引用本文： 張舒, 羅靜聰, 呂青, 鄧雪琴, 熊炳鈞. 人脂肪干細胞復合豬小腸黏膜下層脫細胞基質/殼聚糖溫敏凝膠體內構建組織工程脂肪的研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(8): 1028-1033. doi: 10.7507/1002-1892.20150219 復制
腫瘤、外傷或先天缺陷均可造成嚴重軟組織缺損，目前臨床常用修復方法包括人工材料填充、自體組織瓣修復以及自體脂肪移植，但這些方法分別存在組織相容性差、創傷大、移植物壞死吸收等局限性。隨著組織工程技術的發展，組織工程脂肪有望成為一種理想的修復方法。它是通過構建種子細胞-支架材料復合物并植入體內，該生物材料在體內逐漸降解的同時，創造適宜的微環境促使周圍細胞不斷增殖分化，原位形成新的脂肪組織，從而達到修復重建的目的[1]。人脂肪干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）是一類具有自我更新、多向分化潛能的MSCs[2-4]，具有來源廣泛、取材方便、培養簡單的特點[5]，是一種理想的脂肪組織工程種子細胞。脫細胞外基質（decellular extracellular matrix，dECM）是一種天然生物材料，保留了細胞外基質中豐富的生物活性因子，能有效促進細胞遷移黏附、生長增殖、定向分化[6-8]；但dECM降解快，單獨應用時其降解速度快于組織生長速度，不能滿足組織再生的條件，難以達到預期作用。前期研究中我們發現，經過多步法脫細胞處理的豬小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）與殼聚糖水凝膠復合后，具有良好的溫敏特性，有望作為注射式溫敏材料[9]。本實驗進一步探討將其與hADSCs復合在體內構建組織工程脂肪的可行性，為探索ADSCs移植的理想方法提供實驗依據及理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
5周齡健康雌性裸鼠24只，體重18～24 g，由成都達碩生物科技有限公司提供。脂肪組織由在四川大學華西醫院接受臨床一期乳癌手術切除患者自愿捐獻，取遠離腫瘤側乳腺邊緣脂肪組織進行細胞培養。SIS微粉（SIS powder，SISP）/殼聚糖溫敏水凝膠由四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室·干細胞與組織工程研究室提供，制備方法：冰浴下，將氯化殼聚糖（chitosan chloride，CSCl）、β-甘油磷酸二鈉（β-glycerol phosphate disodium，GP）、羥乙基纖維素（hydroxyethyl cellulose，HEC）按照 8∶2∶2.5的比例混合成液態（pH=7.2），并加入預濕SISP（30 mg/ mL），混合液在37℃時可形成不透明凝膠[10]。
Ⅰ型膠原酶、DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；10%FBS（Thermo公司，美國）；單克隆鼠抗鼠CD31（BD Bio-sciences公司，加拿大）；鼠抗人波形蛋白（Vimentin）單抗、EnvisionTM（Dako公司，加拿大）；生物素化兔抗鼠抗體、生物素化馬抗鼠抗體（Vector Laboratories公司，美國）。游標卡尺（精度0.01 mm；上海匯一尺業有限公司）；數字圖像分析系統（Nikon公司，日本）；Image Pro-Plus軟件（Med ia Cybernetics公司，美國）。
1.2 hADSCs分離、培養及鑒定
原代細胞參照Flynn等[11]的方法分離培養。取脂肪組織剪碎，于37℃、Ⅰ型膠原酶消化30 min，完全培養基（含10%FBS的DMEM/F12培養基）終止消化后靜置，吸去上層成熟脂肪細胞，以離心半徑13 cm、1 200 r/min離心5 min，棄去含大量脂滴的上層及中間的培養基層，下層沉淀用完全培養基重懸，置于37℃、5%CO2孵箱內培養。24 h后除去未貼壁細胞，每2～3天更換培養基。待細胞生長至80%融合時，以0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA消化傳代，取第3代細胞進行下一步實驗。
