引用本文： 張仁坤, 涂悅, 趙明亮, 陳翀, 梁海乾, 王景景, 張賽, 李曉紅. 3-D打印膠原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架的研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(8): 1022-1026. doi: 10.7507/1002-1892.20150218 復制
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）具有致殘率高和恢復困難的特點，一直是醫學領域的難題[1]。組織工程技術為其治療提供了新思路，成為近年研究熱點。脊髓組織工程是指將細胞-支架復合物移植至損傷處，形成具有一定結構和功能的節段以治療SCI[2]。高性能的支架是其發揮作用的基礎，支架的材料選擇和制作方法是決定其優劣的關鍵。支架材料主要包括天然材料和人工高分子材料。膠原蛋白、殼聚糖等天然材料雖然生物相容性良好，但力學性能差，難以模擬脊髓的三維多孔結構[3]；各種人工高分子材料雖能克服天然可降解材料力學性能差的特點，但其降解產物多引起周圍炎癥，生物相容性欠佳[4]。材料間的復合有可能解決上述難題。研究發現，用細胞外基質硫酸肝素對膠原蛋白進行交聯后，能明顯提高膠原蛋白的機械性能，延長膠原蛋白降解時間[5]。傳統的支架制作多采用低溫成型和模型注塑，步驟繁瑣，各過程精度不易把握，制作的支架性能差異很大，也不能隨意改變支架的走向和孔隙[6]。3-D打印技術的出現為解決上述問題提供了可能[7]。3-D打印機能按照預設的模型精準打印，具有成型迅速、樣品標準、規模量產等優點，并且可通過改變各種參數打印出不同規模的支架[8]。本研究采用3-D生物打印機，研究制作膠原蛋白-硫酸肝素脊髓支架的可能性，對支架性能進行檢測，并將其體外與神經干細胞（neural stem cells，NSCs）共培養，探討其生物相容性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
孕14 d SD大鼠1只，體重400 g，由軍事醫學科學院提供。
硫酸肝素、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白（Sigma公司，美國）；B27、bFGF、EGF（Invitrogen公司，美國）；巢蛋白（Nestin）、微管相關蛋白2（microtubulin-associated protein 2，MAP-2）一抗及熒光標記二抗（Abcam公司，英國）。3-D生物打印機（杭州捷諾飛生物科技有限公司）；FEI QUANTA200掃描電鏡（Phenom公司，荷蘭）；DWI4000B倒置熒光顯微鏡（Leica公司，德國）。
1.2 支架制備和檢測
1.2.1 硫酸肝素-膠原蛋白水凝膠制備
將Ⅰ型膠原蛋白1 g、Ⅱ型膠原蛋白100 mg、硫酸肝素10 mg加入0.05 mol/L的50 mL醋酸溶液中，4℃以2 000 r/ min攪拌器攪拌40 min，負壓抽真空，加入終濃度20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF和2%B27，置于4℃冰箱中過夜，使其充分混合成凝膠狀。
1.2.2 3-D打印
采用計算機輔助設計（computer aided design，CAD）構建一種多孔支架模板：采用100 μm噴頭，行走速度100 mm/min，每層厚度100 μm，中間孔隙寬度100 μm。將制備的凝膠裝入3-D打印機漏斗中，在計算機控制下，3-D打印機完成水凝膠在X、Y、Z軸上的噴涂工作，最終完成設計的仿生脊髓支架。環氧乙烷消毒真空包裝，- 4℃冷藏備用。
1.2.3 掃描電鏡觀察及孔隙率測量
將制備的支架噴金后，采用掃描電鏡觀察支架內部三維結構，測量支架微管道的管徑。采用排水法計算孔隙率：取3 個支架，在烘箱中烘至恒重，冷卻后，稱取其質量m0；然后將支架盛入水容器，加水至支架高度1/3，24 h后加水至2/3高度，放置24 h，加水至全部高度，徹底排出空氣；取出支架，抹去表面水分，用天平稱取其質量m1，用排水法測出支架體積V0。根據以下公式計算孔隙率： （m1－m0）/V0×100%。
