引用本文： 李雅釵, 黃向華, 張明樂, 李亞楠, 陳業星, 賈靜飛. 聚乳酸-聚羥基乙酸/Ⅰ型膠原復合支架的生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(9): 1144-1149. doi: 10.7507/1002-1892.20150248 復制
各種先天因素或手術創傷導致的陰道缺如，均需要手術重建陰道，以解決患者性生活和性角色問題。臨床常用的替代材料包括腹膜、腸管、皮瓣、羊膜、胎兒皮膚等[1-4]，均存在各自缺點，如機體損傷、免疫排斥或傳播疾病等[5]，且組織形態與正常陰道組織差異較大，難以達到理想的替代修復重建。
組織工程學的發展為重建解剖結構和形態均接近正常的人工陰道開辟了新途徑。支架材料是構建組織工程陰道的重要要素之一，它為細胞增殖提供了賴以附著的基礎，支持和調控細胞與組織的生長分化。理想的支架材料應具有良好的生物相容性和生物降解性，以適應種子細胞的黏附、生長和繁殖。材料改性是提高細胞和材料間親和性的一種方法，它是通過復合不同材料，使各種材料性能得到相互補充，從而克服單一材料存在的缺陷。
本研究通過將Ⅰ型膠原復合多聚賴氨酸包被的聚乳酸-聚羥基乙酸（poly-lactide-co-glycolide,PLGA），改善材料表面生物活性，并與大鼠陰道上皮細胞共培養，觀察材料改性后的生物相容性，為其用于組織工程陰道的構建提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10～12周齡健康清潔級雌性SD大鼠14只，體重200～250 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。PLGA（85∶15），孔徑150～250 μm，孔隙率95%，共兩種形狀，片狀大小為5.0 cm×5.0 cm× 0.2 cm，管狀內徑4 mm、外徑5 mm、長1.4 cm（山東岱罡生物有限技術公司）；Ⅰ型膠原（北京益而康生物工程開發中心）；DMEM/F12培養基、角化細胞無血清培養液（keratinocyte serum-free medium，K-SFM）、0.25%胰蛋白酶、Dispase酶（GIBCO公司，美國）；兔抗鼠廣譜角蛋白抗體（北京博奧森生物有限公司）；SP蛋白免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；多聚左旋賴氨酸（Sigma公司，美國）。CO2培養箱（Yamato公司，日本）；酶聯免疫測定儀（Bio-Tek公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 陰道上皮細胞分離培養
取2只SD大鼠斷頸處死后，置于75%乙醇浸泡20 s，注意避免乙醇進入陰道。置于超凈工作臺中，自陰道前壁向上剪開下腹部，暴露陰道。取陰道全層組織，于4℃PBS徹底清洗，置于0.6 mg/mL Dispase 酶中，4℃冰箱過夜。分離黏膜上皮層，于0.25%胰蛋白酶、37℃消化30 min，含10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，用吸管吹打后輕輕吸出細胞懸液，以離心半徑10 cm，1 000 r/ min離心5 min，棄上清，加入K-SFM，接種于一次性培養皿中；置37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。細胞融合至80%左右傳代培養。選用生長狀態良好的第2代陰道上皮細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后收集。用培養液配制成濃度為1×106 個 / mL的細胞懸液備用。