hADSCs的鑒定參考本研究室前期研究[12]。取第3代細胞接種至6孔板中，完全培養基培養72 h后更換為成脂培養基培養14 d，油紅O染色可見細胞質內脂滴形成；更換為成骨培養基培養21 d，茜素紅染色可見鈣結節；提示hADSCs具有成脂和成骨分化能力。
1.3 植入材料制備
第3代ADSCs消化計數后用DMEM/F12培養基重懸成濃度為3.33×106個/mL的細胞懸液，冰浴下將細胞懸液與液態SISP/CSCl-GP-HEC按0.6 mL∶1.4 mL比例充分混勻，制成細胞濃度為1×106個/mL的液態凝膠。
1.4 實驗分組及方法
根據植入物不同將24只裸鼠隨機分為實驗組及對照組，每組12只。用25號針頭分別將1 mL hADSCs+SISP/CSCl-GP-HEC（實驗組）或SISP/CSCl-GP-HEC（對照組）注射至對應裸鼠頸背部皮下。
1.5 觀測指標
1.5.1 植入物體積測量
注射后0、1、2、4、8周兩組分別取3只動物測量植入物體積。參照Hillel等[13]的方法，以互相垂直的3個最大徑作為長、寬、高，用游標卡尺測量3次，取均值，按照以下公式計算體積：3/4×π×1/2長×1/2寬×1/2高。
1.5.2 大體觀察
注射后1、2、4、8周兩組各取3 只裸鼠給予過量麻醉處死，于注射點切開皮膚，觀察移植區內有無新生組織形成以及組織形態、植入物殘留情況。
1.5.3 組織學觀察
大體觀察后用眼科剪游離皮下包塊，完整切取植入物并均分為2份。其中1份組織置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片；另1份組織行5 μm厚冰凍切片。① 兩組1、4、8周各取3張石蠟切片，常規行HE染色，鏡下觀察移植物成分變化及SISP降解情況。② 兩組1、4、8周各取3張冰凍切片，行油紅O染色，鏡下觀察陽性染色的新生脂滴。每張切片隨機選取6個400倍視野，Image Pro-Plus軟件計數陽性染色像素，取均值作為切片陽性面積。
1.5.4 免疫組織化學染色
① 以Vimentin染色鑒定hADSCs在體內存活分化情況。兩組1、4、8周各取3張石蠟切片，首先用檸檬酸鹽抗原修復液進行抗原修復，一抗為鼠抗人Vimentin單抗（400倍稀釋），二抗為EnvisionTM，親和素法顯色，蘇木精復染。鏡下觀察植入物內被Vimentin標記的hADSCs。 ② 以CD31標記血管內皮細胞，鑒定材料內的新生血管。兩組1、2、4、8周各取3張冰凍切片，一抗為CD31（500倍稀釋），二抗為生物素化兔抗鼠抗體，蘇木精復染。鏡下觀察組織內新生血管，每張取6 個400倍視野，Image Pro-Plus軟件計數CD31陽性染色像素，取均值作為切片陽性面積。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α= 0.05。
2 結果
2.1 植入物體積測量
注射后隨時間延長，兩組植入物體積均逐漸縮小，其中對照組前2周體積縮小顯著，2周時體積僅為0周時50%左右，2周后體積縮小速度減慢。注射后1、2、4、8周實驗組植入物體積均大于對照組，其中1、2、4周組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），8周時比較差異有統計學意義（t=3.348，P=0.029）。見圖 1。
圖1
兩組注射后各時間點植入物體積 ? ?2.2 大體觀察
各時間點兩組動物均存活良好，局部未出現紅腫、破潰、糜爛。 注射后即刻兩組植入物在皮下具有流動性，適當按壓皮膚以維持形態，1～3 min后轉為凝膠態，可見皮下圓形或橢圓形包塊；1、2、4周，兩組包塊質軟、邊界清楚、可推動、無粘連，切開見移植物呈灰白色、圓形、質軟，無纖維囊包裹；8 周，兩組注射點處皮下均可見脂黃色圓形新生組織，無纖維囊包裹，實驗組組織脂黃色更為鮮艷飽滿，此外兩 組新生組織表面均有豐富毛細血管形成。見圖 2。
2.3 組織學觀察
2.3.1 HE染色
鏡下觀察示，兩組植入物主要由紅色顆粒狀的殼聚糖和淡紅色條狀的SISP構成。注射后1周，兩組植入物內各成分排列松散雜亂，均以SISP為主。4周，兩組植入物結構變緊密，其中實驗組仍含有大量SISP，對照組SISP基本完全降解。8 周，實驗組植入物內仍有少量SISP；兩組植入物內部均未形成脂肪細胞巢，但實驗組中央出現少量散在分布的成熟脂肪細胞，對照組材料內未見脂肪細胞。見圖 3。