1.2.4 體外降解實驗
隨機取10個支架置于6孔板內，加入2 mL中性PBS溶液，放于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養8周，每周測溶液pH值并換液；每周將樣品取出凍干，測定質量變化。
1.3 NSCs分離、培養及鑒定
取孕14 d SD大鼠，采用6%水合氯醛（36 mg/ kg）行腹腔麻醉，75%乙醇全身消毒，剖腹取胎鼠；取腦皮質剪碎吹打，加入完全培養基（含20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、1%N2、2%B27和4 mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12培養基），于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。3～4 d后置于15 mL離心管，以1 200 r/min離心5 min，棄上清液；5～7 d后用吸管吹打形成的球狀細胞克隆，制成單細胞懸液后繼續傳代。取細胞克隆滴在預鋪多聚賴氨酸包被的載玻片上，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育2 h，吸出培養液，0.01 mol/L PBS洗片3次，加4%多聚甲醛固定30 min。然后行Nestin免疫熒光組織化學染色鑒 定。
1.4 實驗分組及檢測
1.4.1 實驗分組
將第2代NSCs經胰蛋白酶消化后，制成密度為1×106個/mL的細胞懸液。實驗分為2組，A組將細胞懸液用微量注射器注入10個3 mm長支架內，每個支架注入0.2 mL，置于24孔板內加DMEM/F12培養基培養7 d；B組直接將細胞懸液接種于預涂左旋多聚賴氨酸的24孔培養板上。
1.4.2 MTT檢測細胞活力
分別于培養1、3、7 d吸出原培養基后，每孔加入DMEM/F12培養基0.5 mL及MTT 50 μL，37℃孵育4 h。吸出孔內培養上清液，加入DMSO 1 mL，振蕩10 min。待溶解完全后，取出材料或蓋玻片，于酶聯免疫檢測儀上測定波長550 nm處吸光度（A）值。
1.4.3 NSCs分化形態觀察
① 光鏡觀察：培養1、3、7 d于光鏡下觀察NSCs分化情況，觀察神經球的黏附、軸突生長及細胞狀態。② 掃描電鏡觀察：培養7 d后棄去培養基，PBS液清洗3次，用2.5%戊二醛固定，二甲砷酸緩沖液過夜，乙醇、丙酮梯度脫水，乙酸異戊酯置換，CO2干燥，真空干燥噴金，掃描電鏡觀察細胞在支架上的生長情況。
1.4.4 免疫熒光染色檢測NSCs分化情況
將A組支架進行冰凍切片，片厚40 mm，B組吸出培養基，以多聚甲醛固定，行神經元MAP-2免疫熒光和細胞核DAPI染色。為定量比較分化率，每組隨機選取10個視野，分別計數每視野中總細胞數和神經元數量，按以下公式計算分化率：神經元數量/總細胞數 ×100%。
1.5 統計學方法
采用GraphPad Prism 5.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架相關檢測
2.1.1 掃描電鏡觀察及孔隙率測量
利用3-D打印機成功制備硫酸肝素-膠原蛋白微導管支架，管徑為3 mm，與成年SD大鼠胸段脊髓直徑相近（圖 1）。掃描電鏡觀察示，支架的微管道內徑為100 μm、細絲直徑100 μm，中空微管內徑均勻一致，呈線性排列，見 圖 2。通過排水法計算出孔隙率為90.25%± 2.15%。
圖1
3-D打印的支架外觀 ? ?2.1.2 pH值和質量變化
前3周溶液pH值變化不大，維持在7.4左右；第4～7周pH值明顯開始下降，支架材料主要在此階段開始降解；8周時pH值略有升高，此時材料降解也趨于完畢。體外降解過程中，支架質量隨時間延長逐漸降低，8周時已趨于0。見圖 3。
2.2 NSCs形態變化及鑒定
