引用本文： 陳春媛, 李青, 汪泱. 內皮祖細胞源性胞外囊泡的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(9): 1150-1154. doi: 10.7507/1002-1892.20150249 復制
內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一群存在于臍帶血、成人骨髓和外周血、能增殖分化為成熟血管內皮細胞的幼稚細胞。該類細胞不僅參與胚胎期血管生成，同時也在出生后血管新生和損傷血管修復過程中發揮關鍵作用[1]。大量動物實驗和早期臨床試驗數據表明，EPCs移植可促進機體損傷部位新生血管的形成和受損血管的再內皮化，加快組織或器官的再生和功能恢復[2-4]。近來研究發現，移植到體內的EPCs不是通過自身增殖分化為成熟內皮細胞參與血管新生和組織再生，而主要是通過旁分泌機制動員、激活內源性內皮細胞和其他相關細胞參與組織修復[1, 4-6]。
胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細胞旁分泌的生物活性物質之一，在細胞間信息傳遞過程中扮演著極為重要的角色[7-8]。在EVs的形成過程中，會選擇性地分揀、富集與來源細胞相關的蛋白質、mRNAs和微小RNAs（micro RNAs，miRNAs）等信號分子，這些信號分子在EVs與靶細胞相互作用后被釋放到靶細胞中，并在靶細胞中繼續發揮功能[7-8]。近年已有不少研究報道EVs具有類似于干/祖細胞的組織修復功能[9-11]，但目前有關EPCs源性EVs（EPC-EVs）的研究尚處于初期階段。本文主要就EPC-EVs的生物學特性、分離純化和功能方面的相關研究進行綜述。
1 EPC-EVs的生物學特性
EVs是指由細胞來源的脂質雙分子層包繞的球囊狀結構，包括微泡（microvesicles，MVs）和外泌體（exosomes），二者具有不同的生物學特征，其主要區別在于形成方式和直徑大小[7]。MVs又稱脫落小體、微粒體，早在1946年Chargaff等[12]就提出了這一概念。MVs是細胞直接由胞質膜出芽、脫落而釋放到細胞外環境中的膜性小囊泡，透射電鏡下觀察其形態不均一，直徑通常在100～1 000 nm，但也可能＞1 μm或＜100 nm[7]。1981年Trams等[13]在利用透射電鏡測量正常細胞和腫瘤細胞的MVs時，發現除了一群直徑為500～1 000 nm的小囊泡（即MVs）外，還存在另外一群更小的囊泡狀物質，其平均直徑為40 nm。6年后，Johnstone等[14]將這種直徑＜100 nm的膜性囊泡正式命名為exosomes。Ex osomes起源于細胞內多泡體（multivesicular bod ies，MVBs），在MVBs與細胞膜融合后被分泌到細胞外基質中[7, 15]；同源性exosomes形態均一、大小相近，不同來源的exosomes直徑可以不同，但基本介于40～100 nm[7, 15-17]。
然而，目前有關exosomes與MVs的命名經常混淆，有些研究者甚至將二者混為一談[18]。如關于EPCs源性MVs的研究中，有較多研究者在定義MVs時采用的是exosomes的概念，但在鑒定這些“MVs”表型時采用的不是exosomes的特定標志物，而是MVs的常規標志物，混淆了MVs和exosomes的概念和特征。這些研究分離純化所得的“MVs”直徑多為60～160 nm[19-22]，由于在該直徑范圍中的囊泡包括MVs和exosomes，故這些“MVs”很可能是兩種囊泡的混合物。也有部分研究者分離所得的EPCs源性MVs直徑在100～500 nm[23]或1 μm左右[24]，這更符合MVs的特點。目前尚無研究明確報道EPCs源性exosomes的特性，但已有研究者初步探究了CD34+干細胞群（EPCs是該干細胞群中的一類細胞）來源的exosomes的相關特點。Sahoo等[25]從成人外周血中分選出CD34+干細胞群，并在培養上清中分離得到了大量exosomes，其直徑為40～60 nm。提示人外周血源性EPCs分泌的exosomes直徑也可能在該范圍內。