1.2.2 PLGA/Ⅰ型膠原復合支架的制備
取兩種形狀的PLGA置于70%乙醇浸泡2 h，PBS反復沖洗1 h，自然干燥后，紫外線照射24 h。將消毒后的PLGA置于0.1%多聚賴氨酸12 h，取出后自然干燥；再浸入含0.25%Ⅰ型膠原的醋酸水溶液（0.3%），震蕩混合1 h，自然干燥，無菌PBS浸泡1 h，期間換液3次，自然干燥，紫外線照射過夜。使用前浸入DMEM/F12培養液中過夜預濕。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞毒性實驗
將片狀PLGA/Ⅰ型膠原復合支架置于K-SFM中，37℃浸泡24 h獲得浸提液，過濾除菌后備用。將第2代陰道上皮細胞懸液接種于96 孔板，每孔100 μL，加入K-SFM培養液100 μL。培養24 h后，吸去培養液，加入等體積材料浸提液繼續培養（實驗組）。以不含細胞的培養基作為空白對照組，以K-SFM正常培養細胞作為陰性對照組。每隔48 h換液1次。倒置顯微鏡下觀察各組細胞生長情況。于培養后2、4、6、8 d 每組各取6孔，每孔加入5%MTT液20 μL，繼續培養4 h，吸棄上層液體，然后每孔加入150 μL DMSO。酶聯免疫測定儀測定波長490 nm處的吸光度（A）值。按照以下公式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR=（實驗組A值－空白對照組A值）/（陰性對照組A值－空白對照組A值）×100%。參照美國藥典制定的分級標準對材料細胞毒性進行分級，RGR≥100%為0級，75%～100%為1級，50%～75%為2級，25%～50%為3級，0～25%為4級。
1.3.2 細胞黏附觀察
將片狀PLGA/Ⅰ型膠原復合支架置于96 孔板底部，共8孔。將第2代陰道上皮細胞懸液接種于PLGA/Ⅰ型膠原復合支架上（實驗組），每孔100 μL，加入K-SFM培養3 h后，每孔補加K-SFM 100 μL。培養48 h后取出支架，等體積PBS沖洗，收集沖洗液，同時將培養板殘余細胞消化收集，與沖洗液混合，計數未黏附細胞。按照以下公式計算細胞黏附率，細胞黏附率=（總細胞數－未黏附細胞數）/總細胞數×100%。以單純PLGA支架接種細胞作為對照組。
1.3.3 皮下埋植實驗
取片狀PLGA/Ⅰ型膠原復合支架裁剪成0.5 cm×0.5 cm× 0.2 cm大小，將100 μL第2代陰道上皮細胞懸液緩慢滴加至支架表面，置于37℃、5%CO2培養箱培養3 h后，加入K-SFM 1 mL繼續培養，為確保支架被細胞完全覆蓋，在第2、3天同上法再接種單細胞懸液1次，第3天接種后繼續培養3 d。取6只SD大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥（1 μg/kg）麻醉后，將細胞-支架復合物植于大鼠背部皮下組織。于2、4、8周各取2只大鼠斷頸處死，取出埋植物。4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片，片厚5 μm，行HE染色和上皮細胞角蛋白免疫組織化學染色觀察。
1.3.4 體內構建組織工程陰道