NSCs在培養基中懸浮培養，生長良好，細胞從單細胞逐漸聚集成神經球生長。Nestin免疫熒光組織化學染色示，神經球內大部分細胞為Nestin陽性。見圖 4。
2.3 MTT檢測細胞活力
培養1、3、7 d，A組A值分別為0.356±0.021、0.362±0.016、0.354±0.011，B組分別為0.358±0.016、0.356±0.011、0.362±0.013，兩組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 NSCs分化形態觀察
光鏡觀察示，培養1 d，A組可見支架中大量單細胞；B組NSCs大部分已貼壁，細胞質發亮，狀態良好。3 d，A、B組細胞均伸出軸突，NSCs開始分化，A組中可見有神經球形成。7 d，A、B組軸突更長，細胞生長良好。見圖 5。
培養7 d A組掃描電鏡觀察示，細胞黏附于支架上，大量細胞伸出軸突，并且有神經球形成，適合NSCs貼附生長，為神經纖維再生提供了通道。見圖 6。
2.5 免疫熒光染色檢測NSCs分化情況
免疫熒光染色示，兩組均有NSCs分化為神經元，見圖 7。定量分析顯示，A、B組分化率分別為29.60%±2.68%和10.90%±2.13%，差異有統計學意義（t=17.30，P=0.01）。
3 討論
SCI后上下行傳導束中斷，局部膠質瘢痕形成，各種炎性細胞和抑制性物質大量聚集，抑制性的物理和化學微環境加劇神經細胞死亡，斷端神經束難以形成連接，這也是目前各種臨床治療SCI方法效果欠佳的重要原因[9]。因此，如何克服上述問題，挽救神經細胞，為神經束連接提供通路成為治療關鍵。隨著組織工程技術在骨科學、心血管學等領域的興起，人們開始探討其在神經科學領域尤其在SCI治療的應用，并取得了可喜的研究成果[10]。各種支架材料聯合細胞原位移植于損傷處，不管是在組織形態學還是在功能學評價上，均明顯促進了SCI動物模型的恢復[11-13]。然而由于脊髓有著特殊的解剖結構和生理功能，移植細胞必須跨過受損后形成的膠質瘢痕，并且與機體的神經元形成突觸連接才能發揮作用[14]。因此對脊髓支架有著特殊要求，即具有良好的生物相容性、三維立體多孔、良好的生物降解性以及良好的力學性能[15]。
良好的生物相容性是對支架材料的首要要求，因此目前多采用各種天然生物高分子制備支架；然而任意的單個高分子材料力學性能太差，難以為細胞提供適當空間。硫酸肝素是細胞外基質中的一種氨基聚糖，是神經基底膜的重要組成成分，而神經基底膜在神經纖維再生中有著重要作用。硫酸肝素可快速、可逆地結合各種細胞因子，形成活性細胞因子的儲存池，是良好的緩釋材料[16]。而膠原蛋白是生物體內普遍存在的一種蛋白，除了有良好的力學性能，其在信號轉導、生長因子與細胞因子的運輸上也發揮著重要作用[17]。硫酸肝素可與膠原蛋白交聯，提高支架材料的機械強度，方便植入體內的手術操作；而且，由于交聯后支架材料空間結構的改變，改善了膠原材料原有的降解較快的特性，延長了降解時間，在神經再生期間保持了一定空間構型，有利于神經再生[18]。
目前的支架制備主要采用低溫成形和模型注塑方法。低溫成形主要是使各種原材料溶液或凝膠在低溫下形成一定形狀，但這種方法制作的支架內部走行無規律，空隙參差不齊，而脊髓支架要求具有一定的排列方向，為傳導束的再連提供通道，因此這種支架既難以保證移植細胞的存活，又物理阻絕了纖維束的連接[19]。模型注塑雖能解決材料方向的問題，但對模型要求很高，大鼠脊髓橫斷面只有3 mm左右，因此制作符合要求的模型需要很高的工藝；并且一個模型只能成形一種固定支架。3-D打印技術的出現，為構建符合脊髓組織工程要求的支架帶來了新的曙光[20]。3-D打印通過CAD軟件層層相疊進行打印，具有程序調控、精確造模，可控制材料比例以調節材料各種參數以期達到最優效果，其構建復雜組織結構的優點能很好地解決上述問題[21]。本研究利用3-D生物打印機成功制備出仿生脊髓支架，與脊髓具有相似結構，體外與NSCs共培養可很好地黏附細胞，為細胞提供增殖和分化環境，具有良好的生物相容性。