除了透射電鏡觀察外，表面標志物檢測是鑒定exosomes和MVs的另一必不可少的環節。研究發現，某些蛋白質（如CD9、CD63、CD81和TSG101等）在各種細胞來源的exosomes上均有分布，它們在ex osomes的形成、釋放等過程中發揮關鍵作用[7]。因而研究者將這些蛋白質作為exosomes的通用標志物應用于相關鑒定中。然而，目前研究者尚未發現MVs表面的特定標志物，其脂質成分、膜蛋白的組成和密度還有待進一步研究[7]。現階段主要用L-選擇素、整合素α4和β1等非特異性分子作為標志物，這些分子在MVs與靶細胞的相互作用過程中扮演重要角色[7, 19-22, 24, 26-27]。研究表明，exosomes和MVs中還含有與來源細胞相關的特異性蛋白質、核酸等成分。如CD34+干細胞群分泌的exosomes表達CD34蛋白分子[25]；EPCs源性MVs表達其來源細胞EPCs的特異性標志物（如CD31、CD34和VEGF受體2等），而不表達血小板相關標志物P-選擇素和CD42b以及單核細胞標志物CD14[19-24, 26-27]；此外，EPCs源性MVs還富集了EPCs的血管新生相關mRNAs和miRNAs等[19-24, 26-27]。
2 EPC-EVs的分離純化
目前，大部分研究者主要從EPCs的培養上清液（也稱條件培養基）中提取EPC-EVs[19-24, 26-27]。為了避免血清源性EVs的影響，研究者通常會在收集EPCs條件培養基的前一天更換EPCs培養基中的血清，使其在無血清狀態下生長24 h，然后再收集細胞上清液。也有少數研究者為了探究外周血中EPC-EVs的相關特性，直接從血漿標本中提取EPC-EVs[28-29]。為獲得純度較高的EPC-EVs，研究者會在分離EPC-EVs前將所得血漿標本進行離心（11 000×g、2 min或3 000×g、15 min），以去除混雜其中的大量血小板[28-29]。
現階段用于分離純化EVs的方法有差速離心法、密度梯度離心法、微孔過濾技術、免疫磁珠分選和商品化試劑盒等，其中以差速離心法最為高效[7]，成為提純EPC-EVs的常用方法。其步驟大致如下[18, 30-32]：① 收集細胞培養上清液，2 000×g離心20 min，以去除上清液中的死亡細胞和細胞碎片；② 以（10 000～20 000）×g離心30 min，得到體積較大的囊泡，即MVs；③ 將經步驟② 離心所得的上清液以100 000×g離心60 min，即得體積較小的囊泡，主要為exosomes。若想獲得較高純度的exosomes或MVs，可在離心后將沉積物用大量PBS重懸，然后重復超速離心1次，最后將所得沉積物重懸在PBS中[18, 30-32]。全程均在4℃條件下進行，所得的ex osomes或MVs置于- 80℃保存備用[18, 30-32]。值得注意的是，在與EPC-EVs相關的大量研究中，研究者將經步驟③ 所得到的囊泡稱作MVs[19-24, 26]，而非exosomes。這可能是由于研究者將MVs和exosomes的概念混淆所致。也有研究者將經100 000×g離心后所得沉積物直接稱為EVs[27]。由于經超速離心后所得exosomes的純度并不是非常高，也可能會含有一部分體積偏小的MVs[18]，因而這樣命名更準確。為此，下文綜述EPCs來源的MVs或exosomes功能時均將其統稱為EPC-EVs。
3 EPC-EVs的功能
3.1 EPC-EVs與缺血性損傷修復
組織缺血可導致相應器官功能障礙，甚至功能衰竭。EPCs移植可促進損傷區血管新生和內皮修復，從而加速組織再生和功能恢復。但細胞直接移植存在一定風險，如異常分化、血管栓塞等。近年來研究發現，EPC-EVs富集了其來源細胞EPCs的功能性RNAs，具有與EPCs類似的促血管再生和組織修復功能[19-21, 26]。
