原代BMSCs，用含10%FBS的L-DMEM培養基培養，細胞生長融合至90%時，以胰蛋白酶消化傳代，取第3代細胞凍存備用。
1.3.2 活死細胞染色觀察
蠶絲脫膠后按文獻[7]方法制成蠶絲海綿，以束狀鋪于6孔板孔底，作為蠶絲支架組；將SIS修剪制成直徑為16 mm 的圓片置于6孔板孔底，其上再鋪蠶絲海綿，作為復合支架組。每組設3個復孔，環氧乙烷滅菌。取培養的第3代兔BMSCs，以 1×105個/孔密度分別接種于兩組材料上，在含10%FBS的L-DMEM 培養基中培養；分別于接種后1、5 d吸出培養基，PBS洗2遍，加入2 mL Calcein-AM/PI溶液，室溫下避光染色30 min；PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察細胞形態及生長黏附情況，細胞綠染為活細胞，紅染為死細胞。
1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖活力
支架材料浸提液制備：根據GB/T16886.12標準規定的浸提比例（0.2 g/mL）[19]，將蠶絲支架、復合支架滅菌后浸泡于L-DMEM培養基中，37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中浸提24 h，按照10%比例添加FBS制得蠶絲支架與復合支架浸提液。
取第3代兔BMSCs以2×103個/孔密度接種于96孔板中，于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中培養4 h，使細胞充分貼壁，棄原液。將細胞分別采用蠶絲支架浸提液（A組）、復合支架浸提液（B組）及正常細胞培養液（C組）培養，于0、1、3、5、7、9 d后每孔加110 μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱中孵育3 h，采用酶標儀于450 nm波長下測量吸光度（A）值，并繪制細胞生長曲線。
1.4 支架材料組織相容性評價
將30只SD大鼠隨機分為蠶絲支架組（S組）和復合支架組（SS組），每組15只。大鼠以腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后背部去毛，無菌條件下于背部正中作縱切口，深至皮下筋膜層，向兩邊鈍性分離皮下組織；切口兩側各植入2個1 cm長支架材料，縫合皮膚，正常分籠飼養。術后2、4、8 周每組各處死5只大鼠，取材行 HE染色觀察材料組織相容性。每張切片于高倍鏡（×400）下選取5個視野，計數各時間點炎性細胞（細胞核大、藍染）和新生血管，并觀察材料中SIS的降解情況。
1.5 支架材料減緩脛骨隧道關節液滲入能力評價
1.5.1 兔膝關節重建模型制備
取20只新西蘭大白兔，每只均行雙側后肢ACL重建，左后肢為蠶絲支架重建組（S組），右后肢為復合支架重建組（SS組）。兔以耳緣靜脈注射3%戊巴比妥（1.5 mL/kg）麻醉，雙膝關節備皮。無菌條件下行髕骨內緣膝關節切開術，切開關節腔，切除部分髕下脂肪墊，暴露ACL，在股骨、脛骨韌帶止點處完全切除ACL，用2.0 mm鉆頭在韌帶止點處分別鉆取股骨及脛骨隧道，沿牽引線將對應移植物拉入骨隧道，移植物末端用松質骨螺釘固定，屈曲30°拉緊移植物，擰緊兩端螺釘。關節腔沖洗后逐層縫合，關閉切口。在ACL重建模型完成后即刻，于脛骨平臺下1 cm處，在脛骨隧道前內側作大小為1.0 cm×0.5 cm的骨窗，顯露移植物，分別取10只動物用于電解液灌注后移植物電阻值測定和墨水灌注滲出時間測定。
1.5.2 電解液灌注后移植物電阻值測定
