引用本文： 王曉旭, 翟溶凡, 楊俊濤, 周壽紅, 譚文甫, 譚光華. 腺病毒介導TGF-β1基因轉染腘繩肌腱對兔前交叉韌帶重建術后腱-骨愈合的組織形態學影響. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(12): 1488-1493. doi: 10.7507/1002-1892.20150319 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷是膝關節常見疾病，損傷后如不及時修復，將導致膝關節穩定性下降，并伴隨半月板、關節軟骨磨損和骨關節炎的發生[1-3]。關節鏡下重建術是治療ACL損傷的金標準[4]，自體腘繩肌腱是目前公認的ACL理想替代物，但仍存在愈合時間過長等問題[5-7]。研究表明，移植肌腱植入體內至少1年后才能逐漸愈合[8-9]，如何促進移植肌腱自體韌帶化以及滑膜、血管的再生，對重建ACL具有重要意義。TGF-β1是軟組織愈合過程中重要的生長因子之一，在韌帶修復過程中參與了組織愈合的調節[10]。為此，本實驗通過構建攜帶TGF-β1基因的重組腺病毒載體，并體外轉染新西蘭兔腘繩肌腱，然后體內重建兔ACL，觀察術后腱-骨愈合界面組織形態學結構的改變，旨在探討腺病毒介導TGF-β1基因轉染對自體腘繩肌腱重建兔ACL術后腱-骨愈合是否有促進作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
15～20月齡雄性新西蘭大白兔48只，體質量1.6～2.5 kg，由南華大學動物實驗部提供。實驗動物均無膝關節周圍腫脹，雙膝關節前抽屜試驗、Lachman 試驗陰性。
重組腺病毒載體AdTGF-β1與腺病毒空載體AdGFP的構建、鑒定以及滴度測定均由上海和元生物有限公司完成，采用DMEM培養液稀釋AdTGF-β1及AdGFP滴度至5×108 PFU/mL備用。ELISA試劑盒（長沙湘宇生物技術有限公司）；熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；Image-Pro Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組與方法
1.2.1 實驗分組
將48只兔隨機分為 A、B、C 3組，每組16只。A 組采用AdTGF-β1轉染的自體同側腘繩肌腱重建ACL；B 組采用AdGFP轉染的自體同側腘繩肌腱重建ACL；C 組采用未經處理的自體同側腘繩肌腱重建ACL。
1.2.2 重組腺病毒載體體外轉染腘繩肌腱
術前兔禁飲食12 h。采用腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g） 麻醉后，于右后肢脛骨結節內側0.5 cm處，作長約1 cm的縱切口，充分暴露腘繩肌腱止點并切取肌腱，肌腱用含抗生素的生理鹽水反復漂洗后，置于6孔培養板；其中，A、B組孔內分別加入含AdTGF-β1、AdGFP的DMEM培養液轉染腘繩肌腱，C組孔內加入DMEM培養液。置于37℃、5%CO2孵箱內培養12 h。
取A、B組轉染12 h的肌腱行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達；另取轉染12 h的A組肌腱，加入適量生理鹽水搗碎，制備成組織勻漿，以離心半徑3 cm、3 000 r/min離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明操作，測量轉染后腘繩肌腱中TGF-β1蛋白表達量。
1.2.3 兔ACL重建模型的制備
術前準備及麻醉方法同上，于兔右后肢髕上0.8～1.0 cm處向下至脛骨結節內側約0.5 cm處作切口，注意避開原切口，充分顯露髁間窩內解剖結構。以尖刀片將ACL在其兩端止點處切斷，檢查患肢前抽屜試驗及Lachman試驗均為陽性后，使用手搖鉆配置1.5 mm鉆頭，分別作脛骨及股骨隧道；將1.2.2中制備的自體腘繩肌腱對折，用2-0尼龍編織線編織肌腱兩端后引入骨隧道，分別于股骨、脛骨骨干鉆取骨橋，以懸吊法固定移植肌腱兩端。檢查移植肌腱形態與張力正常，患肢前抽屜試驗及Lachman試驗呈陰性后，關閉切口。術后患肢不作固定，1周內每天肌肉注射青霉素20 萬U，預防感染。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