Deregibus等[24]發現人外周血源性EPC-EVs中含有與磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog）/內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）信號通路相關的mRNAs；將其與人微血管內皮細胞共同孵育一段時間后，內皮細胞的增殖活性和成血管能力增強，PI3K/Akt/eNOS信號通路被激活；若采用RNA酶作用于EPC-EVs，或采用PI3K或NOS抑制劑作用于內皮細胞后，EPC-EVs對內皮細胞的促成血管能力則明顯降低。該研究提示EPC-EVs可能通過靶向傳遞PI3K/Akt/eNOS信號通路相關mRNAs，促使原本處于靜止期的內皮細胞“獲得性”高表達該信號通路的關鍵分子，進而觸發內皮細胞的一系列促血管生成反應。近年來，已有研究者對人外周血來源的EPC-EVs在下肢缺血性損傷、腎臟缺血再灌注損傷和胰島移植后缺血缺氧性損傷中的作用進行了探究。Ranghino等[19]將EPC-EVs移植至下肢缺血的免疫缺陷型小鼠體內，發現小鼠缺血后肢的毛細血管密度和血流灌注均增加，肌肉壞死程度較用等體積內皮細胞培養基處理的對照組明顯減輕，且有明顯的肌組織再生。Cantaluppi等[20]將EPC-EVs經尾靜脈注射至腎缺血再灌注損傷的大鼠體內，發現在EPC-EVs移植后第2天，損傷大鼠的血尿素氮、血肌酐水平即出現明顯下降；組織學結果顯示，EPC-EVs可明顯增強腎小管上皮細胞和管周血管內皮細胞的增殖、自我修復和抗凋亡能力，減少損傷腎組織內炎性細胞浸潤，并能抑制損傷區腎小管周圍毛細血管減少、腎小球硬化和腎小管間質性纖維化等；此外，該研究組還發現EPC-EVs具有促進胰島移植后血管重建的能力。胰島移植后的早期缺血缺氧是導致大量胰島死亡的主要原因，因而迅速、充分的再血管化對于移植胰島的存活及功能至關重要。Cantaluppi等[21]發現EPC-EVs能促進胰島內皮細胞從胰島細胞團內爬出，并可增強其增殖、遷移、成血管和抗凋亡的能力；EPC-EVs還能干擾炎性細胞與胰島內皮細胞的黏附反應，表明EPC-EVs對內皮細胞介導的炎性反應具有抑制作用；研究者將EPC-EVs和Matrigel包裹的新鮮胰島經皮下注射至免疫缺陷型小鼠的頸背部，發現EPC-EVs可加速移植胰島的早期血管化、提高其存活能力和改善分泌功能。經進一步分析，研究者發現EPC-EVs含有與增殖、抗凋亡和血管新生密切相關的miRNAs（如miR-126和miR-296）[19-21, 26]。若在移植前先將EPCs中miRNAs合成相關基因Dicer敲除或抑制EPCs中miR-126和miR-296的表達，使其分泌的EVs不含這些miR NAs，或采用RNA酶作用于EPC-EVs后，EPC-EVs對缺血組織的修復作用則顯著減弱甚至消失[19-21, 26]，表明EPC-EVs主要通過靶向傳遞這些關鍵miRNAs發揮對缺血性損傷組織的修復功能。
3.2 EPC-EVs與系膜增生性腎炎修復
抗Thy-1腎炎又稱抗胸腺細胞血清性腎炎，是經典的系膜增生性腎炎模型，主要表現為補體依賴的系膜細胞溶解、系膜細胞異常增生、彌漫性炎性細胞浸潤和內皮細胞損傷等[33]。Cantaluppi等[27]將EPC-EVs經股靜脈注射至抗Thy-1腎炎損傷的大鼠體內，發現大鼠蛋白尿水平明顯降低，肌酐清除率顯著升高；組織學結果顯示，大鼠腎組織病理改變明顯減輕，表現為系膜細胞溶解和凋亡減少、內皮細胞損傷和炎性反應減輕等；經透射電鏡和免疫組織化學染色觀察，研究者發現EPC-EVs可抑制系膜區補體復合物的沉積和系膜細胞平滑肌肌動蛋白的表達，表明EPC-EVs可減輕系膜細胞損傷并抑制其活化；再者，EPC-EVs還可減少足細胞和內皮細胞的損傷和丟失，有助于維持腎小球濾過屏障的完整性；補體總活性測試結果表明，EPC-EVs還可明顯降低大鼠血清補體的溶血活性。然而，成纖維細胞源性EVs則沒有上述修復作用，可見EPC-EVs攜帶某些獨特成分且這些成分對EPC-EVs修復抗Thy-1腎炎不可或缺。研究者進一步探究了EPC-EVs修復抗Thy-1腎炎的機制。經成分分析，研究者發現EPC-EVs中含有促血管新生miRNAs（miR-126和miR-296）以及補體活化抑制因子（包括補體因子H、CD55和CD59）的mRNAs和蛋白質；將EPC-EVs作用于抗Thy-1抗體損傷的大鼠系膜細胞后，系膜細胞增殖、抗凋亡能力提高，補體復合物的沉積減少，補體活化抑制因子的表達水平明顯升高；而采用RNA酶作用于EPC-EVs后，上述效應則消失。由此可見，EPC-EVs富集的這些功能性物質使得其在治療補體介導的系膜增生性腎炎上具有獨特優勢。
