引用本文： 王方永, 袁媛, 李建軍. 利用一級神經元重建完全性脊髓損傷大鼠后肢運動功能的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(12): 1528-1533. doi: 10.7507/1002-1892.20150327 復制
脊髓損傷屬于中樞神經系統損傷，可造成患者終生感覺、運動以及排尿排便功能嚴重障礙[1]。既往脊髓損傷重建是建立在傳統“二級神經元”模式基礎上，即大腦皮質運動神經元必須經過脊髓前角細胞換元后才能支配靶器官。Brunelli等[2]認為，將外周神經移植至中樞神經系統后，由于外周神經系統內神經管的作用，其軸突可以再生，但是與中樞神經系統微環境接觸后，該生長作用即停止。本實驗旨在探討大腦皮質運動神經元軸突（皮質脊髓束）直接支配靶器官的可行性及可能恢復機制，以期為恢復脊髓損傷下肢運動功能提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
成年雌性SD大鼠40只，體質量300～350 g，由軍事醫學科學院動物飼養中心提供。鼠神經絲蛋白200（neurofilament 200，NF-200）單克隆抗體、兔膠質纖維酸性蛋白多克隆抗體、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；60%游離辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP；蘇州亞科化學試劑有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 橫斷型完全性脊髓損傷模型的制備
取40只大鼠制備橫斷型完全性脊髓損傷模型。具體方法：術前大鼠單籠飼養1周、禁食12 h，稱重，采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術臺上，胸腰背部剃毛備皮。根據肋骨確定椎體序列，以L1棘突為中心作背部正中縱切口，長約3 cm，切開皮膚、筋膜及皮下組織，緊貼棘突骨面縱行鈍性分離椎旁肌，直達椎板表面，剝離附著在棘突和椎板上的軟組織，顯露L1椎板和棘突，鑷子提起L1棘突，切斷L1與L2棘間韌帶，血管鉗咬除L1下關節突與部分下椎板，注意勿損傷血管和脊髓，暴露L1椎體下緣水平脊髓約5 mm長。在L1椎體下緣水平，用尖銳刀片從背側至腹側快速分層完全橫斷脊髓，以神經剝離子在腹側硬脊膜與椎管間穿出至背側，同時造成約2 mm長脊髓缺損，并填充明膠海綿至缺損處，確認完全橫斷。動物脊髓橫斷后即刻出現擺尾、雙下肢抽搐或尿失禁等現象，提示模型制備成功。壓迫止血后，生理鹽水棉球擦洗，逐層縫合切口。
1.2.2 動物模型分組及處理
模型制備2周后，將大鼠隨機分為實驗組及對照組（n=20）。實驗組行右后肢一級神經元直接重建手術（即周圍神經直接連接中樞神經）。見圖 1。大鼠術前處理、麻醉及體位與模型制備手術一致。沿原切口入路，切開皮膚、筋膜及皮下組織，緊貼棘突骨面縱行鈍性分離椎旁肌，直達T12、13椎板表面，剝離附著在棘突和椎板上的軟組織，顯露T12、13椎板和棘突，血管鉗咬除2個節段全部椎板，注意避免損傷血管和脊髓，暴露T12、13水平脊髓約15 mm長，備用。
圖1