參照文獻[26]方法，用生理鹽水浸泡新鮮制備的蠶絲支架與復合支架1 min 后，用電阻儀分別測量兩組支架上1 cm距離的電阻值，定為初始電阻。再將測量后的蠶絲支架與復合支架浸泡于10%NaCl溶液中1 min，再次測量電阻值，定為飽和電阻。將兔膝關節ACL重建模型固定于鐵架臺上，保持脛骨關節面與地面平行。將電阻儀正極置于骨窗最上端移植物表面，負極置于相距1 cm的下端移植物表面。向關節腔內緩慢注入10%NaCl溶液5 mL，于停止注射后0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90 min測量電阻值。每個時間點完成測量后均屈伸膝關節3 次，每個時間點測量3次，取均值，并繪制電阻-時間曲線 圖。
1.5.3 墨水灌注滲出時間觀察
在500 mL生理鹽水中注入5 mL碳素墨水，高溫高壓消毒，制成黑色生理鹽水染液。兔膝關節ACL重建模型建立后，向兔關節腔內緩慢注入5 mL黑色生理鹽水染液，每隔5 min屈伸膝關節3次。用相機錄像模式記錄滲出過程，觀察墨水從骨窗開始滲出時間及流注時間（滲出結束時間點），并計算兩者時間差（滲出持續時 間）。
1.6 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料相關觀測
2.1.1 大體觀察
蠶絲支架為雙股蠶絲束螺旋纏繞而成；復合支架內為雙股螺旋蠶絲束，外圍膜狀SIS呈圓筒狀包繞。見圖 1。
圖1
支架材料大體觀察 ? 蠶絲支架 ? 復合支架 ? ?2.1.2 生物力學性能測定
蠶絲支架和復合支架的最大載荷分別為（138.62±11.41）、（137.05±16.95） N，剛度分別為（24.65±2.62）、（24.21±2.39）N/mm，形變量分別為9.40、10.67，比較差異均無統計學意義（t=0.242，P=0.814；t=0.381，P=0.702；Z=0.493，P=0.622）。
2.2 支架材料細胞相容性評價
2.2.1 活死細胞染色觀察
熒光顯微鏡觀察示，蠶絲支架與復合支架上細胞以綠染的活細胞為主，紅染死細胞極少，且活細胞形態良好，外形輪廓清晰；隨著時間推移，兩種支架材料上的活細胞密度逐漸增大，其中復合支架上BMSCs伸展性更好，細胞通過偽足相互連接成網狀。見圖 2。
2.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力
3組A值均隨培養時間延長而升高，呈時間依賴性。各時間點A、B、C組A值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖 3。
2.3 支架材料組織相容性評價
HE染色示，術后2周，SS組外圍SIS降解不明顯，4周時明顯降解，8周時SIS降解完全。術后2、4、8周，兩組均可見炎性細胞浸潤，且隨時間延長，浸潤程度均呈逐漸減輕趨勢；各時間點SS組炎性細胞數均少于S組，差異有統計學意義（P＜0.05）。
SS組術后2周新生血管極少，4周支架外緣可見較多新生血管形成，8周支架中間部分出現較多新生血管；而S組術后各時間點均未見明顯新生血管。術后各時間點兩組新生血管數比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4及表 1。
表1
術后各時間點兩組炎性細胞數及新生血管數比較（n=5，2.4 支架材料減緩脛骨隧道關節液滲入能力評價
2.4.1 電解液灌注后移植物電阻值測定
S組和SS組初始電阻值分別為（4 355.6±689.4）Ω和（3 466.7±412.3）Ω，飽和電阻值分別為（2 233.0± 193.6） Ω和（2 200.0 ± 327.9）Ω。
10%NaCl灌注后0 ～20 min內兩組電阻值均未發生變化，20 min后S組電阻值急劇下降，至40 min時下降至（2 233.0 ± 227.1） Ω后達到平衡。而SS組于40 min后電阻值開始降低，下降較緩慢，80 min后降至（2 200.0±232.7） Ω，達到平衡。S組電阻值開始下降時間點為（20±3）min，SS組為（40±4）min，差異有統計學意義（t= -2.821，P=0.018）。SS組電阻值擬合曲線的斜率明顯小于S組，差異有統計學意義（Z= -2.403，P=0.016）。見圖 5。
圖5
膝關節ACL重建后兩組移植物電阻值變化曲線圖
Figure5.