2.3.2 油紅O染色
鏡下觀察示，注射后1周兩組植入物內即有脂肪形成，新生脂肪沿材料表面生長，并隨時間延長數量增多、脂滴變大（圖 4）。注射后1、4、8周，實驗組油紅O染色陽性面積分別為（2 778.611±1 179.344）、（9 895.278±2 182.608）、（25 118.940±5 870.197）像素，均大于對照組的（3 761.500±2 559.266）、（9 010.222±4 753.634）、（11 842.890±3 312.844）像素，其中8周時兩組間差異有統計學意義（t=3.411，P=0.027），其余各時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察示，實驗組注射后1、4周含有大量hADSCs；8周時hADSCs數量減少，但偶有脂肪細胞Vimentin呈陽性（圖 5）。各時間點對照組均為陰 性。
注射后1周，兩組植入物內即出現新生血管，2 周達峰值，4、8周新生血管逐漸減少，組內各時間點間CD31陽性面積比較差異有統計學意義（P＜0.05）；同時間點組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。此外，CD31陽性僅出現在對照組植入物邊緣，而實驗組植入物中央和邊緣均有CD31陽性表達。見圖 6、7。
圖5
注射后各時間點實驗組Vimentin免疫組織化學染色觀察（×400） ? 1周 ? 4周 ? 8周 箭頭示Vimentin標記陽性脂肪細胞 ? ?3 討論
本研究中，經多步法處理的SISP與物理性質可控的CSCl-GP-HEC凝膠可復合作為hADSCs的載體。殼聚糖水凝膠的生物相容性較好，在37℃條件下可由液態自發轉變為凝膠態，故可經微創植入，填充不同形態的缺損[14]。SISP/CSCl-GP-HEC在體外呈液態，無需麻醉經皮下注射植入，操作簡便安全。裸鼠體溫與人相近[15]，液態的SISP/CSCl-GP-HEC注射后經1～3 min即轉變為凝膠態，注射局部未出現排斥反應。HE染色觀察到材料內的SISP隨時間逐步降解，實驗組復合hADSCs后SISP的降解速度較對照組減慢。由于SISP可持續釋放多種生物活性因子，我們認為復合hADSCs的材料更有利于細胞的生長增殖和材料的血管化。此外，殼聚糖的三維多孔結構也有利于細胞黏附生長和增殖分化[16]，可見SISP/CSCl-GP-HEC提供了一個有利于細胞生長的微環境。
有研究發現單純移植ADSCs至體內后，細胞在體內的維持時間不足1周[17]。本實驗通過人Vem intin免疫組織化學染色觀察發現，hADSCs在材料內的存活時間長達8周，并且有部分脂肪細胞Vimentin呈陽性。提示SISP/CSCl-GP-HEC不僅有利于ADSCs的存活，可能還具有誘導成脂分化的作用，這一推論有待進一步研究證實。
本實驗油紅O染色顯示兩組材料內雖然均有脂肪形成，但實驗組中的脂肪明顯多于對照組。ADSCs在其生長的各個階段均具備成脂分化能力，可分化為成熟脂肪細胞，更重要的是，ADSCs具有脂肪細胞的部分特征，如分泌脂聯素和瘦素等典型的脂肪因子[18]，進一步促進周圍脂肪組織向材料內生長富集。本研究結果顯示8周時實驗組脂肪組織更多，同時植入物體積明顯大于對照組，表明復合ADSCs有利于材料內脂肪組織的形成，從而更好地維持體積。
新生脂肪需要周圍良好的血管化來提供營養，否則將缺血壞死吸收[19]。脂肪組織工程的血管化出現較早，2周左右即達峰值[20]。本實驗通過CD31標記材料中的血管內皮細胞，發現實驗組植入物血管化更均勻，此結果與HE染色觀察結果相符，表明ADSCs有利于材料均勻地血管化，從而更有利于材料內脂肪細胞的存活。研究發現，ADSCs主要分布在脂肪毛細血管壁上，可分化為血管內皮細胞，直接參與血管形成[21]。此外，ADSCs還具有旁分泌作用，能產生VEGF、bFGF、EGF、HGF、TGF-β1等多種活性細胞因子[22-24]，這些細胞因子可調節細胞外基質構成，促進血管化和脂肪形成[25]。