3.3 EPC-EVs與心肌肥厚修復
心肌肥厚是心肌工作超負荷的一種適應性反應，主要表現為心肌細胞肥大、凋亡和間質細胞增生及纖維化，是多種心血管疾病的發展基礎。研究表明，局部過量血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ）可誘導心肌細胞肥大、凋亡和氧化應激損傷，進而引起心肌重構[34]。Gu等[22]報道，在Ang-Ⅱ誘導的心肌細胞肥大、凋亡反應中，小鼠骨髓源性EPC-EVs可通過向心肌細胞傳遞功能性RNAs增強心肌細胞的增殖活性和抗凋亡能力，并抑制心肌細胞活性氧的產生，而這一保護作用可能與EPC-EVs激活心肌細胞PI3K/Akt/eNOS信號通路密切相關。該研究結果表明，EPC-EVs還具有修復心肌肥厚的潛能。
3.4 EPC-EVs對心血管疾病的預測價值
外周血中EPCs數量降低可獨立預測心腦血管疾病的病程和預后[35]。研究表明，EPC-EVs也具有預測心腦血管疾病的作用[28-29]。研究者發現，外周血中EPC-EVs的水平與各種心腦血管危險因素（如高血壓、糖尿病等）成正相關[28-29]。動脈硬化通常被認為是多種心腦血管危險因素對血管壁損害的綜合表現，是血管病變的特異性和敏感性標志，臨床上常采用主動脈脈搏波傳導速度（aortic pulse wave velocity，aPWV）反映動脈硬度。Pirro等[28]發現，外周血中EPC-EVs的水平與aPWV成顯著正相關，提示EPC-EVs水平升高能預測動脈硬化進程和衡量疾病嚴重程度。糖尿病是缺血性腦卒中的一個重要危險因素。Chen等[29]發現，糖尿病小鼠外周血中EPC-EVs的基礎水平明顯偏高，并與小鼠血糖濃度和小鼠腦卒中后的梗死面積成正相關，與腦微血管密度成負相關。由此可見，EPC-EVs水平升高對腦缺血損傷的預后也具有預測作用。
值得注意的是，有研究發現當EPCs受損、凋亡時，所釋放的EVs在數量、成分和功能上有所改變。Pirro等[28]將EPCs置于過氧化氫介導的促凋亡環境或高膽固醇患者的血清中培養，發現EPCs凋亡比例和EPC-EVs生成明顯增加，表明不利刺激能加速EPC-EVs的產生。Wang等[23]報道，在普通無血清環境下培養的EPCs所分泌的EVs（starving stress，sEPC-EVs）富含血管新生相關miRNA（miR-126），而在TNF-α介導的促凋亡環境下生長的EPCs所釋放的EVs（apoptotic stress，aEPC-EVs）則富集了與細胞凋亡密切相關的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3的mRNAs；研究者將這兩種類型的EPC-EVs作用于因氧化應激損傷的人腦微血管內皮細胞，發現sEPC-EVs可抑制內皮細胞的凋亡和活性氧的產生、增強內皮細胞的成血管能力，而aEPC-EVs卻能加速內皮細胞的凋亡、加劇內皮細胞的功能障礙和氧化應激損傷。Chen等[29]發現，糖尿病小鼠外周血中的EPC-EVs可降低正常EPCs的遷移和成血管能力，減弱甚至消除EPCs對小鼠腦缺血損傷的修復作用。這些研究提示，因各種不利刺激（如高血糖、高膽固醇等）的作用而異常增多的EPC-EVs在內皮細胞損傷和功能障礙中扮演重要角色，可能成為血管相關性疾病治療的新靶點。
4 展望
EVs作為一種新發現的細胞間信息傳遞途徑，已成為當前研究熱點。然而目前有關EPC-EVs的研究尚處于初期，存在諸多問題需要進一步探究和解決。如缺乏快速、經濟、高效和標準化的分離方法和技術；EPC-EVs中富集的促血管新生miRNAs所調節的靶細胞mRNAs尚不明確；EPC-EVs靶向傳遞功能性蛋白質和RNAs時，是否具有受體細胞選擇性；靜脈注射的EPC-EVs是通過何種分子機制被募集到損傷組織；不同狀態下，EPC-EVs的形成機制是否存在差異，所含組分和功能上有哪些不同；如何清除心腦血管病患者外周血中的病理性EPC-EVs等。這些問題都需體內外實驗以及臨床研究予以解釋和證實。