① 細胞-支架復合物制備：將長度為1.4 cm的管狀PLGA/Ⅰ型膠原復合支架置于24孔板中，將第2代陰道上皮細胞懸液緩慢逐滴滴加于支架材料內側面，以細胞未從 支 架 材料上溢出為度。然后置于37℃、5%CO2培 養箱孵育2 h，添加K-SFM完全浸沒支架材料。第2、3 天再接種1次，第3天接種后繼續培養1周，備用。
② 原位移植及觀察：取6只SD大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥（1 μg/kg）麻醉后，完整切除陰道全層；將制備的細胞-支架復合物植入陰道腔穴內，外口用4號絲線“8”字縫合固定，避免脫落。檢查無活動性出血后，分籠常規飼養。術后3、6個月各取3只大鼠斷頸處死，取棉簽棍探查陰道深度后，完整切取陰道組織行大體觀察；6個月時行HE染色和上皮細胞角蛋白免疫組織化學染色觀察。以正常大鼠陰道作為對 照。
1.4 統計學方法
采用SPSLS.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞毒性實驗
倒置顯微鏡下觀察示，實驗組細胞生長情況與陰性對照組相似，培養3 d后細胞明顯增多，5 d后部分細胞連接成片，呈鋪路石樣生長（圖 1）。隨時間延長，實驗組細胞活性和增殖能力逐漸增加，8 d時略下降；培養后2、4、6、8 d RGR分別為78.4%、82.3%、91.6%、86.8%，細胞毒性為1級，提示第2代陰道上皮細胞在PLGA/Ⅰ型膠原復合支架浸提液內生長良 好。
圖1
經支架材料浸提液培養5 d時細胞形態觀察（倒置顯微鏡×100） ? ?2.2 細胞黏附觀察
培養48 h，實驗組細胞黏附率為71.8%±9.2%，顯著高于對照組的63.4%±5.7%，比較差異有統計學意義（t=2.195，P=0.005）。
2.3 皮下埋植實驗
術后2周，細胞-支架復合物尚完整，較植入前無明顯縮小，支架材料厚度無明顯變化，局部欠均勻，表面色白，偶見細小血管。HE染色可見上皮細胞充滿支架材料，并有成纖維細胞浸入生長，新生血管形成。見圖 2 a。
術后4周，細胞-支架復合物輕度降解，較植入時變薄，支架材料表面有細小血管分布。HE染色可見上皮細胞生長良好，支架材料表面部分上皮細胞呈極性排列，欠規則，有1～3層，但孔隙內的細胞較2周時減少，可見分泌的細胞外基質，支架材料部分降解，呈網狀結構。見圖 2 b。
術后8周，細胞-支架復合物較植入前縮小約50%，形狀不規則，血管較前增多，表面呈白色、光滑且有光澤。HE染色可見表面上皮細胞層次增加，呈極性排列，細胞外基質合成旺盛，部分支架材料被膠原代替。見圖 2 c。
各時間點上皮細胞角蛋白免疫組織化學染色均呈陽性（棕黃色），提示存在上皮細胞，接種至支架后細胞表型未發生明顯變化。見圖 3。
2.4 體內構建組織工程陰道
術后3個月，陰道深度約1.2 cm，陰道黏膜呈粉紅色，有光澤，支架材料大部分降解，陰道壁質韌、彈性差；6個月時，陰道深度約1.2 cm，陰道黏膜與正常陰道黏膜類似，皺襞較少，彈性好，無明顯狹窄。見圖 4。
術后6個月，HE染色示大鼠陰道組織上皮層與正常陰道無明顯差異，基底層可見釘狀突起，但數量少于正常陰道。角蛋白免疫組織化學染色呈陽性，提示存在上皮細胞。見圖 5、6。
3 討論
PLGA屬于可降解合成高分子材料，其機械性能、降解率和微結構等在生產過程中易于調控，具有適宜的孔隙率和孔徑，利于種子細胞生長，并能促進毛細血管網的形成，已成功應用于組織工程骨、軟骨、角膜和神經等的構建[6-9]。但實際應用中發現聚乳酸類材料缺少內在的生物活性、親水性差、缺乏細胞識別位點等缺陷，不利于細胞的黏附和增殖，同時其降解產物可能改變植入部位的微環境，影響細胞生長和組織修復。Ⅰ型膠原是哺乳動物體內細胞外基質的主要成分之一，具有良好的生物相容性、降解性和生物活性，并有細胞識別信號和利于細胞黏附的氨基酸序列，能促進細胞的黏附、生長及遷移。但單一膠原降解速度快，機械強度低，力學性能差，不能長期執行細胞支架功能。PLGA經Ⅰ型膠原包被后，期望在構建工程化組織過程中，既可以提供足夠強度的機械支撐，又有利于細胞的黏附生長。周炳華等[10]研究發現PLGA經多聚賴氨酸改性后再與Ⅰ型膠原復合，支架的親水性和細胞親和性顯著改 善。
