引用本文： 陳家磊, 項舟. 生物因子控釋技術在軟骨修復領域的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(8): 1034-1037. doi: 10.7507/1002-1892.20150220 復制
多種生物因子已被證實在關節軟骨修復領域具有重要作用[1]。隨著對其作用機制的不斷研究，從簡單的在缺損處注射[2]到應用更為復雜的控釋技術[3]，從單一因子[4]到多種因子聯合應用[5]，軟骨修復生物因子的應用技術也在飛速發展。其中，控釋技術因具有可控性和精細化等特點，成為關節軟骨修復領域研究的熱點之一。本文將就這一熱點研究作一綜述。
1 軟骨修復生物因子
1.1 生長因子
生長因子是一類通過細胞間信號傳遞影響細胞活動的多肽類分子，目前對其研究較多。它對細胞具有促進分裂、增殖和分化的作用，主要包括TGF-超家族、IGF-1以及bFGF家族等[6]。其中，TGF-超家族中對軟骨修復有重要意義的因子有TGF-1、2、3，BMP-2、4、7以及生長分化因子5。TGF-1、2、3被認為可增加Sox-9的表達和軟骨細胞外基質生成，同時還可促進軟骨細胞的合成能力[7]；BMP具有同TGF相似的作用，同時它還具有促進MSCs成軟骨分化的作用[8]。IGF-1和bFGF對維持軟骨細胞穩態，平衡其蛋白多糖生成和降解方面都具有重要作用。IGF-1可減少細胞外基質的分解代謝、增加合成代謝，而bFGF具有促進MSCs和軟骨細胞有絲分裂的作用[9]。
1.2 抗血管生成因子
關節軟骨由上層的軟骨層和下層的軟骨下骨層構成，軟骨層是無血供、無神經支配的細胞層，而軟骨下骨層則有血供支配。由于在關節軟骨全層損傷修復中，軟骨下骨層中的成血管過程也同時被誘發，這一過程并不適合軟骨層中軟骨細胞修復所需的低氧環境[10]。因此，近年來抗血管生成因子逐漸成為軟骨修復領域的研究熱點之一。抗血管生成因子包括內皮他丁、舒拉明、Flt-1和貝伐單抗等，具有抑制血管生成、抑制VEGF和維持軟骨組織無血供狀態的作用，而抗血管生成因子對軟骨損傷模型的修復效果則仍需進行深入研究[11-13]。
1.3 富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）
PRP是一種富含BMP、FGF、PDGF、IGF、TGF和VEGF等多種生長因子的人體血液提取物。有研究表明[14]PRP對關節軟骨陳舊性損傷和急性損傷均有修復作用。Sundman等[15]發現PRP可減少TNF-α和基質金屬蛋白酶13等炎性因子的基因表達，同時增加內源性透明質酸的生成。這顯示了PRP可一方面通過抑制炎性信號來減少軟骨降解，另一方面則誘導新生軟骨生成。在臨床實踐中也證實將PRP注射至骨關節炎患者膝關節中，可改善關節疼痛和僵硬癥狀[16]。但目前對PRP修復軟骨的作用機制仍不明確，需進一步研究。
2 控釋方式
組織工程軟骨要求將細胞培養、生物支架材料和生物因子三者結合，但目前在細胞選擇、支架制作、生物因子的有效調控等諸多方面均需要深入研究。其中一個重要課題就是外源性生物因子在體內半衰期短，需在一定時間及范圍內持續維持有效濃度和活性，才能有利于細胞增殖和分化。目前，有多種控釋方式被用于軟骨組織工程中，這些方式各有特點，現分述如下。
2.1 生物因子與支架材料結合