一級神經元直接重建手術設計示意圖 ? ?確定大鼠右側髂前上棘位置，在髂前上棘后下5 mm處，沿髂嵴向后作長約5 mm縱切口，神經根拉鉤鈍性分離肌肉，直達股神經，盡可能保留股神經長度，切斷股神經近端備用。確定大鼠右側髂后上棘位置，在髂后上棘與脊柱棘突之間作長約3 mm縱切口，神經根拉鉤鈍性分離肌肉，直達坐骨神經，盡可能保留坐骨神經長度，切斷坐骨神經近端備用。確定大鼠右后肢膝部，在膝后作長3 mm縱切口，神經根拉鉤鈍性分離肌肉，直達脛神經，盡可能保留脛神經長度，切斷其遠端，神經根拉鉤鈍性分離坐骨神經與脛神經走行段肌肉，取出坐骨神經與脛神經連接段神經，置于生理鹽水中備用。
在已暴露的T12、13脊髓中段，于脊髓側索右側部作2 mm深切口，用顯微剪將坐骨神經近端處理為一斜行平面，插入切口中，切面平對脊髓近端，深度約1.5 mm[3]，11-0縫線固定坐骨神經外膜和硬脊膜。將坐骨神經遠端穿行于脊柱兩旁肌肉組織內，縫合脛神經遠端與股神經近端，11-0縫線固定脛神經與股神經外膜。壓迫止血后，生理鹽水棉球擦洗，逐層縫合切口，術畢歸籠。飼養環境溫度控制在20～25℃，定期通風；注意更換飼養籠墊料，保持干燥。造模后常規背部注射青霉素（160萬U/kg）3 d預防感染，若停藥后再次出現感染征象，立即恢復抗生素治療，直至癥狀消失。注意清潔因尿失禁而浸濕的肢體，以減少壓瘡的發生。每天按摩、擠壓膀胱協助排尿3～4次，注意手法輕柔，避免膀胱破裂；輕揉腹部及雙后肢2次，預防腸梗阻和壓瘡的發生；右后肢被動活動2次，避免引起關節攣縮，影響行為學觀察。
對照組除將坐骨神經遠端穿行于脊柱兩旁肌肉組織內后，不縫合脛神經遠端與股神經近端外，其余處理同實驗組。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察大鼠術后存活及肢體活動恢復情況。
1.3.2 后肢運動功能評分
術后7、30、50、70 d兩組分別取6只大鼠，采用BBB評分[4]評價大鼠雙側后肢運動功能恢復情況。
1.3.3 組織學觀察
組織學及免疫組織化學染色主要觀察脊髓局部病理變化及周圍神經與脊髓物理連接情況，因實驗組和對照組在脊髓周圍神經連接操作無差異，故僅實驗組取材進行觀察。術后70 d實驗組取4只大鼠，同上法麻醉后固定于取材臺上，剪開心尖部插入灌流針至主動脈，剪開心耳，先灌注37℃生理鹽水至組織器官變白，灌注量200 mL；再灌注4%多聚甲醛（低速灌注），灌注期間可見大鼠四肢、尾部有痙攣現象，直至四肢及軀體僵硬。取出脊髓重建部位上、下1 cm的脊髓節段，置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定，常規石蠟包埋，連續背側向腹側冠狀位縱切片，片厚8 μm，HE染色。鏡下觀察周圍神經與脊髓連接情況及局部脊髓病理改變。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
術后70 d實驗組取4只大鼠，同1.3.3方法取材并切片，行NF-200免疫組織化學染色。采用計算機顯像系統觀察，以褐色為陽性染色。
1.3.5 HRP逆行示蹤標記染色觀察
術后70 d兩組各取4只大鼠進行HRP逆行示蹤標記神經元，觀察局部脊髓變化。具體操作：術前處理及麻醉方法同動物模型制備。沿膝關節上方作正中縱切口，長約1 cm，分離皮膚、筋膜及皮下組織，直達肌肉。沿股四頭肌多點注射60%HRP混懸液，每點注射20 μL，每次注射時間為5 min，留針10 min，逐層縫合關閉切口。HRP注射后48 h灌注取材，將標本置于4%多聚甲醛2 h，然后置于20%蔗糖磷酸鹽緩沖液中過夜。采用蛋白明膠包埋，冰凍切片機切片，連續背側向腹側冠狀位縱切片，片厚40 μm，進行四甲基聯苯胺染色。經計算機顯像系統觀察，以藍色為陽性染色。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