觀察術后實驗動物存活、飲食以及肢體運動情況。于 2、4、8、12周，各組取4只兔予空氣栓塞法處死后，經原切口進入，切除膝關節周圍肌肉筋膜，觀察關節腔內脂肪墊、滑膜、半月板、后交叉韌帶以及骨隧道內、外口組織愈合情況。
1.3.2 組織學觀察
大體觀察后，用線鋸分別在骨橋以遠2 cm處截斷脛骨及股骨，取膝關節標本置于10%甲醛固定，脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋，5 μm厚切片。常規行HE、Masson 染色，鏡下觀察腱-骨愈合情況。于HE 染色切片計數成纖維細胞，首先將切片置于低倍視野下尋找腱-骨愈合界面，再更換為高倍視野，隨機取3個視野采用Image-Pro Plus圖像分析軟件計數成纖維細胞，取均值。于Masson 染色切片參照Buark 評價分級標準[11]評價腱-骨愈合情況：Ⅰ級，腱-骨界面區很少或無纖維血管組織；Ⅱ級，腱-骨界面區有纖維血管組織不伴膠原纖維，占界面長度的比例＜ 30%；Ⅲ級，腱-骨界面區有成熟的纖維血管組織，細胞結構和血管成分降低，占界面長度的比例為30%～60%；Ⅳ級，纖維血管組織機化為致密結締組織，含有Sharpey纖維結構，占界面長度的比例＞60%。
1.4 統計學方法
采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；計數資料采用Kruskal-Wallis秩和檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 重組腺病毒載體體外轉染腘繩肌腱觀察
熒光顯微鏡下觀察示，轉染12 h后A、B組均可見綠色熒光表達。見圖 1。ELISA 法檢測示，A組AdTGF-β1轉染12 h后腘繩肌腱組織中TGF-β1蛋白表達量為（221.0±12.2）ng/mL。
圖1
腘繩肌腱轉染12 h后熒光顯微鏡觀察（×200） ? A組 ? B組 ? ?2.2 動物實驗觀察
2.2.1 大體觀察
A、B組各有2只兔因麻醉意外死亡，給予對應補充。其余動物均存活，飲食正常，手術側肢體活動良好。取材時發現B組2只兔由于骨隧道塌陷，移植肌腱無法固定而從骨隧道脫出，模型制備失敗，給予對應補充。
大體觀察示，各組膝關節周圍無發熱、紅腫，切口無感染、無裂開跡象，打開關節腔見滑膜明顯增生，半月板完好，未見明顯磨損及破裂，移植肌腱張力良好，固定牢固。其中，2周時移植肌腱與股骨、脛骨隧道間仍見間隙；4 周時可見部分瘢痕組織填充于骨隧道內口；8 周時骨隧道內口可見大量瘢痕組織填充，外口見部分骨樣組織生長；12周時骨樣組織生長較8周明顯增多，移植肌腱與骨隧道壁緊密粘連。
2.2.2 HE染色
① 鏡下觀察：術后2周，A組腱-骨界面見少量成纖維細胞生成以及無序排列的膠原纖維；B、C 組移植肌腱與骨隧道間可見較少成纖維細胞生成，腱-骨界面間隙明顯。術后4周，A組腱-骨界面可見軟骨組織構成，其中有部分成纖維細胞和類軟骨細胞，界面結合較緊密，新生骨向肌腱長入；B、C組腱-骨界面可見炎性細胞和成纖維細胞，結合較疏松，且有明顯孔隙，仍無腱-骨連接。術后8周，A組腱-骨界面組織連接更緊密，出現軟骨移行帶，排列規整的類軟骨細胞逐漸成熟，Sharpey纖維初步形成；B、C組腱-骨界面結合較疏松，但優于4周時，未見明顯Sharpey 纖維生成，可見成纖維細胞生長。術后12周，A組腱-骨界面可見規整的Sharpey纖維，有致密結締組織及鈣化軟骨形成，部分區域結構有直接愈合傾向；B、C 組腱-骨界面有少量排列不規整的Sharpey 纖維，鈣化骨形成，組織間連接相對緊密，無直接愈合傾向。見圖 2。
② 腱-骨界面成纖維細胞計數：各時間點A 組成纖維細胞數顯著多于B、C 組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組腱-骨界面成纖維細胞計數（n=4，2.2.3 Masson染色