目前國內學者已應用羊膜、脫細胞真皮等成功構建組織工程陰道[11-13]，De Filippo等[14]用PLGA（50∶50）包被的聚羥基乙酸作為支架材料構建組織工程陰道兔模型，取得了較好結果。本研究選擇PLGA/Ⅰ型膠原作為支架材料，探討其與陰道上皮細胞的相容性，以拓寬組織工程陰道支架材料的選擇范疇。
本研究將膠原和多聚賴氨酸通過表面涂覆法包被在PLGA材料的表面，其浸提液對陰道上皮細胞增殖無明顯影響，提示該材料在制備過程中未產生細胞毒性因素。PLGA/Ⅰ型膠原作為支架材料接種陰道上皮細胞后，細胞黏附率較單純PLGA明顯提高，細胞在材料孔隙內黏附生長，表達廣譜角蛋白。分析原因為Ⅰ型膠原富含親水基團，具有良好的生物活性和親和性，能顯著促進細胞黏附和生長，而多聚賴氨酸則可以通過共價結合氨基基團提高細胞的黏附性。另外，有研究表明材料的粗糙性會影響細胞整合，粗糙度越高，細胞的黏附增殖能力越強[15]。本研究中膠原的氨基和PLGA的羥基、羧基發生反應，使二者緊密結合，增加了PLGA表面的粗糙性，這也是細胞黏附率增高的原因之一。
生物材料相容性評價的另一重要手段是體內實驗，可以直接反映細胞-支架復合物在體內環境下的生長降解情況，具有體外實驗不能替代的優點。我們對皮下埋植的細胞-支架復合物在不同時間進行檢測，發現術后2周支架材料基本完整，孔隙內可見大量上皮細胞，有細小血管生長，提示本研究應用的片狀PLGA支架（85∶15）結構允許陰道上皮細胞進入材料內部并繼續生長，并且細胞在生長過程中分泌的某些因子能夠促進新生血管形成。移植后4 周，支架材料開始降解，上皮細胞逐漸呈極性排列，但層次極薄；8周時上皮細胞層次增加，類似陰道黏膜上皮層，初步證實有修復陰道缺損的能力。本研究采用的是多次沉淀法接種細胞，靜態培養，方法簡單易行，但是只有和材料纖維接觸的細胞才能貼附、伸展，大部分細胞只是沉積在材料纖維之間的空隙里，缺乏與材料纖維作用的機會，因此隨體內培養時間的延長，材料孔隙內部分細胞逐漸凋亡，動態觀察表現為隨時間推移，支架材料逐漸降解，孔隙內上皮細胞減少，周圍的成纖維細胞長入，參與細胞外基質形 成。
細胞-支架復合體與機體之間存在組織相容性，若植入后二者發生排斥，則修復失敗。PLGA易引起植入部位的炎性反應，本研究結果顯示皮下埋植物周圍無炎性反應，組織切片中未觀察到明顯炎性細胞浸潤，考慮原因可能為PLGA表面包被了Ⅰ型膠原，在一定程度上隔離了PLGA與周圍組織的直接接觸，多聚賴氨酸則可以中和PLGA降解時產生的酸性物質，從而使炎性反應降低。
探討支架材料與細胞相容性的最終目的是體內構建組織工程陰道，即陰道上皮細胞和支架復合后，組織尚未完全成熟時原位移植至大鼠陰道，組織形成和支架材料降解在體內同時完成。本研究進一步將細胞-支架復合物移植修復重建大鼠陰道，6個月后發現組織工程陰道的上皮接近正常大鼠陰道，平滑肌細胞排列整齊，角蛋白免疫組織化學染色亦證實陰道上皮的存在，提示在體內構建過程中，陰道上皮細胞在PLGA/Ⅰ型膠原支架材料上生長良好，向正常結構進行構建。