飼養期間共6只大鼠死亡，4只死于腸梗阻，2 只死于尿路感染引起的尿道阻塞。1只大鼠出現自噬尾部現象，1只出現脊髓手術部位感染跡象，3 只在灌注取材時發現脊髓重建部位出現神經脫離脊髓現象（2只）及坐骨神經萎縮明顯（1只），考慮為手術縫合連接失敗、術后協助排尿或關節活動時護理不當致縫合處分離所致。上述大鼠均排除實驗，并給予對應補充。
模型制備術后兩組大鼠活動及飲食較術前無顯著變化；兩前肢可爬行，術側后肢與對側相比，無明顯關節活動。重建術后兩組大鼠無壓瘡發生，均存在腹脹、尿潴留、大便困難伴硬結、尿混濁等現象。
2.2 后肢運動功能評分
術后兩組大鼠右后肢均未見關節攣縮，但運動功能無明顯恢復，各時間點BBB評分均為0分。左后肢運動功能均有不同程度恢復，各時間點對照組和實驗組BBB評分比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
兩組術后各時間點左后肢BBB評分（n=6，2.3 組織學觀察
實驗組鏡下可見脊髓重建部位坐骨神經嵌入脊髓中，坐骨神經束膜顯示清楚，連接部位脊髓無明顯萎縮，但有部分空洞形成（圖 2）。
2.4 免疫組織化學染色觀察
實驗組鏡下可見脊髓重建部位周圍神經內神經元軸突呈陽性染色，且周圍神經與脊髓已形成聯系（圖 3）。
2.5 HRP逆行示蹤標記染色觀察
實驗組脊髓重建部位頭端可見束狀藍色標記，即為HRP逆行示蹤劑神經元軸突顯色；4只大鼠標本著色部位、密度均無明顯差異。而對照組脊髓重建部位頭端均未出現HRP染色。 見圖 4。
3 討論
3.1 一級神經元直接重建對大鼠運動功能恢復的影響
皮質脊髓束是哺乳動物脊髓內的主要下行運動性傳導束，其纖維直接或間接通過中間神經元支配脊髓前角細胞，從而控制骨骼肌的隨意運動。脊髓損傷因破壞了皮質脊髓束，損傷平面以下仍存活的脊髓前角細胞失去了大腦的神經支配，不能進行隨意性功能活動。患者肢體功能的恢復很大程度上取決于皮質脊髓束的再生，及其與脊髓前角運動神經元直接或間接的功能性重建。因此，恢復脊髓傳導束功能，尤其恢復控制隨意運動的皮質脊髓束功能，具有重要意義[5]。
自1981 年David 和Aguayo證實皮質脊髓束可以再生以來[6]，20 多年的實驗研究為人類攻克脊髓損傷難題帶來了新的希望[7-11]。Brunelli等[12]將大鼠腓腸神經近端直接連接皮質脊髓側束，遠端與支配大鼠腹內斜肌的神經連接，2個月后發現神經肌肉接頭部位運動終板受體從膽堿類轉變成谷氨酸類。之后，他們采用顯微外科技術將1例胸脊髓損傷患者的坐骨神經進行游離并切斷作為橋接神經，近端移植至脊髓損傷頭端的皮質脊髓束區域，遠端連接支配臀大肌、臀中肌和股四頭肌的周圍神經。隨訪12個月后發現，移植神經支配的肌肉出現自主運動，而且這種運動在2～3年后得到鞏固和增強。同時他們還發現，對移植神經支配的肌肉進行選擇性收縮時，同一皮層運動區支配的其他肌肉不會產生共同運動，他們將這種適應性的神經功能稱為“單個神經元可塑性”[13]。