① 鏡下觀察：術后2周，A 組腱-骨界面可見較少成纖維細胞生成，膠原纖維含量較少，排列無序；B、C 組腱-骨界面可見少量成纖維細胞生成，腱-骨界面間隙明顯。術后4周，A 組腱-骨界面組織結合較緊密，移植肌腱與骨隧道間有成纖維細胞生成，自外周侵入移植肌腱，骨隧道側壁可見成骨，膠原纖維排列紊亂；B、C組腱-骨界面組織結合松散，移植肌腱與骨隧道間有少量成纖維細胞生成，可見少量膠原纖維，新生細胞侵入較少，膠原纖維排列較A組更紊亂。術后8周，A組腱-骨界面結合緊密，移植肌腱可見軟骨細胞生長，腱-骨界面膠原纖維含量增多，排列規整，部分見Sharpey纖維生長；B、C 組腱-骨界面仍有一定間隙，并見少量成纖維細胞增生，未見Sharpey纖維生長，膠原纖維排列較前稍規整。術后12周，A 組腱-骨界面見成纖維細胞生成，膠原纖維含量增多，排列規整，與骨隧道壁垂直連接的Sharpey纖維增多，部分形成類似直接止點結構；B、C 組腱-骨界面成纖維細胞增生、膠原纖維較前增多，排列尚規整，出現少量Sharpey纖維，但是排列不規則，骨隧道口處未見類似直接止點形成。見圖 3。
圖3
術后各時間點各組Masson染色觀察（×100） B：骨 IF：腱-骨界面 T：肌腱 ? A組2周 ? B組2周 ? C組2周 ? A組4周 ? B組4周 ? C組4周 ? A組8周 ? B組8周 ? C組8周 ? A組12周 ? B組12周 ? C組12周
Figure3.
Masson staining observation of each group after operation (×100) B: Bone IF: Tendon-bone interface T: Tendon ? Group A at 2 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group B at 4 weeks ? Group C at 4 weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 8 weeks ? Group C at 8 weeks ? Group A at 12 weeks ? Group B at 12 weeks ? Group C at 12 weeks
② 腱-骨愈合分級：各時間點A 組均優于 B、C組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點各組腱-骨愈合Buark評價分級結果
Table2.
Comparison of Buark grading among 3 groups after operation
3 討論
3.1 腱-骨愈合過程和類型
肌腱與骨的移形部結構復雜，損傷后自愈困難，因此腱-骨組織學上的愈合與重塑是一個復雜、漫長過程。ACL重建術后腱-骨愈合分為直接愈合和間接愈合兩種形式 [12]。間接愈合方式是指腱-骨間生成一種垂直于界面的、穿透性的膠原纖維，該纖維組織被稱為Sharpey纖維，此種愈合方式發生在腱-骨愈合早期，即肌腱移植物植入骨隧道后3～7 d即可開始，被認為是肌腱移植物與骨隧道形成骨愈合的早期征象。直接愈合是指腱-骨間形成骨、鈣化纖維軟骨、纖維軟骨、肌腱纖維4層典型結構，即正常ACL止點結構。這種愈合方式見于骨隧道出口以及腱-骨愈合晚期。大多數學者認為直接愈合相對于間接愈合更具優勢，因為正常止點的4層移行結構各有不同的組織學特性，應力可以在肌腱及骨組織之間相互轉化，從而避免了應力相對集中[13]。相比于單純骨愈合或肌腱愈合，腱-骨愈合是骨與肌腱兩種性質完全不同組織的相互融合，所以仍是醫學界一項難題。
本實驗發現 A 組在12周時Sharpey纖維間接止點結構成熟，部分區域結構有直接愈合傾向；B、C 組界面間接止點結構尚未成熟，骨隧道口處未見類似直接止點形成。A 組各時間點腱-骨愈合分級均優于B、C 組，也進一步證明了TGF-β1在一定程度上可以加速腱-骨間接愈合 [14]。
3.2 基因工程技術在腱-骨愈合中的應用