綜上述，以膠原蛋白-硫酸肝素凝膠在3-D打印機上制備成新型神經組織工程支架材料，其內部具有縱行排列、平行的微孔結構，從內部空間結構上高度仿生神經，從組成成分上高度仿生神經基底膜。因此，我們認為這種神經組織工程支架材料聚有良好的研究和應用潛力。
脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）具有致殘率高和恢復困難的特點，一直是醫學領域的難題[1]。組織工程技術為其治療提供了新思路，成為近年研究熱點。脊髓組織工程是指將細胞-支架復合物移植至損傷處，形成具有一定結構和功能的節段以治療SCI[2]。高性能的支架是其發揮作用的基礎，支架的材料選擇和制作方法是決定其優劣的關鍵。支架材料主要包括天然材料和人工高分子材料。膠原蛋白、殼聚糖等天然材料雖然生物相容性良好，但力學性能差，難以模擬脊髓的三維多孔結構[3]；各種人工高分子材料雖能克服天然可降解材料力學性能差的特點，但其降解產物多引起周圍炎癥，生物相容性欠佳[4]。材料間的復合有可能解決上述難題。研究發現，用細胞外基質硫酸肝素對膠原蛋白進行交聯后，能明顯提高膠原蛋白的機械性能，延長膠原蛋白降解時間[5]。傳統的支架制作多采用低溫成型和模型注塑，步驟繁瑣，各過程精度不易把握，制作的支架性能差異很大，也不能隨意改變支架的走向和孔隙[6]。3-D打印技術的出現為解決上述問題提供了可能[7]。3-D打印機能按照預設的模型精準打印，具有成型迅速、樣品標準、規模量產等優點，并且可通過改變各種參數打印出不同規模的支架[8]。本研究采用3-D生物打印機，研究制作膠原蛋白-硫酸肝素脊髓支架的可能性，對支架性能進行檢測，并將其體外與神經干細胞（neural stem cells，NSCs）共培養，探討其生物相容性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
孕14 d SD大鼠1只，體重400 g，由軍事醫學科學院提供。
硫酸肝素、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白（Sigma公司，美國）；B27、bFGF、EGF（Invitrogen公司，美國）；巢蛋白（Nestin）、微管相關蛋白2（microtubulin-associated protein 2，MAP-2）一抗及熒光標記二抗（Abcam公司，英國）。3-D生物打印機（杭州捷諾飛生物科技有限公司）；FEI QUANTA200掃描電鏡（Phenom公司，荷蘭）；DWI4000B倒置熒光顯微鏡（Leica公司，德國）。
1.2 支架制備和檢測
1.2.1 硫酸肝素-膠原蛋白水凝膠制備
將Ⅰ型膠原蛋白1 g、Ⅱ型膠原蛋白100 mg、硫酸肝素10 mg加入0.05 mol/L的50 mL醋酸溶液中，4℃以2 000 r/ min攪拌器攪拌40 min，負壓抽真空，加入終濃度20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF和2%B27，置于4℃冰箱中過夜，使其充分混合成凝膠狀。
1.2.2 3-D打印
采用計算機輔助設計（computer aided design，CAD）構建一種多孔支架模板：采用100 μm噴頭，行走速度100 mm/min，每層厚度100 μm，中間孔隙寬度100 μm。將制備的凝膠裝入3-D打印機漏斗中，在計算機控制下，3-D打印機完成水凝膠在X、Y、Z軸上的噴涂工作，最終完成設計的仿生脊髓支架。環氧乙烷消毒真空包裝，- 4℃冷藏備用。
1.2.3 掃描電鏡觀察及孔隙率測量
將制備的支架噴金后，采用掃描電鏡觀察支架內部三維結構，測量支架微管道的管徑。采用排水法計算孔隙率：取3 個支架，在烘箱中烘至恒重，冷卻后，稱取其質量m0；然后將支架盛入水容器，加水至支架高度1/3，24 h后加水至2/3高度，放置24 h，加水至全部高度，徹底排出空氣；取出支架，抹去表面水分，用天平稱取其質量m1，用排水法測出支架體積V0。根據以下公式計算孔隙率： （m1－m0）/V0×100%。
1.2.4 體外降解實驗