Curve graph of the electric resistance of the scaffold after ACL reconstruction
2.4.2 墨水灌注滲出時間觀察
SS組墨水灌注滲出時間及流注時間均較S組明顯延遲，時間差明顯大于S組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
ACL重建術中S組與SS組墨水滲漏情況比較（n=10，s，3 討論
為解決自體、同種異體以及人工韌帶材料臨床應用時存在的一些不足，組織工程韌帶支架材料成為當前ACL重建支架研究的熱點。在移植早期，新生韌帶組織尚不具有相應力學性能時，需要移植物提供足夠的力學支撐以保證膝關節穩定性，因此韌帶組織工程支架要求材料的力學強度、彈性、硬度以及整體結構性優化結合[27]。基于以上考慮，本研究添加了易于編織且生物力學性能優異的脫膠蠶絲，通過螺旋結構的編織方法制備了最大載荷達（137.05±16.95）N、剛度達（24.21±2.39）N/mm的復合支架。結合文獻報道[7, 28]的兔ACL破壞力約為40 N（兔體質量按2.5～3.0 kg計算），提示本研究體外構建的復合支架可在ACL重建早期提供足夠的力學強度；同時蠶絲在體內降解慢[9, 29]，能夠在移植后較長一段時間內提供合適的力學強度。本研究構建的復合支架可滿足兔ACL重建的力學要求，為動物實驗奠定了基礎。
韌帶移植物體內移植后主要經過移植物壞死降解、再細胞化及再血管化、組織重塑等過程[30]。在早期移植物未血管化之前，移植物壞死降解后，生物力學性能會迅速下降，因此移植早期支架血管化對于ACL重建至關重要[22]。支架早期血管化能促進支架內BMSCs、成纖維細胞等細胞的修復活動，加快后期體內韌帶化過程[21-31]。本研究選擇了移植后能促細胞化、血管化的SIS包繞蠶絲支架，以期使移植后支架表面能早期再血管化。這種設計模擬了正常韌帶表面滑膜血管提供韌帶血運的結構。本研究細胞增殖曲線及活死細胞染色結果表明，復合支架更有利于細胞黏附、增殖。同時皮下植入結果表明，術后各時間點復合支架的新生血管明顯多于蠶絲支架，且復合支架從邊緣到內部逐漸達到了血管化。
臨床研究發現[32]，ACL重建后早期關節液中多種細胞因子水平升高，如基質金屬蛋白酶、金屬蛋白酶組織抑制劑、TNF-α和低密度白介素受體拮抗劑等，這些細胞因子使移植組織壞死范圍擴大，影響移植物再血管化。也有研究[33]發現無關節滑液環境下的腱-骨愈合明顯優于有關節滑液環境，說明關節滑液不利于ACL重建后腱-骨愈合。為減少關節滑液滲入骨隧道，臨床ACL重建多采用保留殘跡法[34]，本研究擬通過SIS包裹蠶絲構建的復合支架重建ACL，減少關節液滲入骨隧道。通過導電性能差別較大的兩種不同電解質液對兩種狀態進行模擬定量，分別作滲漏狀態下的初始電阻值以及滲液飽和狀態下的電阻值，結果提示關節液滲漏過程的電阻值介于2 200.0～4 355.6 Ω之間，可認為滲出越多，支架體內重建后的電阻值越接近2 200.0 Ω。同時本研究模擬了關節液滲漏的極限狀態，即在兔活體ACL重建后，關節內注射5 mL液體，使膝關節完全充盈后立即進行測試，并在測試過程中不斷進行膝關節完全屈伸運動。通過電阻值變化與墨水滲出時間兩個指標發現同一趨勢：在極限狀態下，蠶絲支架與復合支架重建兔ACL后，均有關節液滲入，但復合支架組關節液滲入脛骨隧道時間較蠶絲支架組明顯推遲。
綜上述，本研究制備的SIS-蠶絲復合支架具有良好的生物力學性能、細胞相容性與組織相容性，并能減緩兔ACL重建后關節液滲入脛骨隧道，有望成為一種良好的ACL重建材料。