目前應用生長因子促進腱-骨愈合的方法主要有兩種，采用基因工程技術將主要生長因子基因導入靶細胞使其在體內持續、穩定表達是其中一種。基因工程技術重點是載體的選擇。腺病毒載體在自然界中廣泛分布，容易獲取，可轉染增殖期和靜止期細胞，且不整合至宿主染色體，外源基因表達水平高，是高效表達外源基因的轉移載體。此外，腺病毒經純化后的滴度較其他病毒載體高，感染宿主能力強，但其性質相對穩定，對人無致病、致畸、致癌的潛在危害，是基因工程技術中應用最廣泛的一種載體[10, 15]。
本實驗選擇腺病毒載體，將AdTGF-β1、AdGFP體外轉染腘繩肌腱12 h后，熒光顯微鏡下觀察發現兩組均可見綠色熒光表達，說明體外轉染均獲得成功。通過ELISA 法在A組轉染后腘繩肌腱組織中檢測到TGF-β1蛋白表達，說明AdTGF-β1體外轉染腘繩肌腱后TGF-β1蛋白能持續表達，為下一步實驗奠定了基礎。
3.3 TGF-β1對腱-骨愈合的作用
TGF-β1是一種多肽生長因子，因其對多種類型結締組織具有較復雜生物學效應，并且能促進組織生長和修復，被認為是TGF家族中最重要的成員之一。它既能抑制損傷部位新合成細胞外基質的降解，又能刺激損傷部位成纖維細胞外基質蛋白的合成，如纖維連接蛋白、膠原、氨基葡萄糖等，以此來對細胞的增殖與分化進行精密調節。TGF-β1可以刺激成纖維細胞增殖，并且增加蛋白聚糖和膠原的合成。體內實驗發現，外源性施加TGF-β1可使成纖維細胞、Ⅰ型膠原基因表達上調，促進Sharpey纖維和骨隧道內新骨的形成，對早期腱-骨愈合具有積極影響[16-17]。
本實驗觀察發現A組8、12周Sharpey纖維和骨隧道內新骨形成情況均好于B、C組，A 組成纖維細胞較B、C組多，說明通過AdTGF-β1體外轉染腘繩肌腱使TGF-β1蛋白在腱-骨部位持續表達并促進腱-骨愈合方法獲得成功，為使用TGF-β1高效促進腱-骨愈合提供了一種新思路 。
3.4 本實驗不足
① AdTGF-β1和AdGFP轉染腘繩肌腱相關研究報道較少，本實驗中僅根據預實驗得到的AdTGF-β1 和AdGFP轉染滴度與時間進行處理，而最佳轉染滴度與轉染時間尚需研究；② 兩種腺病毒載體轉染肌腱雖均獲得成功，但缺少對轉染效率的定量分析；③ 實驗樣本量少，觀察時間僅為12 周，遠期腱-骨愈合效果需進一步探索。
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷是膝關節常見疾病，損傷后如不及時修復，將導致膝關節穩定性下降，并伴隨半月板、關節軟骨磨損和骨關節炎的發生[1-3]。關節鏡下重建術是治療ACL損傷的金標準[4]，自體腘繩肌腱是目前公認的ACL理想替代物，但仍存在愈合時間過長等問題[5-7]。研究表明，移植肌腱植入體內至少1年后才能逐漸愈合[8-9]，如何促進移植肌腱自體韌帶化以及滑膜、血管的再生，對重建ACL具有重要意義。TGF-β1是軟組織愈合過程中重要的生長因子之一，在韌帶修復過程中參與了組織愈合的調節[10]。為此，本實驗通過構建攜帶TGF-β1基因的重組腺病毒載體，并體外轉染新西蘭兔腘繩肌腱，然后體內重建兔ACL，觀察術后腱-骨愈合界面組織形態學結構的改變，旨在探討腺病毒介導TGF-β1基因轉染對自體腘繩肌腱重建兔ACL術后腱-骨愈合是否有促進作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
15～20月齡雄性新西蘭大白兔48只，體質量1.6～2.5 kg，由南華大學動物實驗部提供。實驗動物均無膝關節周圍腫脹，雙膝關節前抽屜試驗、Lachman 試驗陰性。
重組腺病毒載體AdTGF-β1與腺病毒空載體AdGFP的構建、鑒定以及滴度測定均由上海和元生物有限公司完成，采用DMEM培養液稀釋AdTGF-β1及AdGFP滴度至5×108 PFU/mL備用。ELISA試劑盒（長沙湘宇生物技術有限公司）；熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；Image-Pro Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組與方法
1.2.1 實驗分組
將48只兔隨機分為 A、B、C 3組，每組16只。A 組采用AdTGF-β1轉染的自體同側腘繩肌腱重建ACL；B 組采用AdGFP轉染的自體同側腘繩肌腱重建ACL；C 組采用未經處理的自體同側腘繩肌腱重建ACL。