本實驗采用坐骨神經近端連接脊髓皮質脊髓束區，遠端連接支配股四頭肌的股神經，以期恢復截癱大鼠后肢運動功能。結果顯示，對照組和實驗組大鼠神經移植側肢體BBB評分差異無統計學意義，考慮可能與以下因素有關：① BBB評分標準為評價脊髓背側打擊所致的大鼠脊髓損傷后的恢復期運動功能變化，并非針對損傷脊髓功能重建后大鼠后肢伸膝功能的評價量表。② 文獻報道中樞-周圍神經移植術后60 d可發現運動終板受體的轉變[6]。本實驗進行了70 d的觀察，可能因時間尚短，作為靶肌肉的股四頭肌運動功能尚未得到足夠神經支配，故運動功能恢復不明顯，有待進一步增大樣本量、延長觀察時間明確。③ 未采用運動誘發電位對股四頭肌運動功能恢復程度進行評價，影響實驗結果。另外，雖然本實驗手術均在顯微鏡下操作，但因大鼠脊髓較小，操作難度大，脊髓手術區域的白質破壞明顯，影響了效果評價。因此如需進一步動物實驗，宜采用大動物模型。
3.2 一級神經元直接重建手術對軸突再生的作用
神經元是一種電信號傳導-分泌細胞，由胞體和突觸組成。各種蛋白（微管、微絲、神經遞質、神經調子、髓鞘合成蛋白等）在胞體合成，并以軸漿運輸形式使胞體和突觸建立聯系，胞體對維持軸突解剖和功能的完整性十分重要。神經元末梢的突觸傳遞是一個電-化學-電的過程，即由突觸前神經元釋放化學物質，引起突觸后神經元的生物電改變，最終引發神經功能效應。研究證明[14]，脊髓損傷后位于大腦皮質的上運動神經元失去傳入信號的反饋，輸出信號喪失或終止于脊髓損傷平面的近端，導致控制運動的神經環路中斷，使上運動神經元處于斷聯休克抑制狀態，其代謝、軸漿運輸受抑制，合成分泌神經生長因子、神經遞質等均處于抑制狀態，信號傳導、軸突再生、髓鞘形成將無法實現，是脊髓功能恢復需要克服的關鍵機制。
神經可塑性指中樞神經系統損傷后，具有從解剖和功能上修改自身，以適應變化環境的能力，包括潛伏通路的激活和突觸重組等多種形式。神經功能重塑代償機制是目前普遍被接受的中樞神經系統損傷后功能恢復的理論基礎，脊髓可塑性是脊髓損傷康復治療的重要基礎之一。因此，脊髓損傷后的修復重建可能是通過殘留神經元軸突殘端出芽或殘留軸突側支出芽的形式再生，并延伸至相應的靶細胞，形成突觸聯系，重建相應的神經通路，或是通過上調神經元興奮性及神經遞質分泌等機制，從而恢復或部分恢復對靶細胞的神經支配。既往已有實驗證明將周圍神經直接移植至脊髓后2個月，神經肌肉接頭部位運動終板受體從膽堿類轉變成谷氨酸類[10]，這項研究的發現為皮質脊髓束的功能恢復提供了客觀依據。
本實驗中，實驗組重建術后組織學觀察可見脊髓重建部位坐骨神經嵌入脊髓中，坐骨神經束膜顯示清楚；免疫組織化學染色可見脊髓重建部位周圍神經內，神經元軸突呈陽性染色，且周圍神經與脊髓已形成聯系。說明一級神經元直接重建手術能夠使周圍神經和脊髓間建立較為牢固的連接，為恢復脊髓損傷后肢體神經功能奠定解剖基礎。
HRP可被神經末梢攝取，經軸質流逆行運輸到神經胞體，然后用組織化學方法即可顯示神經元的輪廓，HRP逆行示蹤可反映神經遞質在周圍神經元與中樞神經元之間的聯系。本實驗HRP逆行示蹤染色結果顯示，實驗組脊髓重建區域頭端可見束狀藍色著色，說明周圍神經與脊髓已經重建相應的神經通路。但對于軸突生長的數量、質量尚需深入研 究。
考慮到中樞神經存在強大的神經元可塑性，在今后實驗中，可聯合減重步行、經顱磁刺激等康復訓練，刺激脊髓步行模式中樞神經元環路啟動和重組改善運動功能，促進步行能力恢復[3, 15]。另外，大鼠后肢運動功能除受皮質脊髓束支配外，其他傳導束如小腦脊髓束等也發揮重要作用，在進一步研究中也要考慮相關傳導束的作用機制，以更加全面深入了解和分析一級神經元重建后大鼠后肢運動功能恢復情況。