內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一群存在于臍帶血、成人骨髓和外周血、能增殖分化為成熟血管內皮細胞的幼稚細胞。該類細胞不僅參與胚胎期血管生成，同時也在出生后血管新生和損傷血管修復過程中發揮關鍵作用[1]。大量動物實驗和早期臨床試驗數據表明，EPCs移植可促進機體損傷部位新生血管的形成和受損血管的再內皮化，加快組織或器官的再生和功能恢復[2-4]。近來研究發現，移植到體內的EPCs不是通過自身增殖分化為成熟內皮細胞參與血管新生和組織再生，而主要是通過旁分泌機制動員、激活內源性內皮細胞和其他相關細胞參與組織修復[1, 4-6]。
胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細胞旁分泌的生物活性物質之一，在細胞間信息傳遞過程中扮演著極為重要的角色[7-8]。在EVs的形成過程中，會選擇性地分揀、富集與來源細胞相關的蛋白質、mRNAs和微小RNAs（micro RNAs，miRNAs）等信號分子，這些信號分子在EVs與靶細胞相互作用后被釋放到靶細胞中，并在靶細胞中繼續發揮功能[7-8]。近年已有不少研究報道EVs具有類似于干/祖細胞的組織修復功能[9-11]，但目前有關EPCs源性EVs（EPC-EVs）的研究尚處于初期階段。本文主要就EPC-EVs的生物學特性、分離純化和功能方面的相關研究進行綜述。
1 EPC-EVs的生物學特性
EVs是指由細胞來源的脂質雙分子層包繞的球囊狀結構，包括微泡（microvesicles，MVs）和外泌體（exosomes），二者具有不同的生物學特征，其主要區別在于形成方式和直徑大小[7]。MVs又稱脫落小體、微粒體，早在1946年Chargaff等[12]就提出了這一概念。MVs是細胞直接由胞質膜出芽、脫落而釋放到細胞外環境中的膜性小囊泡，透射電鏡下觀察其形態不均一，直徑通常在100～1 000 nm，但也可能＞1 μm或＜100 nm[7]。1981年Trams等[13]在利用透射電鏡測量正常細胞和腫瘤細胞的MVs時，發現除了一群直徑為500～1 000 nm的小囊泡（即MVs）外，還存在另外一群更小的囊泡狀物質，其平均直徑為40 nm。6年后，Johnstone等[14]將這種直徑＜100 nm的膜性囊泡正式命名為exosomes。Ex osomes起源于細胞內多泡體（multivesicular bod ies，MVBs），在MVBs與細胞膜融合后被分泌到細胞外基質中[7, 15]；同源性exosomes形態均一、大小相近，不同來源的exosomes直徑可以不同，但基本介于40～100 nm[7, 15-17]。
然而，目前有關exosomes與MVs的命名經常混淆，有些研究者甚至將二者混為一談[18]。如關于EPCs源性MVs的研究中，有較多研究者在定義MVs時采用的是exosomes的概念，但在鑒定這些“MVs”表型時采用的不是exosomes的特定標志物，而是MVs的常規標志物，混淆了MVs和exosomes的概念和特征。這些研究分離純化所得的“MVs”直徑多為60～160 nm[19-22]，由于在該直徑范圍中的囊泡包括MVs和exosomes，故這些“MVs”很可能是兩種囊泡的混合物。也有部分研究者分離所得的EPCs源性MVs直徑在100～500 nm[23]或1 μm左右[24]，這更符合MVs的特點。目前尚無研究明確報道EPCs源性exosomes的特性，但已有研究者初步探究了CD34+干細胞群（EPCs是該干細胞群中的一類細胞）來源的exosomes的相關特點。Sahoo等[25]從成人外周血中分選出CD34+干細胞群，并在培養上清中分離得到了大量exosomes，其直徑為40～60 nm。提示人外周血源性EPCs分泌的exosomes直徑也可能在該范圍內。