將生物因子與可降解三維支架材料結合，隨著支架材料的逐步降解，生長因子得以向周圍組織持續釋放，并促進細胞在支架材料中增殖。這種方式主要是通過生物因子與支架材料間的作用關系產生的，包括包埋、靜電吸引、氫鍵結合以及表位親和等。同時，因為這些作用關系的作用力不同，造成生物因子釋放曲線也不同[17-19]。Yang等[20]研究發現在修復兔關節軟骨損傷模型時，BMP-2在結合肝素的纖維蛋白凝膠中釋放持續而穩定，而在普通纖維蛋白凝膠中則有較大的突釋率；相應地，BMP-2長期釋放比短期釋放產生了更多的軟骨組織。這可能是因為BMP-2在前者中與肝素產生了靜電吸引作用，而在后者中僅僅是包埋作用。所以，如果采用包埋方式，往往早期突釋較多，需通過調節支架交聯反應時間和交聯程度來調整孔隙率和孔徑大小，使生長因子可以以不同速率釋放，達到控釋目的。目前有研究者發明一種新型光敏降解材料o-NB（ortho-nitrobenzyl），這種材料可被設計成支架，結合諸如氨類、生物素、羧酸等活性物質，并根據光敏性設計不同降解率，以達到對這些物質的控釋[21]。另外，不同的支架設計也可使生物因子定向釋放。Li等[22]設計了一種3層支架結構，上層為致密膠原層，下層為疏松膠原層，中間為負載生長因子的納米粒層，由于結構的密度不同，中間層生長因子只向下層釋放，而不向上層釋放，從而使下層具有更好的細胞黏附力和組織修復力。
2.2 微粒與納米粒的控釋
通過微粒與納米粒控釋生物因子是另一種常用方式。微粒和納米粒可作為分散相植入連續相（如固態聚合物或水凝膠）中，可通過負載生物活性因子、改變孔隙率、機械強度或載細胞作用等改善該合成物的理化性質和生物特性，就可控制不同生長因子的緩釋曲線，從而實現不同生長因子的順序控釋。Richardson等[23]使用不同表面共價修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactide-co-glycolide），PLGA]微球分別負載VEGF和PDGF，實現了2種生長因子的順序控釋。微粒與納米粒的優勢在于其粒徑小，相同體積下較普通支架材料具備更大的表面積和更高的載藥率。Jiang等[24]將硫酸軟骨素按不同比例加入到PLGA中并制成不同大小的微球，發現PLGA微球的直徑和孔隙率影響硫酸軟骨素的載藥率和釋放率，隨著微球直徑在75～150 μm至300～ 355 μm間增大，微球的初始釋放率不斷降低，而更大的直徑則會增加初始釋放率。研究者可利用這一特性模擬體內真實環境，控制生長因子釋放。另外，微球還可根據外界刺激作為生長因子或化學活性分子的刺激敏感突釋載體。Westhaus等[25]將脂質體微球整合入藻酸鹽顆粒中制成熱敏感脂質體微球，這種微球載荷鈣離子，可在37℃時突然釋放鈣離子。在室溫下這種微球具有良好的流動性，但在體內可迅速凝膠化，可作為可注射細胞載體的理想材料。目前，納米粒正逐漸獲得研究者的關注。Santo等[26]發現納米粒可通過胞吞作用進入細胞，從而在細胞中累積生物因子；另外，更大的表面積容積率也可增大納米粒對生物因子的包封率和載藥率。但是，這一特性也使納米粒在制備過程中穩定性降低，往往使一部分納米粒聚合成為微粒，從而削弱其優勢。
3 多種生物因子的控釋
3.1 多種生物因子聯合應用
軟骨修復是一極其復雜的過程，涉及到上述多種生物因子的協調參與并激活多條信號通路，而單一因子的作用幾乎不可能同時刺激這些信號通路。所以，研究多種生物因子的控釋系統是達到更佳軟骨修復效果的必然選擇。這些控釋系統被大體分為兩種，一種是多相支架中負載持續釋放的生長因子，另一種是生長因子從某種儲存器（比如微球）中的定向釋放。Dormer等[27]制備支架模擬軟骨組織的分層結構，在這些支架材料的不同層次中引入不同生物因子誘導MSCs分別向成軟骨和成骨兩個方向分化，相對應地修復軟骨層和軟骨下骨層。另一方面，由于關節微環境的復雜性，當應用多種生物因子時，應盡量把具有不同生物學活性的因子聯合起來，以達到模擬真實關節微環境的目的。Bian等[28]將載負TGF-3的藻酸鹽微球與包含人MSCs的透明質酸凝膠共培養后植于裸鼠皮下，8周后觀察發現形成了鈣化現象，但其在微球中加入甲狀旁腺激素相關蛋白后，上述鈣化現象明顯減少。Emans等[12]在修復軟骨損傷模型時，將抗血管生成因子舒拉明同軟骨生長因子TGF-1聯合應用，發現軟骨層生成透明軟骨而非纖維軟骨。同時，Lim等[29]發現BMP-7和TGF-2從水凝膠相的釋放不同于從納米球中釋放，其在前者的釋放會更加緩慢。這一現象也提示在多因子釋放體系中，不同因子間存在潛在的相互影響。