脊髓損傷屬于中樞神經系統損傷，可造成患者終生感覺、運動以及排尿排便功能嚴重障礙[1]。既往脊髓損傷重建是建立在傳統“二級神經元”模式基礎上，即大腦皮質運動神經元必須經過脊髓前角細胞換元后才能支配靶器官。Brunelli等[2]認為，將外周神經移植至中樞神經系統后，由于外周神經系統內神經管的作用，其軸突可以再生，但是與中樞神經系統微環境接觸后，該生長作用即停止。本實驗旨在探討大腦皮質運動神經元軸突（皮質脊髓束）直接支配靶器官的可行性及可能恢復機制，以期為恢復脊髓損傷下肢運動功能提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
成年雌性SD大鼠40只，體質量300～350 g，由軍事醫學科學院動物飼養中心提供。鼠神經絲蛋白200（neurofilament 200，NF-200）單克隆抗體、兔膠質纖維酸性蛋白多克隆抗體、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；60%游離辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP；蘇州亞科化學試劑有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 橫斷型完全性脊髓損傷模型的制備
取40只大鼠制備橫斷型完全性脊髓損傷模型。具體方法：術前大鼠單籠飼養1周、禁食12 h，稱重，采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術臺上，胸腰背部剃毛備皮。根據肋骨確定椎體序列，以L1棘突為中心作背部正中縱切口，長約3 cm，切開皮膚、筋膜及皮下組織，緊貼棘突骨面縱行鈍性分離椎旁肌，直達椎板表面，剝離附著在棘突和椎板上的軟組織，顯露L1椎板和棘突，鑷子提起L1棘突，切斷L1與L2棘間韌帶，血管鉗咬除L1下關節突與部分下椎板，注意勿損傷血管和脊髓，暴露L1椎體下緣水平脊髓約5 mm長。在L1椎體下緣水平，用尖銳刀片從背側至腹側快速分層完全橫斷脊髓，以神經剝離子在腹側硬脊膜與椎管間穿出至背側，同時造成約2 mm長脊髓缺損，并填充明膠海綿至缺損處，確認完全橫斷。動物脊髓橫斷后即刻出現擺尾、雙下肢抽搐或尿失禁等現象，提示模型制備成功。壓迫止血后，生理鹽水棉球擦洗，逐層縫合切口。
1.2.2 動物模型分組及處理
模型制備2周后，將大鼠隨機分為實驗組及對照組（n=20）。實驗組行右后肢一級神經元直接重建手術（即周圍神經直接連接中樞神經）。見圖 1。大鼠術前處理、麻醉及體位與模型制備手術一致。沿原切口入路，切開皮膚、筋膜及皮下組織，緊貼棘突骨面縱行鈍性分離椎旁肌，直達T12、13椎板表面，剝離附著在棘突和椎板上的軟組織，顯露T12、13椎板和棘突，血管鉗咬除2個節段全部椎板，注意避免損傷血管和脊髓，暴露T12、13水平脊髓約15 mm長，備用。
圖1