1.2.2 重組腺病毒載體體外轉染腘繩肌腱
術前兔禁飲食12 h。采用腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g） 麻醉后，于右后肢脛骨結節內側0.5 cm處，作長約1 cm的縱切口，充分暴露腘繩肌腱止點并切取肌腱，肌腱用含抗生素的生理鹽水反復漂洗后，置于6孔培養板；其中，A、B組孔內分別加入含AdTGF-β1、AdGFP的DMEM培養液轉染腘繩肌腱，C組孔內加入DMEM培養液。置于37℃、5%CO2孵箱內培養12 h。
取A、B組轉染12 h的肌腱行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達；另取轉染12 h的A組肌腱，加入適量生理鹽水搗碎，制備成組織勻漿，以離心半徑3 cm、3 000 r/min離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明操作，測量轉染后腘繩肌腱中TGF-β1蛋白表達量。
1.2.3 兔ACL重建模型的制備
術前準備及麻醉方法同上，于兔右后肢髕上0.8～1.0 cm處向下至脛骨結節內側約0.5 cm處作切口，注意避開原切口，充分顯露髁間窩內解剖結構。以尖刀片將ACL在其兩端止點處切斷，檢查患肢前抽屜試驗及Lachman試驗均為陽性后，使用手搖鉆配置1.5 mm鉆頭，分別作脛骨及股骨隧道；將1.2.2中制備的自體腘繩肌腱對折，用2-0尼龍編織線編織肌腱兩端后引入骨隧道，分別于股骨、脛骨骨干鉆取骨橋，以懸吊法固定移植肌腱兩端。檢查移植肌腱形態與張力正常，患肢前抽屜試驗及Lachman試驗呈陰性后，關閉切口。術后患肢不作固定，1周內每天肌肉注射青霉素20 萬U，預防感染。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
觀察術后實驗動物存活、飲食以及肢體運動情況。于 2、4、8、12周，各組取4只兔予空氣栓塞法處死后，經原切口進入，切除膝關節周圍肌肉筋膜，觀察關節腔內脂肪墊、滑膜、半月板、后交叉韌帶以及骨隧道內、外口組織愈合情況。
1.3.2 組織學觀察
大體觀察后，用線鋸分別在骨橋以遠2 cm處截斷脛骨及股骨，取膝關節標本置于10%甲醛固定，脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋，5 μm厚切片。常規行HE、Masson 染色，鏡下觀察腱-骨愈合情況。于HE 染色切片計數成纖維細胞，首先將切片置于低倍視野下尋找腱-骨愈合界面，再更換為高倍視野，隨機取3個視野采用Image-Pro Plus圖像分析軟件計數成纖維細胞，取均值。于Masson 染色切片參照Buark 評價分級標準[11]評價腱-骨愈合情況：Ⅰ級，腱-骨界面區很少或無纖維血管組織；Ⅱ級，腱-骨界面區有纖維血管組織不伴膠原纖維，占界面長度的比例＜ 30%；Ⅲ級，腱-骨界面區有成熟的纖維血管組織，細胞結構和血管成分降低，占界面長度的比例為30%～60%；Ⅳ級，纖維血管組織機化為致密結締組織，含有Sharpey纖維結構，占界面長度的比例＞60%。
1.4 統計學方法
采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；計數資料采用Kruskal-Wallis秩和檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 重組腺病毒載體體外轉染腘繩肌腱觀察
熒光顯微鏡下觀察示，轉染12 h后A、B組均可見綠色熒光表達。見圖 1。ELISA 法檢測示，A組AdTGF-β1轉染12 h后腘繩肌腱組織中TGF-β1蛋白表達量為（221.0±12.2）ng/mL。
圖1
腘繩肌腱轉染12 h后熒光顯微鏡觀察（×200） ? A組 ? B組 ? ?2.2 動物實驗觀察
2.2.1 大體觀察
A、B組各有2只兔因麻醉意外死亡，給予對應補充。其余動物均存活，飲食正常，手術側肢體活動良好。取材時發現B組2只兔由于骨隧道塌陷，移植肌腱無法固定而從骨隧道脫出，模型制備失敗，給予對應補充。