3.2 多種生物因子的序貫應用
多種生物因子在修復軟骨過程的不同時期也在不斷變化。為了更好地模擬真實關節微環境，多種生長因子可根據需要按一定順序進行釋放。Jaklenec等[30]制備不同的PLGA微球分別負載TGF-1和IGF-1，發現先釋放TGF-1可以刺激前體細胞代謝因子的合成，然后釋放IGF-1可以增加軟骨基質的生成。目前，還有一種自組裝多肽類材料因其獨特的設計及良好的生物相容性和可降解性，在眾多三維支架材料中脫穎而出；自組裝多肽以短肽為基本組成單元，通過生物素-抗生蛋白鏈菌素聯結或多肽支架吸收等不同方式，并根據需求復合不同的生物活性分子，賦予該類材料“生物智能”的特性，使材料兼具生物活性和生物安全性；在由功能化自組裝多肽構建的三維環境內，細胞能夠有更多機會與功能片段接觸，并受到外部信號的調控作用，為細胞提供一個高度仿生的三維微環境；另外，其凝膠化過程是通過改變離子間作用力完成，無需改變溫度或添加化學交聯劑，這是實現細胞三維培養的必要條件，且自組裝多肽可高度模擬細胞外基質含水量高的特點，利于營養和代謝物質的流通[31]。Kopesky等[32]利用自組裝多肽凝膠復合TGF-1，通過調控Smad2/3信號通路誘導BMSCs向軟骨細胞分化；研究還顯示TGF-1實驗組（自組裝多肽凝膠復合TGF-1）細胞培養4 d時，BMSCs在新生血清產生的蛋白多糖含量是空白對照組（無TGF-1生長因子）細胞培養3周時產生蛋白多糖含量的10倍。這說明負載TGF-1的自組裝多肽凝膠可有效促進BMSCs向軟骨細胞分化。
4 展望
近年來，生物因子控釋技術在軟骨修復領域的應用前景越來越廣闊，軟骨組織工程正朝著可控、三維、多向誘導等方向發展，但目前仍面臨許多未解決的問題：生物因子在體外半衰期較短，無法形成持續作用效果；生物因子對于軟骨細胞或其前體細胞的作用機制仍不明確；對不同控釋技術之間的軟骨修復效果尚缺乏統一而標準的評價體系，其臨床應用還較少。因此，我們期望通過不斷探索和完善，使生物因子控釋技術在軟骨修復領域得到更廣泛的應 用。
多種生物因子已被證實在關節軟骨修復領域具有重要作用[1]。隨著對其作用機制的不斷研究，從簡單的在缺損處注射[2]到應用更為復雜的控釋技術[3]，從單一因子[4]到多種因子聯合應用[5]，軟骨修復生物因子的應用技術也在飛速發展。其中，控釋技術因具有可控性和精細化等特點，成為關節軟骨修復領域研究的熱點之一。本文將就這一熱點研究作一綜述。
1 軟骨修復生物因子
1.1 生長因子
生長因子是一類通過細胞間信號傳遞影響細胞活動的多肽類分子，目前對其研究較多。它對細胞具有促進分裂、增殖和分化的作用，主要包括TGF-超家族、IGF-1以及bFGF家族等[6]。其中，TGF-超家族中對軟骨修復有重要意義的因子有TGF-1、2、3，BMP-2、4、7以及生長分化因子5。TGF-1、2、3被認為可增加Sox-9的表達和軟骨細胞外基質生成，同時還可促進軟骨細胞的合成能力[7]；BMP具有同TGF相似的作用，同時它還具有促進MSCs成軟骨分化的作用[8]。IGF-1和bFGF對維持軟骨細胞穩態，平衡其蛋白多糖生成和降解方面都具有重要作用。IGF-1可減少細胞外基質的分解代謝、增加合成代謝，而bFGF具有促進MSCs和軟骨細胞有絲分裂的作用[9]。
1.2 抗血管生成因子
關節軟骨由上層的軟骨層和下層的軟骨下骨層構成，軟骨層是無血供、無神經支配的細胞層，而軟骨下骨層則有血供支配。由于在關節軟骨全層損傷修復中，軟骨下骨層中的成血管過程也同時被誘發，這一過程并不適合軟骨層中軟骨細胞修復所需的低氧環境[10]。因此，近年來抗血管生成因子逐漸成為軟骨修復領域的研究熱點之一。抗血管生成因子包括內皮他丁、舒拉明、Flt-1和貝伐單抗等，具有抑制血管生成、抑制VEGF和維持軟骨組織無血供狀態的作用，而抗血管生成因子對軟骨損傷模型的修復效果則仍需進行深入研究[11-13]。