一級神經元直接重建手術設計示意圖 ? ?確定大鼠右側髂前上棘位置，在髂前上棘后下5 mm處，沿髂嵴向后作長約5 mm縱切口，神經根拉鉤鈍性分離肌肉，直達股神經，盡可能保留股神經長度，切斷股神經近端備用。確定大鼠右側髂后上棘位置，在髂后上棘與脊柱棘突之間作長約3 mm縱切口，神經根拉鉤鈍性分離肌肉，直達坐骨神經，盡可能保留坐骨神經長度，切斷坐骨神經近端備用。確定大鼠右后肢膝部，在膝后作長3 mm縱切口，神經根拉鉤鈍性分離肌肉，直達脛神經，盡可能保留脛神經長度，切斷其遠端，神經根拉鉤鈍性分離坐骨神經與脛神經走行段肌肉，取出坐骨神經與脛神經連接段神經，置于生理鹽水中備用。
在已暴露的T12、13脊髓中段，于脊髓側索右側部作2 mm深切口，用顯微剪將坐骨神經近端處理為一斜行平面，插入切口中，切面平對脊髓近端，深度約1.5 mm[3]，11-0縫線固定坐骨神經外膜和硬脊膜。將坐骨神經遠端穿行于脊柱兩旁肌肉組織內，縫合脛神經遠端與股神經近端，11-0縫線固定脛神經與股神經外膜。壓迫止血后，生理鹽水棉球擦洗，逐層縫合切口，術畢歸籠。飼養環境溫度控制在20～25℃，定期通風；注意更換飼養籠墊料，保持干燥。造模后常規背部注射青霉素（160萬U/kg）3 d預防感染，若停藥后再次出現感染征象，立即恢復抗生素治療，直至癥狀消失。注意清潔因尿失禁而浸濕的肢體，以減少壓瘡的發生。每天按摩、擠壓膀胱協助排尿3～4次，注意手法輕柔，避免膀胱破裂；輕揉腹部及雙后肢2次，預防腸梗阻和壓瘡的發生；右后肢被動活動2次，避免引起關節攣縮，影響行為學觀察。
對照組除將坐骨神經遠端穿行于脊柱兩旁肌肉組織內后，不縫合脛神經遠端與股神經近端外，其余處理同實驗組。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察大鼠術后存活及肢體活動恢復情況。
1.3.2 后肢運動功能評分
術后7、30、50、70 d兩組分別取6只大鼠，采用BBB評分[4]評價大鼠雙側后肢運動功能恢復情況。
1.3.3 組織學觀察
組織學及免疫組織化學染色主要觀察脊髓局部病理變化及周圍神經與脊髓物理連接情況，因實驗組和對照組在脊髓周圍神經連接操作無差異，故僅實驗組取材進行觀察。術后70 d實驗組取4只大鼠，同上法麻醉后固定于取材臺上，剪開心尖部插入灌流針至主動脈，剪開心耳，先灌注37℃生理鹽水至組織器官變白，灌注量200 mL；再灌注4%多聚甲醛（低速灌注），灌注期間可見大鼠四肢、尾部有痙攣現象，直至四肢及軀體僵硬。取出脊髓重建部位上、下1 cm的脊髓節段，置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定，常規石蠟包埋，連續背側向腹側冠狀位縱切片，片厚8 μm，HE染色。鏡下觀察周圍神經與脊髓連接情況及局部脊髓病理改變。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
術后70 d實驗組取4只大鼠，同1.3.3方法取材并切片，行NF-200免疫組織化學染色。采用計算機顯像系統觀察，以褐色為陽性染色。
1.3.5 HRP逆行示蹤標記染色觀察
術后70 d兩組各取4只大鼠進行HRP逆行示蹤標記神經元，觀察局部脊髓變化。具體操作：術前處理及麻醉方法同動物模型制備。沿膝關節上方作正中縱切口，長約1 cm，分離皮膚、筋膜及皮下組織，直達肌肉。沿股四頭肌多點注射60%HRP混懸液，每點注射20 μL，每次注射時間為5 min，留針10 min，逐層縫合關閉切口。HRP注射后48 h灌注取材，將標本置于4%多聚甲醛2 h，然后置于20%蔗糖磷酸鹽緩沖液中過夜。采用蛋白明膠包埋，冰凍切片機切片，連續背側向腹側冠狀位縱切片，片厚40 μm，進行四甲基聯苯胺染色。經計算機顯像系統觀察，以藍色為陽性染色。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