隨機取10個支架置于6孔板內，加入2 mL中性PBS溶液，放于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養8周，每周測溶液pH值并換液；每周將樣品取出凍干，測定質量變化。
1.3 NSCs分離、培養及鑒定
取孕14 d SD大鼠，采用6%水合氯醛（36 mg/ kg）行腹腔麻醉，75%乙醇全身消毒，剖腹取胎鼠；取腦皮質剪碎吹打，加入完全培養基（含20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、1%N2、2%B27和4 mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12培養基），于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。3～4 d后置于15 mL離心管，以1 200 r/min離心5 min，棄上清液；5～7 d后用吸管吹打形成的球狀細胞克隆，制成單細胞懸液后繼續傳代。取細胞克隆滴在預鋪多聚賴氨酸包被的載玻片上，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育2 h，吸出培養液，0.01 mol/L PBS洗片3次，加4%多聚甲醛固定30 min。然后行Nestin免疫熒光組織化學染色鑒 定。
1.4 實驗分組及檢測
1.4.1 實驗分組
將第2代NSCs經胰蛋白酶消化后，制成密度為1×106個/mL的細胞懸液。實驗分為2組，A組將細胞懸液用微量注射器注入10個3 mm長支架內，每個支架注入0.2 mL，置于24孔板內加DMEM/F12培養基培養7 d；B組直接將細胞懸液接種于預涂左旋多聚賴氨酸的24孔培養板上。
1.4.2 MTT檢測細胞活力
分別于培養1、3、7 d吸出原培養基后，每孔加入DMEM/F12培養基0.5 mL及MTT 50 μL，37℃孵育4 h。吸出孔內培養上清液，加入DMSO 1 mL，振蕩10 min。待溶解完全后，取出材料或蓋玻片，于酶聯免疫檢測儀上測定波長550 nm處吸光度（A）值。
1.4.3 NSCs分化形態觀察
① 光鏡觀察：培養1、3、7 d于光鏡下觀察NSCs分化情況，觀察神經球的黏附、軸突生長及細胞狀態。② 掃描電鏡觀察：培養7 d后棄去培養基，PBS液清洗3次，用2.5%戊二醛固定，二甲砷酸緩沖液過夜，乙醇、丙酮梯度脫水，乙酸異戊酯置換，CO2干燥，真空干燥噴金，掃描電鏡觀察細胞在支架上的生長情況。
1.4.4 免疫熒光染色檢測NSCs分化情況
將A組支架進行冰凍切片，片厚40 mm，B組吸出培養基，以多聚甲醛固定，行神經元MAP-2免疫熒光和細胞核DAPI染色。為定量比較分化率，每組隨機選取10個視野，分別計數每視野中總細胞數和神經元數量，按以下公式計算分化率：神經元數量/總細胞數 ×100%。
1.5 統計學方法
采用GraphPad Prism 5.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 支架相關檢測
2.1.1 掃描電鏡觀察及孔隙率測量
利用3-D打印機成功制備硫酸肝素-膠原蛋白微導管支架，管徑為3 mm，與成年SD大鼠胸段脊髓直徑相近（圖 1）。掃描電鏡觀察示，支架的微管道內徑為100 μm、細絲直徑100 μm，中空微管內徑均勻一致，呈線性排列，見 圖 2。通過排水法計算出孔隙率為90.25%± 2.15%。
圖1
3-D打印的支架外觀 ? ?2.1.2 pH值和質量變化
前3周溶液pH值變化不大，維持在7.4左右；第4～7周pH值明顯開始下降，支架材料主要在此階段開始降解；8周時pH值略有升高，此時材料降解也趨于完畢。體外降解過程中，支架質量隨時間延長逐漸降低，8周時已趨于0。見圖 3。
2.2 NSCs形態變化及鑒定
NSCs在培養基中懸浮培養，生長良好，細胞從單細胞逐漸聚集成神經球生長。Nestin免疫熒光組織化學染色示，神經球內大部分細胞為Nestin陽性。見圖 4。
2.3 MTT檢測細胞活力