綜上述，ADSCs+SISP/CSCl-GP-HEC物理性質可控，應用方法簡便安全。SISP緩慢降解，可持續釋放生物活性因子；SISP/CSCl-GP-HEC為種子細胞提供了良好的生長微環境，使hADSCs存活時間延長；ADSCs+SISP/CSCl-GP-HEC在無需誘導的情況下可較好成脂和血管化，有望作為支架材料構建組織工程脂肪。
腫瘤、外傷或先天缺陷均可造成嚴重軟組織缺損，目前臨床常用修復方法包括人工材料填充、自體組織瓣修復以及自體脂肪移植，但這些方法分別存在組織相容性差、創傷大、移植物壞死吸收等局限性。隨著組織工程技術的發展，組織工程脂肪有望成為一種理想的修復方法。它是通過構建種子細胞-支架材料復合物并植入體內，該生物材料在體內逐漸降解的同時，創造適宜的微環境促使周圍細胞不斷增殖分化，原位形成新的脂肪組織，從而達到修復重建的目的[1]。人脂肪干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）是一類具有自我更新、多向分化潛能的MSCs[2-4]，具有來源廣泛、取材方便、培養簡單的特點[5]，是一種理想的脂肪組織工程種子細胞。脫細胞外基質（decellular extracellular matrix，dECM）是一種天然生物材料，保留了細胞外基質中豐富的生物活性因子，能有效促進細胞遷移黏附、生長增殖、定向分化[6-8]；但dECM降解快，單獨應用時其降解速度快于組織生長速度，不能滿足組織再生的條件，難以達到預期作用。前期研究中我們發現，經過多步法脫細胞處理的豬小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）與殼聚糖水凝膠復合后，具有良好的溫敏特性，有望作為注射式溫敏材料[9]。本實驗進一步探討將其與hADSCs復合在體內構建組織工程脂肪的可行性，為探索ADSCs移植的理想方法提供實驗依據及理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
5周齡健康雌性裸鼠24只，體重18～24 g，由成都達碩生物科技有限公司提供。脂肪組織由在四川大學華西醫院接受臨床一期乳癌手術切除患者自愿捐獻，取遠離腫瘤側乳腺邊緣脂肪組織進行細胞培養。SIS微粉（SIS powder，SISP）/殼聚糖溫敏水凝膠由四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室·干細胞與組織工程研究室提供，制備方法：冰浴下，將氯化殼聚糖（chitosan chloride，CSCl）、β-甘油磷酸二鈉（β-glycerol phosphate disodium，GP）、羥乙基纖維素（hydroxyethyl cellulose，HEC）按照 8∶2∶2.5的比例混合成液態（pH=7.2），并加入預濕SISP（30 mg/ mL），混合液在37℃時可形成不透明凝膠[10]。
Ⅰ型膠原酶、DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；10%FBS（Thermo公司，美國）；單克隆鼠抗鼠CD31（BD Bio-sciences公司，加拿大）；鼠抗人波形蛋白（Vimentin）單抗、EnvisionTM（Dako公司，加拿大）；生物素化兔抗鼠抗體、生物素化馬抗鼠抗體（Vector Laboratories公司，美國）。游標卡尺（精度0.01 mm；上海匯一尺業有限公司）；數字圖像分析系統（Nikon公司，日本）；Image Pro-Plus軟件（Med ia Cybernetics公司，美國）。
1.2 hADSCs分離、培養及鑒定
原代細胞參照Flynn等[11]的方法分離培養。取脂肪組織剪碎，于37℃、Ⅰ型膠原酶消化30 min，完全培養基（含10%FBS的DMEM/F12培養基）終止消化后靜置，吸去上層成熟脂肪細胞，以離心半徑13 cm、1 200 r/min離心5 min，棄去含大量脂滴的上層及中間的培養基層，下層沉淀用完全培養基重懸，置于37℃、5%CO2孵箱內培養。24 h后除去未貼壁細胞，每2～3天更換培養基。待細胞生長至80%融合時，以0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA消化傳代，取第3代細胞進行下一步實驗。
hADSCs的鑒定參考本研究室前期研究[12]。取第3代細胞接種至6孔板中，完全培養基培養72 h后更換為成脂培養基培養14 d，油紅O染色可見細胞質內脂滴形成；更換為成骨培養基培養21 d，茜素紅染色可見鈣結節；提示hADSCs具有成脂和成骨分化能力。