飼養期間共6只大鼠死亡，4只死于腸梗阻，2 只死于尿路感染引起的尿道阻塞。1只大鼠出現自噬尾部現象，1只出現脊髓手術部位感染跡象，3 只在灌注取材時發現脊髓重建部位出現神經脫離脊髓現象（2只）及坐骨神經萎縮明顯（1只），考慮為手術縫合連接失敗、術后協助排尿或關節活動時護理不當致縫合處分離所致。上述大鼠均排除實驗，并給予對應補充。
模型制備術后兩組大鼠活動及飲食較術前無顯著變化；兩前肢可爬行，術側后肢與對側相比，無明顯關節活動。重建術后兩組大鼠無壓瘡發生，均存在腹脹、尿潴留、大便困難伴硬結、尿混濁等現象。
2.2 后肢運動功能評分
術后兩組大鼠右后肢均未見關節攣縮，但運動功能無明顯恢復，各時間點BBB評分均為0分。左后肢運動功能均有不同程度恢復，各時間點對照組和實驗組BBB評分比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
兩組術后各時間點左后肢BBB評分（n=6，2.3 組織學觀察
實驗組鏡下可見脊髓重建部位坐骨神經嵌入脊髓中，坐骨神經束膜顯示清楚，連接部位脊髓無明顯萎縮，但有部分空洞形成（圖 2）。
2.4 免疫組織化學染色觀察
實驗組鏡下可見脊髓重建部位周圍神經內神經元軸突呈陽性染色，且周圍神經與脊髓已形成聯系（圖 3）。
2.5 HRP逆行示蹤標記染色觀察
實驗組脊髓重建部位頭端可見束狀藍色標記，即為HRP逆行示蹤劑神經元軸突顯色；4只大鼠標本著色部位、密度均無明顯差異。而對照組脊髓重建部位頭端均未出現HRP染色。 見圖 4。
3 討論
3.1 一級神經元直接重建對大鼠運動功能恢復的影響
皮質脊髓束是哺乳動物脊髓內的主要下行運動性傳導束，其纖維直接或間接通過中間神經元支配脊髓前角細胞，從而控制骨骼肌的隨意運動。脊髓損傷因破壞了皮質脊髓束，損傷平面以下仍存活的脊髓前角細胞失去了大腦的神經支配，不能進行隨意性功能活動。患者肢體功能的恢復很大程度上取決于皮質脊髓束的再生，及其與脊髓前角運動神經元直接或間接的功能性重建。因此，恢復脊髓傳導束功能，尤其恢復控制隨意運動的皮質脊髓束功能，具有重要意義[5]。
自1981 年David 和Aguayo證實皮質脊髓束可以再生以來[6]，20 多年的實驗研究為人類攻克脊髓損傷難題帶來了新的希望[7-11]。Brunelli等[12]將大鼠腓腸神經近端直接連接皮質脊髓側束，遠端與支配大鼠腹內斜肌的神經連接，2個月后發現神經肌肉接頭部位運動終板受體從膽堿類轉變成谷氨酸類。之后，他們采用顯微外科技術將1例胸脊髓損傷患者的坐骨神經進行游離并切斷作為橋接神經，近端移植至脊髓損傷頭端的皮質脊髓束區域，遠端連接支配臀大肌、臀中肌和股四頭肌的周圍神經。隨訪12個月后發現，移植神經支配的肌肉出現自主運動，而且這種運動在2～3年后得到鞏固和增強。同時他們還發現，對移植神經支配的肌肉進行選擇性收縮時，同一皮層運動區支配的其他肌肉不會產生共同運動，他們將這種適應性的神經功能稱為“單個神經元可塑性”[13]。