綜上所述，將Ⅰ型膠原和多聚賴氨酸通過表面涂覆法包被在PLGA材料的表面，在保持其高孔隙率和三維結構的同時，顯著改善了材料與陰道上皮細胞之間的親和性，無顯著細胞毒性，具有良好的組織相容性，可作為構建組織工程陰道的支架材 料。
各種先天因素或手術創傷導致的陰道缺如，均需要手術重建陰道，以解決患者性生活和性角色問題。臨床常用的替代材料包括腹膜、腸管、皮瓣、羊膜、胎兒皮膚等[1-4]，均存在各自缺點，如機體損傷、免疫排斥或傳播疾病等[5]，且組織形態與正常陰道組織差異較大，難以達到理想的替代修復重建。
組織工程學的發展為重建解剖結構和形態均接近正常的人工陰道開辟了新途徑。支架材料是構建組織工程陰道的重要要素之一，它為細胞增殖提供了賴以附著的基礎，支持和調控細胞與組織的生長分化。理想的支架材料應具有良好的生物相容性和生物降解性，以適應種子細胞的黏附、生長和繁殖。材料改性是提高細胞和材料間親和性的一種方法，它是通過復合不同材料，使各種材料性能得到相互補充，從而克服單一材料存在的缺陷。
本研究通過將Ⅰ型膠原復合多聚賴氨酸包被的聚乳酸-聚羥基乙酸（poly-lactide-co-glycolide,PLGA），改善材料表面生物活性，并與大鼠陰道上皮細胞共培養，觀察材料改性后的生物相容性，為其用于組織工程陰道的構建提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10～12周齡健康清潔級雌性SD大鼠14只，體重200～250 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。PLGA（85∶15），孔徑150～250 μm，孔隙率95%，共兩種形狀，片狀大小為5.0 cm×5.0 cm× 0.2 cm，管狀內徑4 mm、外徑5 mm、長1.4 cm（山東岱罡生物有限技術公司）；Ⅰ型膠原（北京益而康生物工程開發中心）；DMEM/F12培養基、角化細胞無血清培養液（keratinocyte serum-free medium，K-SFM）、0.25%胰蛋白酶、Dispase酶（GIBCO公司，美國）；兔抗鼠廣譜角蛋白抗體（北京博奧森生物有限公司）；SP蛋白免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；多聚左旋賴氨酸（Sigma公司，美國）。CO2培養箱（Yamato公司，日本）；酶聯免疫測定儀（Bio-Tek公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 陰道上皮細胞分離培養
取2只SD大鼠斷頸處死后，置于75%乙醇浸泡20 s，注意避免乙醇進入陰道。置于超凈工作臺中，自陰道前壁向上剪開下腹部，暴露陰道。取陰道全層組織，于4℃PBS徹底清洗，置于0.6 mg/mL Dispase 酶中，4℃冰箱過夜。分離黏膜上皮層，于0.25%胰蛋白酶、37℃消化30 min，含10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，用吸管吹打后輕輕吸出細胞懸液，以離心半徑10 cm，1 000 r/ min離心5 min，棄上清，加入K-SFM，接種于一次性培養皿中；置37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。細胞融合至80%左右傳代培養。選用生長狀態良好的第2代陰道上皮細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后收集。用培養液配制成濃度為1×106 個 / mL的細胞懸液備用。