大體觀察示，各組膝關節周圍無發熱、紅腫，切口無感染、無裂開跡象，打開關節腔見滑膜明顯增生，半月板完好，未見明顯磨損及破裂，移植肌腱張力良好，固定牢固。其中，2周時移植肌腱與股骨、脛骨隧道間仍見間隙；4 周時可見部分瘢痕組織填充于骨隧道內口；8 周時骨隧道內口可見大量瘢痕組織填充，外口見部分骨樣組織生長；12周時骨樣組織生長較8周明顯增多，移植肌腱與骨隧道壁緊密粘連。
2.2.2 HE染色
① 鏡下觀察：術后2周，A組腱-骨界面見少量成纖維細胞生成以及無序排列的膠原纖維；B、C 組移植肌腱與骨隧道間可見較少成纖維細胞生成，腱-骨界面間隙明顯。術后4周，A組腱-骨界面可見軟骨組織構成，其中有部分成纖維細胞和類軟骨細胞，界面結合較緊密，新生骨向肌腱長入；B、C組腱-骨界面可見炎性細胞和成纖維細胞，結合較疏松，且有明顯孔隙，仍無腱-骨連接。術后8周，A組腱-骨界面組織連接更緊密，出現軟骨移行帶，排列規整的類軟骨細胞逐漸成熟，Sharpey纖維初步形成；B、C組腱-骨界面結合較疏松，但優于4周時，未見明顯Sharpey 纖維生成，可見成纖維細胞生長。術后12周，A組腱-骨界面可見規整的Sharpey纖維，有致密結締組織及鈣化軟骨形成，部分區域結構有直接愈合傾向；B、C 組腱-骨界面有少量排列不規整的Sharpey 纖維，鈣化骨形成，組織間連接相對緊密，無直接愈合傾向。見圖 2。
② 腱-骨界面成纖維細胞計數：各時間點A 組成纖維細胞數顯著多于B、C 組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組腱-骨界面成纖維細胞計數（n=4，2.2.3 Masson染色
① 鏡下觀察：術后2周，A 組腱-骨界面可見較少成纖維細胞生成，膠原纖維含量較少，排列無序；B、C 組腱-骨界面可見少量成纖維細胞生成，腱-骨界面間隙明顯。術后4周，A 組腱-骨界面組織結合較緊密，移植肌腱與骨隧道間有成纖維細胞生成，自外周侵入移植肌腱，骨隧道側壁可見成骨，膠原纖維排列紊亂；B、C組腱-骨界面組織結合松散，移植肌腱與骨隧道間有少量成纖維細胞生成，可見少量膠原纖維，新生細胞侵入較少，膠原纖維排列較A組更紊亂。術后8周，A組腱-骨界面結合緊密，移植肌腱可見軟骨細胞生長，腱-骨界面膠原纖維含量增多，排列規整，部分見Sharpey纖維生長；B、C 組腱-骨界面仍有一定間隙，并見少量成纖維細胞增生，未見Sharpey纖維生長，膠原纖維排列較前稍規整。術后12周，A 組腱-骨界面見成纖維細胞生成，膠原纖維含量增多，排列規整，與骨隧道壁垂直連接的Sharpey纖維增多，部分形成類似直接止點結構；B、C 組腱-骨界面成纖維細胞增生、膠原纖維較前增多，排列尚規整，出現少量Sharpey纖維，但是排列不規則，骨隧道口處未見類似直接止點形成。見圖 3。
圖3
術后各時間點各組Masson染色觀察（×100） B：骨 IF：腱-骨界面 T：肌腱 ? A組2周 ? B組2周 ? C組2周 ? A組4周 ? B組4周 ? C組4周 ? A組8周 ? B組8周 ? C組8周 ? A組12周 ? B組12周 ? C組12周
Figure3.
Masson staining observation of each group after operation (×100) B: Bone IF: Tendon-bone interface T: Tendon ? Group A at 2 weeks ? Group B at 2 weeks ? Group C at 2 weeks ? Group A at 4 weeks ? Group B at 4 weeks ? Group C at 4 weeks ? Group A at 8 weeks ? Group B at 8 weeks ? Group C at 8 weeks ? Group A at 12 weeks ? Group B at 12 weeks ? Group C at 12 weeks
② 腱-骨愈合分級：各時間點A 組均優于 B、C組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點各組腱-骨愈合Buark評價分級結果
Table2.