培養1、3、7 d，A組A值分別為0.356±0.021、0.362±0.016、0.354±0.011，B組分別為0.358±0.016、0.356±0.011、0.362±0.013，兩組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 NSCs分化形態觀察
光鏡觀察示，培養1 d，A組可見支架中大量單細胞；B組NSCs大部分已貼壁，細胞質發亮，狀態良好。3 d，A、B組細胞均伸出軸突，NSCs開始分化，A組中可見有神經球形成。7 d，A、B組軸突更長，細胞生長良好。見圖 5。
培養7 d A組掃描電鏡觀察示，細胞黏附于支架上，大量細胞伸出軸突，并且有神經球形成，適合NSCs貼附生長，為神經纖維再生提供了通道。見圖 6。
2.5 免疫熒光染色檢測NSCs分化情況
免疫熒光染色示，兩組均有NSCs分化為神經元，見圖 7。定量分析顯示，A、B組分化率分別為29.60%±2.68%和10.90%±2.13%，差異有統計學意義（t=17.30，P=0.01）。
3 討論
SCI后上下行傳導束中斷，局部膠質瘢痕形成，各種炎性細胞和抑制性物質大量聚集，抑制性的物理和化學微環境加劇神經細胞死亡，斷端神經束難以形成連接，這也是目前各種臨床治療SCI方法效果欠佳的重要原因[9]。因此，如何克服上述問題，挽救神經細胞，為神經束連接提供通路成為治療關鍵。隨著組織工程技術在骨科學、心血管學等領域的興起，人們開始探討其在神經科學領域尤其在SCI治療的應用，并取得了可喜的研究成果[10]。各種支架材料聯合細胞原位移植于損傷處，不管是在組織形態學還是在功能學評價上，均明顯促進了SCI動物模型的恢復[11-13]。然而由于脊髓有著特殊的解剖結構和生理功能，移植細胞必須跨過受損后形成的膠質瘢痕，并且與機體的神經元形成突觸連接才能發揮作用[14]。因此對脊髓支架有著特殊要求，即具有良好的生物相容性、三維立體多孔、良好的生物降解性以及良好的力學性能[15]。
良好的生物相容性是對支架材料的首要要求，因此目前多采用各種天然生物高分子制備支架；然而任意的單個高分子材料力學性能太差，難以為細胞提供適當空間。硫酸肝素是細胞外基質中的一種氨基聚糖，是神經基底膜的重要組成成分，而神經基底膜在神經纖維再生中有著重要作用。硫酸肝素可快速、可逆地結合各種細胞因子，形成活性細胞因子的儲存池，是良好的緩釋材料[16]。而膠原蛋白是生物體內普遍存在的一種蛋白，除了有良好的力學性能，其在信號轉導、生長因子與細胞因子的運輸上也發揮著重要作用[17]。硫酸肝素可與膠原蛋白交聯，提高支架材料的機械強度，方便植入體內的手術操作；而且，由于交聯后支架材料空間結構的改變，改善了膠原材料原有的降解較快的特性，延長了降解時間，在神經再生期間保持了一定空間構型，有利于神經再生[18]。
目前的支架制備主要采用低溫成形和模型注塑方法。低溫成形主要是使各種原材料溶液或凝膠在低溫下形成一定形狀，但這種方法制作的支架內部走行無規律，空隙參差不齊，而脊髓支架要求具有一定的排列方向，為傳導束的再連提供通道，因此這種支架既難以保證移植細胞的存活，又物理阻絕了纖維束的連接[19]。模型注塑雖能解決材料方向的問題，但對模型要求很高，大鼠脊髓橫斷面只有3 mm左右，因此制作符合要求的模型需要很高的工藝；并且一個模型只能成形一種固定支架。3-D打印技術的出現，為構建符合脊髓組織工程要求的支架帶來了新的曙光[20]。3-D打印通過CAD軟件層層相疊進行打印，具有程序調控、精確造模，可控制材料比例以調節材料各種參數以期達到最優效果，其構建復雜組織結構的優點能很好地解決上述問題[21]。本研究利用3-D生物打印機成功制備出仿生脊髓支架，與脊髓具有相似結構，體外與NSCs共培養可很好地黏附細胞，為細胞提供增殖和分化環境，具有良好的生物相容性。
綜上述，以膠原蛋白-硫酸肝素凝膠在3-D打印機上制備成新型神經組織工程支架材料，其內部具有縱行排列、平行的微孔結構，從內部空間結構上高度仿生神經，從組成成分上高度仿生神經基底膜。因此，我們認為這種神經組織工程支架材料聚有良好的研究和應用潛力。