1.2.2 PLGA/Ⅰ型膠原復合支架的制備
取兩種形狀的PLGA置于70%乙醇浸泡2 h，PBS反復沖洗1 h，自然干燥后，紫外線照射24 h。將消毒后的PLGA置于0.1%多聚賴氨酸12 h，取出后自然干燥；再浸入含0.25%Ⅰ型膠原的醋酸水溶液（0.3%），震蕩混合1 h，自然干燥，無菌PBS浸泡1 h，期間換液3次，自然干燥，紫外線照射過夜。使用前浸入DMEM/F12培養液中過夜預濕。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞毒性實驗
將片狀PLGA/Ⅰ型膠原復合支架置于K-SFM中，37℃浸泡24 h獲得浸提液，過濾除菌后備用。將第2代陰道上皮細胞懸液接種于96 孔板，每孔100 μL，加入K-SFM培養液100 μL。培養24 h后，吸去培養液，加入等體積材料浸提液繼續培養（實驗組）。以不含細胞的培養基作為空白對照組，以K-SFM正常培養細胞作為陰性對照組。每隔48 h換液1次。倒置顯微鏡下觀察各組細胞生長情況。于培養后2、4、6、8 d 每組各取6孔，每孔加入5%MTT液20 μL，繼續培養4 h，吸棄上層液體，然后每孔加入150 μL DMSO。酶聯免疫測定儀測定波長490 nm處的吸光度（A）值。按照以下公式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR=（實驗組A值－空白對照組A值）/（陰性對照組A值－空白對照組A值）×100%。參照美國藥典制定的分級標準對材料細胞毒性進行分級，RGR≥100%為0級，75%～100%為1級，50%～75%為2級，25%～50%為3級，0～25%為4級。
1.3.2 細胞黏附觀察
將片狀PLGA/Ⅰ型膠原復合支架置于96 孔板底部，共8孔。將第2代陰道上皮細胞懸液接種于PLGA/Ⅰ型膠原復合支架上（實驗組），每孔100 μL，加入K-SFM培養3 h后，每孔補加K-SFM 100 μL。培養48 h后取出支架，等體積PBS沖洗，收集沖洗液，同時將培養板殘余細胞消化收集，與沖洗液混合，計數未黏附細胞。按照以下公式計算細胞黏附率，細胞黏附率=（總細胞數－未黏附細胞數）/總細胞數×100%。以單純PLGA支架接種細胞作為對照組。
1.3.3 皮下埋植實驗
取片狀PLGA/Ⅰ型膠原復合支架裁剪成0.5 cm×0.5 cm× 0.2 cm大小，將100 μL第2代陰道上皮細胞懸液緩慢滴加至支架表面，置于37℃、5%CO2培養箱培養3 h后，加入K-SFM 1 mL繼續培養，為確保支架被細胞完全覆蓋，在第2、3天同上法再接種單細胞懸液1次，第3天接種后繼續培養3 d。取6只SD大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥（1 μg/kg）麻醉后，將細胞-支架復合物植于大鼠背部皮下組織。于2、4、8周各取2只大鼠斷頸處死，取出埋植物。4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，切片，片厚5 μm，行HE染色和上皮細胞角蛋白免疫組織化學染色觀察。
1.3.4 體內構建組織工程陰道
① 細胞-支架復合物制備：將長度為1.4 cm的管狀PLGA/Ⅰ型膠原復合支架置于24孔板中，將第2代陰道上皮細胞懸液緩慢逐滴滴加于支架材料內側面，以細胞未從 支 架 材料上溢出為度。然后置于37℃、5%CO2培 養箱孵育2 h，添加K-SFM完全浸沒支架材料。第2、3 天再接種1次，第3天接種后繼續培養1周，備用。