1.3 植入材料制備
第3代ADSCs消化計數后用DMEM/F12培養基重懸成濃度為3.33×106個/mL的細胞懸液，冰浴下將細胞懸液與液態SISP/CSCl-GP-HEC按0.6 mL∶1.4 mL比例充分混勻，制成細胞濃度為1×106個/mL的液態凝膠。
1.4 實驗分組及方法
根據植入物不同將24只裸鼠隨機分為實驗組及對照組，每組12只。用25號針頭分別將1 mL hADSCs+SISP/CSCl-GP-HEC（實驗組）或SISP/CSCl-GP-HEC（對照組）注射至對應裸鼠頸背部皮下。
1.5 觀測指標
1.5.1 植入物體積測量
注射后0、1、2、4、8周兩組分別取3只動物測量植入物體積。參照Hillel等[13]的方法，以互相垂直的3個最大徑作為長、寬、高，用游標卡尺測量3次，取均值，按照以下公式計算體積：3/4×π×1/2長×1/2寬×1/2高。
1.5.2 大體觀察
注射后1、2、4、8周兩組各取3 只裸鼠給予過量麻醉處死，于注射點切開皮膚，觀察移植區內有無新生組織形成以及組織形態、植入物殘留情況。
1.5.3 組織學觀察
大體觀察后用眼科剪游離皮下包塊，完整切取植入物并均分為2份。其中1份組織置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片；另1份組織行5 μm厚冰凍切片。① 兩組1、4、8周各取3張石蠟切片，常規行HE染色，鏡下觀察移植物成分變化及SISP降解情況。② 兩組1、4、8周各取3張冰凍切片，行油紅O染色，鏡下觀察陽性染色的新生脂滴。每張切片隨機選取6個400倍視野，Image Pro-Plus軟件計數陽性染色像素，取均值作為切片陽性面積。
1.5.4 免疫組織化學染色
① 以Vimentin染色鑒定hADSCs在體內存活分化情況。兩組1、4、8周各取3張石蠟切片，首先用檸檬酸鹽抗原修復液進行抗原修復，一抗為鼠抗人Vimentin單抗（400倍稀釋），二抗為EnvisionTM，親和素法顯色，蘇木精復染。鏡下觀察植入物內被Vimentin標記的hADSCs。 ② 以CD31標記血管內皮細胞，鑒定材料內的新生血管。兩組1、2、4、8周各取3張冰凍切片，一抗為CD31（500倍稀釋），二抗為生物素化兔抗鼠抗體，蘇木精復染。鏡下觀察組織內新生血管，每張取6 個400倍視野，Image Pro-Plus軟件計數CD31陽性染色像素，取均值作為切片陽性面積。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α= 0.05。
2 結果
2.1 植入物體積測量
注射后隨時間延長，兩組植入物體積均逐漸縮小，其中對照組前2周體積縮小顯著，2周時體積僅為0周時50%左右，2周后體積縮小速度減慢。注射后1、2、4、8周實驗組植入物體積均大于對照組，其中1、2、4周組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），8周時比較差異有統計學意義（t=3.348，P=0.029）。見圖 1。
圖1
兩組注射后各時間點植入物體積 ? ?2.2 大體觀察
各時間點兩組動物均存活良好，局部未出現紅腫、破潰、糜爛。 注射后即刻兩組植入物在皮下具有流動性，適當按壓皮膚以維持形態，1～3 min后轉為凝膠態，可見皮下圓形或橢圓形包塊；1、2、4周，兩組包塊質軟、邊界清楚、可推動、無粘連，切開見移植物呈灰白色、圓形、質軟，無纖維囊包裹；8 周，兩組注射點處皮下均可見脂黃色圓形新生組織，無纖維囊包裹，實驗組組織脂黃色更為鮮艷飽滿，此外兩 組新生組織表面均有豐富毛細血管形成。見圖 2。
2.3 組織學觀察
2.3.1 HE染色
鏡下觀察示，兩組植入物主要由紅色顆粒狀的殼聚糖和淡紅色條狀的SISP構成。注射后1周，兩組植入物內各成分排列松散雜亂，均以SISP為主。4周，兩組植入物結構變緊密，其中實驗組仍含有大量SISP，對照組SISP基本完全降解。8 周，實驗組植入物內仍有少量SISP；兩組植入物內部均未形成脂肪細胞巢，但實驗組中央出現少量散在分布的成熟脂肪細胞，對照組材料內未見脂肪細胞。見圖 3。
2.3.2 油紅O染色