1.3 富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）
PRP是一種富含BMP、FGF、PDGF、IGF、TGF和VEGF等多種生長因子的人體血液提取物。有研究表明[14]PRP對關節軟骨陳舊性損傷和急性損傷均有修復作用。Sundman等[15]發現PRP可減少TNF-α和基質金屬蛋白酶13等炎性因子的基因表達，同時增加內源性透明質酸的生成。這顯示了PRP可一方面通過抑制炎性信號來減少軟骨降解，另一方面則誘導新生軟骨生成。在臨床實踐中也證實將PRP注射至骨關節炎患者膝關節中，可改善關節疼痛和僵硬癥狀[16]。但目前對PRP修復軟骨的作用機制仍不明確，需進一步研究。
2 控釋方式
組織工程軟骨要求將細胞培養、生物支架材料和生物因子三者結合，但目前在細胞選擇、支架制作、生物因子的有效調控等諸多方面均需要深入研究。其中一個重要課題就是外源性生物因子在體內半衰期短，需在一定時間及范圍內持續維持有效濃度和活性，才能有利于細胞增殖和分化。目前，有多種控釋方式被用于軟骨組織工程中，這些方式各有特點，現分述如下。
2.1 生物因子與支架材料結合
將生物因子與可降解三維支架材料結合，隨著支架材料的逐步降解，生長因子得以向周圍組織持續釋放，并促進細胞在支架材料中增殖。這種方式主要是通過生物因子與支架材料間的作用關系產生的，包括包埋、靜電吸引、氫鍵結合以及表位親和等。同時，因為這些作用關系的作用力不同，造成生物因子釋放曲線也不同[17-19]。Yang等[20]研究發現在修復兔關節軟骨損傷模型時，BMP-2在結合肝素的纖維蛋白凝膠中釋放持續而穩定，而在普通纖維蛋白凝膠中則有較大的突釋率；相應地，BMP-2長期釋放比短期釋放產生了更多的軟骨組織。這可能是因為BMP-2在前者中與肝素產生了靜電吸引作用，而在后者中僅僅是包埋作用。所以，如果采用包埋方式，往往早期突釋較多，需通過調節支架交聯反應時間和交聯程度來調整孔隙率和孔徑大小，使生長因子可以以不同速率釋放，達到控釋目的。目前有研究者發明一種新型光敏降解材料o-NB（ortho-nitrobenzyl），這種材料可被設計成支架，結合諸如氨類、生物素、羧酸等活性物質，并根據光敏性設計不同降解率，以達到對這些物質的控釋[21]。另外，不同的支架設計也可使生物因子定向釋放。Li等[22]設計了一種3層支架結構，上層為致密膠原層，下層為疏松膠原層，中間為負載生長因子的納米粒層，由于結構的密度不同，中間層生長因子只向下層釋放，而不向上層釋放，從而使下層具有更好的細胞黏附力和組織修復力。
2.2 微粒與納米粒的控釋
通過微粒與納米粒控釋生物因子是另一種常用方式。微粒和納米粒可作為分散相植入連續相（如固態聚合物或水凝膠）中，可通過負載生物活性因子、改變孔隙率、機械強度或載細胞作用等改善該合成物的理化性質和生物特性，就可控制不同生長因子的緩釋曲線，從而實現不同生長因子的順序控釋。Richardson等[23]使用不同表面共價修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactide-co-glycolide），PLGA]微球分別負載VEGF和PDGF，實現了2種生長因子的順序控釋。微粒與納米粒的優勢在于其粒徑小，相同體積下較普通支架材料具備更大的表面積和更高的載藥率。Jiang等[24]將硫酸軟骨素按不同比例加入到PLGA中并制成不同大小的微球，發現PLGA微球的直徑和孔隙率影響硫酸軟骨素的載藥率和釋放率，隨著微球直徑在75～150 μm至300～ 355 μm間增大，微球的初始釋放率不斷降低，而更大的直徑則會增加初始釋放率。研究者可利用這一特性模擬體內真實環境，控制生長因子釋放。另外，微球還可根據外界刺激作為生長因子或化學活性分子的刺激敏感突釋載體。Westhaus等[25]將脂質體微球整合入藻酸鹽顆粒中制成熱敏感脂質體微球，這種微球載荷鈣離子，可在37℃時突然釋放鈣離子。在室溫下這種微球具有良好的流動性，但在體內可迅速凝膠化，可作為可注射細胞載體的理想材料。目前，納米粒正逐漸獲得研究者的關注。Santo等[26]發現納米粒可通過胞吞作用進入細胞，從而在細胞中累積生物因子；另外，更大的表面積容積率也可增大納米粒對生物因子的包封率和載藥率。但是，這一特性也使納米粒在制備過程中穩定性降低，往往使一部分納米粒聚合成為微粒，從而削弱其優勢。