② 原位移植及觀察：取6只SD大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥（1 μg/kg）麻醉后，完整切除陰道全層；將制備的細胞-支架復合物植入陰道腔穴內，外口用4號絲線“8”字縫合固定，避免脫落。檢查無活動性出血后，分籠常規飼養。術后3、6個月各取3只大鼠斷頸處死，取棉簽棍探查陰道深度后，完整切取陰道組織行大體觀察；6個月時行HE染色和上皮細胞角蛋白免疫組織化學染色觀察。以正常大鼠陰道作為對 照。
1.4 統計學方法
采用SPSLS.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞毒性實驗
倒置顯微鏡下觀察示，實驗組細胞生長情況與陰性對照組相似，培養3 d后細胞明顯增多，5 d后部分細胞連接成片，呈鋪路石樣生長（圖 1）。隨時間延長，實驗組細胞活性和增殖能力逐漸增加，8 d時略下降；培養后2、4、6、8 d RGR分別為78.4%、82.3%、91.6%、86.8%，細胞毒性為1級，提示第2代陰道上皮細胞在PLGA/Ⅰ型膠原復合支架浸提液內生長良 好。
圖1
經支架材料浸提液培養5 d時細胞形態觀察（倒置顯微鏡×100） ? ?2.2 細胞黏附觀察
培養48 h，實驗組細胞黏附率為71.8%±9.2%，顯著高于對照組的63.4%±5.7%，比較差異有統計學意義（t=2.195，P=0.005）。
2.3 皮下埋植實驗
術后2周，細胞-支架復合物尚完整，較植入前無明顯縮小，支架材料厚度無明顯變化，局部欠均勻，表面色白，偶見細小血管。HE染色可見上皮細胞充滿支架材料，并有成纖維細胞浸入生長，新生血管形成。見圖 2 a。
術后4周，細胞-支架復合物輕度降解，較植入時變薄，支架材料表面有細小血管分布。HE染色可見上皮細胞生長良好，支架材料表面部分上皮細胞呈極性排列，欠規則，有1～3層，但孔隙內的細胞較2周時減少，可見分泌的細胞外基質，支架材料部分降解，呈網狀結構。見圖 2 b。
術后8周，細胞-支架復合物較植入前縮小約50%，形狀不規則，血管較前增多，表面呈白色、光滑且有光澤。HE染色可見表面上皮細胞層次增加，呈極性排列，細胞外基質合成旺盛，部分支架材料被膠原代替。見圖 2 c。
各時間點上皮細胞角蛋白免疫組織化學染色均呈陽性（棕黃色），提示存在上皮細胞，接種至支架后細胞表型未發生明顯變化。見圖 3。
2.4 體內構建組織工程陰道
術后3個月，陰道深度約1.2 cm，陰道黏膜呈粉紅色，有光澤，支架材料大部分降解，陰道壁質韌、彈性差；6個月時，陰道深度約1.2 cm，陰道黏膜與正常陰道黏膜類似，皺襞較少，彈性好，無明顯狹窄。見圖 4。
術后6個月，HE染色示大鼠陰道組織上皮層與正常陰道無明顯差異，基底層可見釘狀突起，但數量少于正常陰道。角蛋白免疫組織化學染色呈陽性，提示存在上皮細胞。見圖 5、6。
3 討論
PLGA屬于可降解合成高分子材料，其機械性能、降解率和微結構等在生產過程中易于調控，具有適宜的孔隙率和孔徑，利于種子細胞生長，并能促進毛細血管網的形成，已成功應用于組織工程骨、軟骨、角膜和神經等的構建[6-9]。但實際應用中發現聚乳酸類材料缺少內在的生物活性、親水性差、缺乏細胞識別位點等缺陷，不利于細胞的黏附和增殖，同時其降解產物可能改變植入部位的微環境，影響細胞生長和組織修復。Ⅰ型膠原是哺乳動物體內細胞外基質的主要成分之一，具有良好的生物相容性、降解性和生物活性，并有細胞識別信號和利于細胞黏附的氨基酸序列，能促進細胞的黏附、生長及遷移。但單一膠原降解速度快，機械強度低，力學性能差，不能長期執行細胞支架功能。PLGA經Ⅰ型膠原包被后，期望在構建工程化組織過程中，既可以提供足夠強度的機械支撐，又有利于細胞的黏附生長。周炳華等[10]研究發現PLGA經多聚賴氨酸改性后再與Ⅰ型膠原復合，支架的親水性和細胞親和性顯著改 善。