鏡下觀察示，注射后1周兩組植入物內即有脂肪形成，新生脂肪沿材料表面生長，并隨時間延長數量增多、脂滴變大（圖 4）。注射后1、4、8周，實驗組油紅O染色陽性面積分別為（2 778.611±1 179.344）、（9 895.278±2 182.608）、（25 118.940±5 870.197）像素，均大于對照組的（3 761.500±2 559.266）、（9 010.222±4 753.634）、（11 842.890±3 312.844）像素，其中8周時兩組間差異有統計學意義（t=3.411，P=0.027），其余各時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察示，實驗組注射后1、4周含有大量hADSCs；8周時hADSCs數量減少，但偶有脂肪細胞Vimentin呈陽性（圖 5）。各時間點對照組均為陰 性。
注射后1周，兩組植入物內即出現新生血管，2 周達峰值，4、8周新生血管逐漸減少，組內各時間點間CD31陽性面積比較差異有統計學意義（P＜0.05）；同時間點組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。此外，CD31陽性僅出現在對照組植入物邊緣，而實驗組植入物中央和邊緣均有CD31陽性表達。見圖 6、7。
圖5
注射后各時間點實驗組Vimentin免疫組織化學染色觀察（×400） ? 1周 ? 4周 ? 8周 箭頭示Vimentin標記陽性脂肪細胞 ? ?3 討論
本研究中，經多步法處理的SISP與物理性質可控的CSCl-GP-HEC凝膠可復合作為hADSCs的載體。殼聚糖水凝膠的生物相容性較好，在37℃條件下可由液態自發轉變為凝膠態，故可經微創植入，填充不同形態的缺損[14]。SISP/CSCl-GP-HEC在體外呈液態，無需麻醉經皮下注射植入，操作簡便安全。裸鼠體溫與人相近[15]，液態的SISP/CSCl-GP-HEC注射后經1～3 min即轉變為凝膠態，注射局部未出現排斥反應。HE染色觀察到材料內的SISP隨時間逐步降解，實驗組復合hADSCs后SISP的降解速度較對照組減慢。由于SISP可持續釋放多種生物活性因子，我們認為復合hADSCs的材料更有利于細胞的生長增殖和材料的血管化。此外，殼聚糖的三維多孔結構也有利于細胞黏附生長和增殖分化[16]，可見SISP/CSCl-GP-HEC提供了一個有利于細胞生長的微環境。
有研究發現單純移植ADSCs至體內后，細胞在體內的維持時間不足1周[17]。本實驗通過人Vem intin免疫組織化學染色觀察發現，hADSCs在材料內的存活時間長達8周，并且有部分脂肪細胞Vimentin呈陽性。提示SISP/CSCl-GP-HEC不僅有利于ADSCs的存活，可能還具有誘導成脂分化的作用，這一推論有待進一步研究證實。
本實驗油紅O染色顯示兩組材料內雖然均有脂肪形成，但實驗組中的脂肪明顯多于對照組。ADSCs在其生長的各個階段均具備成脂分化能力，可分化為成熟脂肪細胞，更重要的是，ADSCs具有脂肪細胞的部分特征，如分泌脂聯素和瘦素等典型的脂肪因子[18]，進一步促進周圍脂肪組織向材料內生長富集。本研究結果顯示8周時實驗組脂肪組織更多，同時植入物體積明顯大于對照組，表明復合ADSCs有利于材料內脂肪組織的形成，從而更好地維持體積。
新生脂肪需要周圍良好的血管化來提供營養，否則將缺血壞死吸收[19]。脂肪組織工程的血管化出現較早，2周左右即達峰值[20]。本實驗通過CD31標記材料中的血管內皮細胞，發現實驗組植入物血管化更均勻，此結果與HE染色觀察結果相符，表明ADSCs有利于材料均勻地血管化，從而更有利于材料內脂肪細胞的存活。研究發現，ADSCs主要分布在脂肪毛細血管壁上，可分化為血管內皮細胞，直接參與血管形成[21]。此外，ADSCs還具有旁分泌作用，能產生VEGF、bFGF、EGF、HGF、TGF-β1等多種活性細胞因子[22-24]，這些細胞因子可調節細胞外基質構成，促進血管化和脂肪形成[25]。
綜上述，ADSCs+SISP/CSCl-GP-HEC物理性質可控，應用方法簡便安全。SISP緩慢降解，可持續釋放生物活性因子；SISP/CSCl-GP-HEC為種子細胞提供了良好的生長微環境，使hADSCs存活時間延長；ADSCs+SISP/CSCl-GP-HEC在無需誘導的情況下可較好成脂和血管化，有望作為支架材料構建組織工程脂肪。