本實驗采用坐骨神經近端連接脊髓皮質脊髓束區，遠端連接支配股四頭肌的股神經，以期恢復截癱大鼠后肢運動功能。結果顯示，對照組和實驗組大鼠神經移植側肢體BBB評分差異無統計學意義，考慮可能與以下因素有關：① BBB評分標準為評價脊髓背側打擊所致的大鼠脊髓損傷后的恢復期運動功能變化，并非針對損傷脊髓功能重建后大鼠后肢伸膝功能的評價量表。② 文獻報道中樞-周圍神經移植術后60 d可發現運動終板受體的轉變[6]。本實驗進行了70 d的觀察，可能因時間尚短，作為靶肌肉的股四頭肌運動功能尚未得到足夠神經支配，故運動功能恢復不明顯，有待進一步增大樣本量、延長觀察時間明確。③ 未采用運動誘發電位對股四頭肌運動功能恢復程度進行評價，影響實驗結果。另外，雖然本實驗手術均在顯微鏡下操作，但因大鼠脊髓較小，操作難度大，脊髓手術區域的白質破壞明顯，影響了效果評價。因此如需進一步動物實驗，宜采用大動物模型。
3.2 一級神經元直接重建手術對軸突再生的作用
神經元是一種電信號傳導-分泌細胞，由胞體和突觸組成。各種蛋白（微管、微絲、神經遞質、神經調子、髓鞘合成蛋白等）在胞體合成，并以軸漿運輸形式使胞體和突觸建立聯系，胞體對維持軸突解剖和功能的完整性十分重要。神經元末梢的突觸傳遞是一個電-化學-電的過程，即由突觸前神經元釋放化學物質，引起突觸后神經元的生物電改變，最終引發神經功能效應。研究證明[14]，脊髓損傷后位于大腦皮質的上運動神經元失去傳入信號的反饋，輸出信號喪失或終止于脊髓損傷平面的近端，導致控制運動的神經環路中斷，使上運動神經元處于斷聯休克抑制狀態，其代謝、軸漿運輸受抑制，合成分泌神經生長因子、神經遞質等均處于抑制狀態，信號傳導、軸突再生、髓鞘形成將無法實現，是脊髓功能恢復需要克服的關鍵機制。
神經可塑性指中樞神經系統損傷后，具有從解剖和功能上修改自身，以適應變化環境的能力，包括潛伏通路的激活和突觸重組等多種形式。神經功能重塑代償機制是目前普遍被接受的中樞神經系統損傷后功能恢復的理論基礎，脊髓可塑性是脊髓損傷康復治療的重要基礎之一。因此，脊髓損傷后的修復重建可能是通過殘留神經元軸突殘端出芽或殘留軸突側支出芽的形式再生，并延伸至相應的靶細胞，形成突觸聯系，重建相應的神經通路，或是通過上調神經元興奮性及神經遞質分泌等機制，從而恢復或部分恢復對靶細胞的神經支配。既往已有實驗證明將周圍神經直接移植至脊髓后2個月，神經肌肉接頭部位運動終板受體從膽堿類轉變成谷氨酸類[10]，這項研究的發現為皮質脊髓束的功能恢復提供了客觀依據。
本實驗中，實驗組重建術后組織學觀察可見脊髓重建部位坐骨神經嵌入脊髓中，坐骨神經束膜顯示清楚；免疫組織化學染色可見脊髓重建部位周圍神經內，神經元軸突呈陽性染色，且周圍神經與脊髓已形成聯系。說明一級神經元直接重建手術能夠使周圍神經和脊髓間建立較為牢固的連接，為恢復脊髓損傷后肢體神經功能奠定解剖基礎。
HRP可被神經末梢攝取，經軸質流逆行運輸到神經胞體，然后用組織化學方法即可顯示神經元的輪廓，HRP逆行示蹤可反映神經遞質在周圍神經元與中樞神經元之間的聯系。本實驗HRP逆行示蹤染色結果顯示，實驗組脊髓重建區域頭端可見束狀藍色著色，說明周圍神經與脊髓已經重建相應的神經通路。但對于軸突生長的數量、質量尚需深入研 究。
考慮到中樞神經存在強大的神經元可塑性，在今后實驗中，可聯合減重步行、經顱磁刺激等康復訓練，刺激脊髓步行模式中樞神經元環路啟動和重組改善運動功能，促進步行能力恢復[3, 15]。另外，大鼠后肢運動功能除受皮質脊髓束支配外，其他傳導束如小腦脊髓束等也發揮重要作用，在進一步研究中也要考慮相關傳導束的作用機制，以更加全面深入了解和分析一級神經元重建后大鼠后肢運動功能恢復情況。