目前國內學者已應用羊膜、脫細胞真皮等成功構建組織工程陰道[11-13]，De Filippo等[14]用PLGA（50∶50）包被的聚羥基乙酸作為支架材料構建組織工程陰道兔模型，取得了較好結果。本研究選擇PLGA/Ⅰ型膠原作為支架材料，探討其與陰道上皮細胞的相容性，以拓寬組織工程陰道支架材料的選擇范疇。
本研究將膠原和多聚賴氨酸通過表面涂覆法包被在PLGA材料的表面，其浸提液對陰道上皮細胞增殖無明顯影響，提示該材料在制備過程中未產生細胞毒性因素。PLGA/Ⅰ型膠原作為支架材料接種陰道上皮細胞后，細胞黏附率較單純PLGA明顯提高，細胞在材料孔隙內黏附生長，表達廣譜角蛋白。分析原因為Ⅰ型膠原富含親水基團，具有良好的生物活性和親和性，能顯著促進細胞黏附和生長，而多聚賴氨酸則可以通過共價結合氨基基團提高細胞的黏附性。另外，有研究表明材料的粗糙性會影響細胞整合，粗糙度越高，細胞的黏附增殖能力越強[15]。本研究中膠原的氨基和PLGA的羥基、羧基發生反應，使二者緊密結合，增加了PLGA表面的粗糙性，這也是細胞黏附率增高的原因之一。
生物材料相容性評價的另一重要手段是體內實驗，可以直接反映細胞-支架復合物在體內環境下的生長降解情況，具有體外實驗不能替代的優點。我們對皮下埋植的細胞-支架復合物在不同時間進行檢測，發現術后2周支架材料基本完整，孔隙內可見大量上皮細胞，有細小血管生長，提示本研究應用的片狀PLGA支架（85∶15）結構允許陰道上皮細胞進入材料內部并繼續生長，并且細胞在生長過程中分泌的某些因子能夠促進新生血管形成。移植后4 周，支架材料開始降解，上皮細胞逐漸呈極性排列，但層次極薄；8周時上皮細胞層次增加，類似陰道黏膜上皮層，初步證實有修復陰道缺損的能力。本研究采用的是多次沉淀法接種細胞，靜態培養，方法簡單易行，但是只有和材料纖維接觸的細胞才能貼附、伸展，大部分細胞只是沉積在材料纖維之間的空隙里，缺乏與材料纖維作用的機會，因此隨體內培養時間的延長，材料孔隙內部分細胞逐漸凋亡，動態觀察表現為隨時間推移，支架材料逐漸降解，孔隙內上皮細胞減少，周圍的成纖維細胞長入，參與細胞外基質形 成。
細胞-支架復合體與機體之間存在組織相容性，若植入后二者發生排斥，則修復失敗。PLGA易引起植入部位的炎性反應，本研究結果顯示皮下埋植物周圍無炎性反應，組織切片中未觀察到明顯炎性細胞浸潤，考慮原因可能為PLGA表面包被了Ⅰ型膠原，在一定程度上隔離了PLGA與周圍組織的直接接觸，多聚賴氨酸則可以中和PLGA降解時產生的酸性物質，從而使炎性反應降低。
探討支架材料與細胞相容性的最終目的是體內構建組織工程陰道，即陰道上皮細胞和支架復合后，組織尚未完全成熟時原位移植至大鼠陰道，組織形成和支架材料降解在體內同時完成。本研究進一步將細胞-支架復合物移植修復重建大鼠陰道，6個月后發現組織工程陰道的上皮接近正常大鼠陰道，平滑肌細胞排列整齊，角蛋白免疫組織化學染色亦證實陰道上皮的存在，提示在體內構建過程中，陰道上皮細胞在PLGA/Ⅰ型膠原支架材料上生長良好，向正常結構進行構建。
綜上所述，將Ⅰ型膠原和多聚賴氨酸通過表面涂覆法包被在PLGA材料的表面，在保持其高孔隙率和三維結構的同時，顯著改善了材料與陰道上皮細胞之間的親和性，無顯著細胞毒性，具有良好的組織相容性，可作為構建組織工程陰道的支架材 料。