除了透射電鏡觀察外，表面標志物檢測是鑒定exosomes和MVs的另一必不可少的環節。研究發現，某些蛋白質（如CD9、CD63、CD81和TSG101等）在各種細胞來源的exosomes上均有分布，它們在ex osomes的形成、釋放等過程中發揮關鍵作用[7]。因而研究者將這些蛋白質作為exosomes的通用標志物應用于相關鑒定中。然而，目前研究者尚未發現MVs表面的特定標志物，其脂質成分、膜蛋白的組成和密度還有待進一步研究[7]。現階段主要用L-選擇素、整合素α4和β1等非特異性分子作為標志物，這些分子在MVs與靶細胞的相互作用過程中扮演重要角色[7, 19-22, 24, 26-27]。研究表明，exosomes和MVs中還含有與來源細胞相關的特異性蛋白質、核酸等成分。如CD34+干細胞群分泌的exosomes表達CD34蛋白分子[25]；EPCs源性MVs表達其來源細胞EPCs的特異性標志物（如CD31、CD34和VEGF受體2等），而不表達血小板相關標志物P-選擇素和CD42b以及單核細胞標志物CD14[19-24, 26-27]；此外，EPCs源性MVs還富集了EPCs的血管新生相關mRNAs和miRNAs等[19-24, 26-27]。
2 EPC-EVs的分離純化
目前，大部分研究者主要從EPCs的培養上清液（也稱條件培養基）中提取EPC-EVs[19-24, 26-27]。為了避免血清源性EVs的影響，研究者通常會在收集EPCs條件培養基的前一天更換EPCs培養基中的血清，使其在無血清狀態下生長24 h，然后再收集細胞上清液。也有少數研究者為了探究外周血中EPC-EVs的相關特性，直接從血漿標本中提取EPC-EVs[28-29]。為獲得純度較高的EPC-EVs，研究者會在分離EPC-EVs前將所得血漿標本進行離心（11 000×g、2 min或3 000×g、15 min），以去除混雜其中的大量血小板[28-29]。
現階段用于分離純化EVs的方法有差速離心法、密度梯度離心法、微孔過濾技術、免疫磁珠分選和商品化試劑盒等，其中以差速離心法最為高效[7]，成為提純EPC-EVs的常用方法。其步驟大致如下[18, 30-32]：① 收集細胞培養上清液，2 000×g離心20 min，以去除上清液中的死亡細胞和細胞碎片；② 以（10 000～20 000）×g離心30 min，得到體積較大的囊泡，即MVs；③ 將經步驟② 離心所得的上清液以100 000×g離心60 min，即得體積較小的囊泡，主要為exosomes。若想獲得較高純度的exosomes或MVs，可在離心后將沉積物用大量PBS重懸，然后重復超速離心1次，最后將所得沉積物重懸在PBS中[18, 30-32]。全程均在4℃條件下進行，所得的ex osomes或MVs置于- 80℃保存備用[18, 30-32]。值得注意的是，在與EPC-EVs相關的大量研究中，研究者將經步驟③ 所得到的囊泡稱作MVs[19-24, 26]，而非exosomes。這可能是由于研究者將MVs和exosomes的概念混淆所致。也有研究者將經100 000×g離心后所得沉積物直接稱為EVs[27]。由于經超速離心后所得exosomes的純度并不是非常高，也可能會含有一部分體積偏小的MVs[18]，因而這樣命名更準確。為此，下文綜述EPCs來源的MVs或exosomes功能時均將其統稱為EPC-EVs。
3 EPC-EVs的功能
3.1 EPC-EVs與缺血性損傷修復
組織缺血可導致相應器官功能障礙，甚至功能衰竭。EPCs移植可促進損傷區血管新生和內皮修復，從而加速組織再生和功能恢復。但細胞直接移植存在一定風險，如異常分化、血管栓塞等。近年來研究發現，EPC-EVs富集了其來源細胞EPCs的功能性RNAs，具有與EPCs類似的促血管再生和組織修復功能[19-21, 26]。