Comparison of Buark grading among 3 groups after operation
3 討論
3.1 腱-骨愈合過程和類型
肌腱與骨的移形部結構復雜，損傷后自愈困難，因此腱-骨組織學上的愈合與重塑是一個復雜、漫長過程。ACL重建術后腱-骨愈合分為直接愈合和間接愈合兩種形式 [12]。間接愈合方式是指腱-骨間生成一種垂直于界面的、穿透性的膠原纖維，該纖維組織被稱為Sharpey纖維，此種愈合方式發生在腱-骨愈合早期，即肌腱移植物植入骨隧道后3～7 d即可開始，被認為是肌腱移植物與骨隧道形成骨愈合的早期征象。直接愈合是指腱-骨間形成骨、鈣化纖維軟骨、纖維軟骨、肌腱纖維4層典型結構，即正常ACL止點結構。這種愈合方式見于骨隧道出口以及腱-骨愈合晚期。大多數學者認為直接愈合相對于間接愈合更具優勢，因為正常止點的4層移行結構各有不同的組織學特性，應力可以在肌腱及骨組織之間相互轉化，從而避免了應力相對集中[13]。相比于單純骨愈合或肌腱愈合，腱-骨愈合是骨與肌腱兩種性質完全不同組織的相互融合，所以仍是醫學界一項難題。
本實驗發現 A 組在12周時Sharpey纖維間接止點結構成熟，部分區域結構有直接愈合傾向；B、C 組界面間接止點結構尚未成熟，骨隧道口處未見類似直接止點形成。A 組各時間點腱-骨愈合分級均優于B、C 組，也進一步證明了TGF-β1在一定程度上可以加速腱-骨間接愈合 [14]。
3.2 基因工程技術在腱-骨愈合中的應用
目前應用生長因子促進腱-骨愈合的方法主要有兩種，采用基因工程技術將主要生長因子基因導入靶細胞使其在體內持續、穩定表達是其中一種。基因工程技術重點是載體的選擇。腺病毒載體在自然界中廣泛分布，容易獲取，可轉染增殖期和靜止期細胞，且不整合至宿主染色體，外源基因表達水平高，是高效表達外源基因的轉移載體。此外，腺病毒經純化后的滴度較其他病毒載體高，感染宿主能力強，但其性質相對穩定，對人無致病、致畸、致癌的潛在危害，是基因工程技術中應用最廣泛的一種載體[10, 15]。
本實驗選擇腺病毒載體，將AdTGF-β1、AdGFP體外轉染腘繩肌腱12 h后，熒光顯微鏡下觀察發現兩組均可見綠色熒光表達，說明體外轉染均獲得成功。通過ELISA 法在A組轉染后腘繩肌腱組織中檢測到TGF-β1蛋白表達，說明AdTGF-β1體外轉染腘繩肌腱后TGF-β1蛋白能持續表達，為下一步實驗奠定了基礎。
3.3 TGF-β1對腱-骨愈合的作用
TGF-β1是一種多肽生長因子，因其對多種類型結締組織具有較復雜生物學效應，并且能促進組織生長和修復，被認為是TGF家族中最重要的成員之一。它既能抑制損傷部位新合成細胞外基質的降解，又能刺激損傷部位成纖維細胞外基質蛋白的合成，如纖維連接蛋白、膠原、氨基葡萄糖等，以此來對細胞的增殖與分化進行精密調節。TGF-β1可以刺激成纖維細胞增殖，并且增加蛋白聚糖和膠原的合成。體內實驗發現，外源性施加TGF-β1可使成纖維細胞、Ⅰ型膠原基因表達上調，促進Sharpey纖維和骨隧道內新骨的形成，對早期腱-骨愈合具有積極影響[16-17]。
本實驗觀察發現A組8、12周Sharpey纖維和骨隧道內新骨形成情況均好于B、C組，A 組成纖維細胞較B、C組多，說明通過AdTGF-β1體外轉染腘繩肌腱使TGF-β1蛋白在腱-骨部位持續表達并促進腱-骨愈合方法獲得成功，為使用TGF-β1高效促進腱-骨愈合提供了一種新思路 。
3.4 本實驗不足
① AdTGF-β1和AdGFP轉染腘繩肌腱相關研究報道較少，本實驗中僅根據預實驗得到的AdTGF-β1 和AdGFP轉染滴度與時間進行處理，而最佳轉染滴度與轉染時間尚需研究；② 兩種腺病毒載體轉染肌腱雖均獲得成功，但缺少對轉染效率的定量分析；③ 實驗樣本量少，觀察時間僅為12 周，遠期腱-骨愈合效果需進一步探索。