3 多種生物因子的控釋
3.1 多種生物因子聯合應用
軟骨修復是一極其復雜的過程，涉及到上述多種生物因子的協調參與并激活多條信號通路，而單一因子的作用幾乎不可能同時刺激這些信號通路。所以，研究多種生物因子的控釋系統是達到更佳軟骨修復效果的必然選擇。這些控釋系統被大體分為兩種，一種是多相支架中負載持續釋放的生長因子，另一種是生長因子從某種儲存器（比如微球）中的定向釋放。Dormer等[27]制備支架模擬軟骨組織的分層結構，在這些支架材料的不同層次中引入不同生物因子誘導MSCs分別向成軟骨和成骨兩個方向分化，相對應地修復軟骨層和軟骨下骨層。另一方面，由于關節微環境的復雜性，當應用多種生物因子時，應盡量把具有不同生物學活性的因子聯合起來，以達到模擬真實關節微環境的目的。Bian等[28]將載負TGF-3的藻酸鹽微球與包含人MSCs的透明質酸凝膠共培養后植于裸鼠皮下，8周后觀察發現形成了鈣化現象，但其在微球中加入甲狀旁腺激素相關蛋白后，上述鈣化現象明顯減少。Emans等[12]在修復軟骨損傷模型時，將抗血管生成因子舒拉明同軟骨生長因子TGF-1聯合應用，發現軟骨層生成透明軟骨而非纖維軟骨。同時，Lim等[29]發現BMP-7和TGF-2從水凝膠相的釋放不同于從納米球中釋放，其在前者的釋放會更加緩慢。這一現象也提示在多因子釋放體系中，不同因子間存在潛在的相互影響。
3.2 多種生物因子的序貫應用
多種生物因子在修復軟骨過程的不同時期也在不斷變化。為了更好地模擬真實關節微環境，多種生長因子可根據需要按一定順序進行釋放。Jaklenec等[30]制備不同的PLGA微球分別負載TGF-1和IGF-1，發現先釋放TGF-1可以刺激前體細胞代謝因子的合成，然后釋放IGF-1可以增加軟骨基質的生成。目前，還有一種自組裝多肽類材料因其獨特的設計及良好的生物相容性和可降解性，在眾多三維支架材料中脫穎而出；自組裝多肽以短肽為基本組成單元，通過生物素-抗生蛋白鏈菌素聯結或多肽支架吸收等不同方式，并根據需求復合不同的生物活性分子，賦予該類材料“生物智能”的特性，使材料兼具生物活性和生物安全性；在由功能化自組裝多肽構建的三維環境內，細胞能夠有更多機會與功能片段接觸，并受到外部信號的調控作用，為細胞提供一個高度仿生的三維微環境；另外，其凝膠化過程是通過改變離子間作用力完成，無需改變溫度或添加化學交聯劑，這是實現細胞三維培養的必要條件，且自組裝多肽可高度模擬細胞外基質含水量高的特點，利于營養和代謝物質的流通[31]。Kopesky等[32]利用自組裝多肽凝膠復合TGF-1，通過調控Smad2/3信號通路誘導BMSCs向軟骨細胞分化；研究還顯示TGF-1實驗組（自組裝多肽凝膠復合TGF-1）細胞培養4 d時，BMSCs在新生血清產生的蛋白多糖含量是空白對照組（無TGF-1生長因子）細胞培養3周時產生蛋白多糖含量的10倍。這說明負載TGF-1的自組裝多肽凝膠可有效促進BMSCs向軟骨細胞分化。
4 展望
近年來，生物因子控釋技術在軟骨修復領域的應用前景越來越廣闊，軟骨組織工程正朝著可控、三維、多向誘導等方向發展，但目前仍面臨許多未解決的問題：生物因子在體外半衰期較短，無法形成持續作用效果；生物因子對于軟骨細胞或其前體細胞的作用機制仍不明確；對不同控釋技術之間的軟骨修復效果尚缺乏統一而標準的評價體系，其臨床應用還較少。因此，我們期望通過不斷探索和完善，使生物因子控釋技術在軟骨修復領域得到更廣泛的應 用。