Deregibus等[24]發現人外周血源性EPC-EVs中含有與磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog）/內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）信號通路相關的mRNAs；將其與人微血管內皮細胞共同孵育一段時間后，內皮細胞的增殖活性和成血管能力增強，PI3K/Akt/eNOS信號通路被激活；若采用RNA酶作用于EPC-EVs，或采用PI3K或NOS抑制劑作用于內皮細胞后，EPC-EVs對內皮細胞的促成血管能力則明顯降低。該研究提示EPC-EVs可能通過靶向傳遞PI3K/Akt/eNOS信號通路相關mRNAs，促使原本處于靜止期的內皮細胞“獲得性”高表達該信號通路的關鍵分子，進而觸發內皮細胞的一系列促血管生成反應。近年來，已有研究者對人外周血來源的EPC-EVs在下肢缺血性損傷、腎臟缺血再灌注損傷和胰島移植后缺血缺氧性損傷中的作用進行了探究。Ranghino等[19]將EPC-EVs移植至下肢缺血的免疫缺陷型小鼠體內，發現小鼠缺血后肢的毛細血管密度和血流灌注均增加，肌肉壞死程度較用等體積內皮細胞培養基處理的對照組明顯減輕，且有明顯的肌組織再生。Cantaluppi等[20]將EPC-EVs經尾靜脈注射至腎缺血再灌注損傷的大鼠體內，發現在EPC-EVs移植后第2天，損傷大鼠的血尿素氮、血肌酐水平即出現明顯下降；組織學結果顯示，EPC-EVs可明顯增強腎小管上皮細胞和管周血管內皮細胞的增殖、自我修復和抗凋亡能力，減少損傷腎組織內炎性細胞浸潤，并能抑制損傷區腎小管周圍毛細血管減少、腎小球硬化和腎小管間質性纖維化等；此外，該研究組還發現EPC-EVs具有促進胰島移植后血管重建的能力。胰島移植后的早期缺血缺氧是導致大量胰島死亡的主要原因，因而迅速、充分的再血管化對于移植胰島的存活及功能至關重要。Cantaluppi等[21]發現EPC-EVs能促進胰島內皮細胞從胰島細胞團內爬出，并可增強其增殖、遷移、成血管和抗凋亡的能力；EPC-EVs還能干擾炎性細胞與胰島內皮細胞的黏附反應，表明EPC-EVs對內皮細胞介導的炎性反應具有抑制作用；研究者將EPC-EVs和Matrigel包裹的新鮮胰島經皮下注射至免疫缺陷型小鼠的頸背部，發現EPC-EVs可加速移植胰島的早期血管化、提高其存活能力和改善分泌功能。經進一步分析，研究者發現EPC-EVs含有與增殖、抗凋亡和血管新生密切相關的miRNAs（如miR-126和miR-296）[19-21, 26]。若在移植前先將EPCs中miRNAs合成相關基因Dicer敲除或抑制EPCs中miR-126和miR-296的表達，使其分泌的EVs不含這些miR NAs，或采用RNA酶作用于EPC-EVs后，EPC-EVs對缺血組織的修復作用則顯著減弱甚至消失[19-21, 26]，表明EPC-EVs主要通過靶向傳遞這些關鍵miRNAs發揮對缺血性損傷組織的修復功能。
3.2 EPC-EVs與系膜增生性腎炎修復
抗Thy-1腎炎又稱抗胸腺細胞血清性腎炎，是經典的系膜增生性腎炎模型，主要表現為補體依賴的系膜細胞溶解、系膜細胞異常增生、彌漫性炎性細胞浸潤和內皮細胞損傷等[33]。Cantaluppi等[27]將EPC-EVs經股靜脈注射至抗Thy-1腎炎損傷的大鼠體內，發現大鼠蛋白尿水平明顯降低，肌酐清除率顯著升高；組織學結果顯示，大鼠腎組織病理改變明顯減輕，表現為系膜細胞溶解和凋亡減少、內皮細胞損傷和炎性反應減輕等；經透射電鏡和免疫組織化學染色觀察，研究者發現EPC-EVs可抑制系膜區補體復合物的沉積和系膜細胞平滑肌肌動蛋白的表達，表明EPC-EVs可減輕系膜細胞損傷并抑制其活化；再者，EPC-EVs還可減少足細胞和內皮細胞的損傷和丟失，有助于維持腎小球濾過屏障的完整性；補體總活性測試結果表明，EPC-EVs還可明顯降低大鼠血清補體的溶血活性。然而，成纖維細胞源性EVs則沒有上述修復作用，可見EPC-EVs攜帶某些獨特成分且這些成分對EPC-EVs修復抗Thy-1腎炎不可或缺。研究者進一步探究了EPC-EVs修復抗Thy-1腎炎的機制。經成分分析，研究者發現EPC-EVs中含有促血管新生miRNAs（miR-126和miR-296）以及補體活化抑制因子（包括補體因子H、CD55和CD59）的mRNAs和蛋白質；將EPC-EVs作用于抗Thy-1抗體損傷的大鼠系膜細胞后，系膜細胞增殖、抗凋亡能力提高，補體復合物的沉積減少，補體活化抑制因子的表達水平明顯升高；而采用RNA酶作用于EPC-EVs后，上述效應則消失。由此可見，EPC-EVs富集的這些功能性物質使得其在治療補體介導的系膜增生性腎炎上具有獨特優勢。
3.3 EPC-EVs與心肌肥厚修復
心肌肥厚是心肌工作超負荷的一種適應性反應，主要表現為心肌細胞肥大、凋亡和間質細胞增生及纖維化，是多種心血管疾病的發展基礎。研究表明，局部過量血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ）可誘導心肌細胞肥大、凋亡和氧化應激損傷，進而引起心肌重構[34]。Gu等[22]報道，在Ang-Ⅱ誘導的心肌細胞肥大、凋亡反應中，小鼠骨髓源性EPC-EVs可通過向心肌細胞傳遞功能性RNAs增強心肌細胞的增殖活性和抗凋亡能力，并抑制心肌細胞活性氧的產生，而這一保護作用可能與EPC-EVs激活心肌細胞PI3K/Akt/eNOS信號通路密切相關。該研究結果表明，EPC-EVs還具有修復心肌肥厚的潛能。
3.4 EPC-EVs對心血管疾病的預測價值
外周血中EPCs數量降低可獨立預測心腦血管疾病的病程和預后[35]。研究表明，EPC-EVs也具有預測心腦血管疾病的作用[28-29]。研究者發現，外周血中EPC-EVs的水平與各種心腦血管危險因素（如高血壓、糖尿病等）成正相關[28-29]。動脈硬化通常被認為是多種心腦血管危險因素對血管壁損害的綜合表現，是血管病變的特異性和敏感性標志，臨床上常采用主動脈脈搏波傳導速度（aortic pulse wave velocity，aPWV）反映動脈硬度。Pirro等[28]發現，外周血中EPC-EVs的水平與aPWV成顯著正相關，提示EPC-EVs水平升高能預測動脈硬化進程和衡量疾病嚴重程度。糖尿病是缺血性腦卒中的一個重要危險因素。Chen等[29]發現，糖尿病小鼠外周血中EPC-EVs的基礎水平明顯偏高，并與小鼠血糖濃度和小鼠腦卒中后的梗死面積成正相關，與腦微血管密度成負相關。由此可見，EPC-EVs水平升高對腦缺血損傷的預后也具有預測作用。
值得注意的是，有研究發現當EPCs受損、凋亡時，所釋放的EVs在數量、成分和功能上有所改變。Pirro等[28]將EPCs置于過氧化氫介導的促凋亡環境或高膽固醇患者的血清中培養，發現EPCs凋亡比例和EPC-EVs生成明顯增加，表明不利刺激能加速EPC-EVs的產生。Wang等[23]報道，在普通無血清環境下培養的EPCs所分泌的EVs（starving stress，sEPC-EVs）富含血管新生相關miRNA（miR-126），而在TNF-α介導的促凋亡環境下生長的EPCs所釋放的EVs（apoptotic stress，aEPC-EVs）則富集了與細胞凋亡密切相關的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3的mRNAs；研究者將這兩種類型的EPC-EVs作用于因氧化應激損傷的人腦微血管內皮細胞，發現sEPC-EVs可抑制內皮細胞的凋亡和活性氧的產生、增強內皮細胞的成血管能力，而aEPC-EVs卻能加速內皮細胞的凋亡、加劇內皮細胞的功能障礙和氧化應激損傷。Chen等[29]發現，糖尿病小鼠外周血中的EPC-EVs可降低正常EPCs的遷移和成血管能力，減弱甚至消除EPCs對小鼠腦缺血損傷的修復作用。這些研究提示，因各種不利刺激（如高血糖、高膽固醇等）的作用而異常增多的EPC-EVs在內皮細胞損傷和功能障礙中扮演重要角色，可能成為血管相關性疾病治療的新靶點。
4 展望
EVs作為一種新發現的細胞間信息傳遞途徑，已成為當前研究熱點。然而目前有關EPC-EVs的研究尚處于初期，存在諸多問題需要進一步探究和解決。如缺乏快速、經濟、高效和標準化的分離方法和技術；EPC-EVs中富集的促血管新生miRNAs所調節的靶細胞mRNAs尚不明確；EPC-EVs靶向傳遞功能性蛋白質和RNAs時，是否具有受體細胞選擇性；靜脈注射的EPC-EVs是通過何種分子機制被募集到損傷組織；不同狀態下，EPC-EVs的形成機制是否存在差異，所含組分和功能上有哪些不同；如何清除心腦血管病患者外周血中的病理性EPC-EVs等。這些問題都需體內外實驗以及臨床研究予以解釋和證實。