引用本文： 廖燁暉, 鐘德君, 康敏, 姚帥輝, 張毅, 余永濤. 全反式維甲酸干預鼠胚神經干細胞聯合膠質細胞源性神經營養因子及硫酸軟骨素酶ABC移植修復大鼠脊髓損傷的研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(8): 1009-1015. doi: 10.7507/1002-1892.20150216 復制
神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是存在于哺乳動物脊髓、海馬和室管膜下層，具有分化為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞潛力的神經前體細胞[1]。研究發現，將NSCs移植至小鼠脊髓損傷部位后，小鼠運動功能顯著恢復，免疫組織學觀察發現移植的NSCs在損傷脊髓部位存活并向損傷區域遷移[2-3]。然而，相關動物實驗研究發現，NSCs移植至損傷脊髓后分化為神經元數量有限，這可能與移植局部NGF缺乏、神經抑制因子增加相關[4-5]。膠質細胞源性神經營養因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）是軸突再生的一種重要神經營養因子，對于促進脊髓損傷后神經修復具有重要作用[6-7]。研究發現，GDNF可通過激活細胞內的胞漿蛋白酪氨酸激酶Fyn和FAK等信號途徑促進軸突延長[8-9]。星形膠質細胞可在硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulphate proteoglycans，CSPGs）的刺激下形成膠質瘢痕，從而阻礙神經軸突延長和神經功能恢復[10-11]。而硫酸軟骨素酶ABC （chondroitinase ABC，ChABC）是催化分解CSPGs的一種酶類，Starkey等[12]研究認為，ChABC可通過降低損傷脊髓局部CSPGs含量等相關途徑，促進脊髓功能恢復。脊髓損傷后神經功能修復是由多種細胞因子和信號途徑相互作用形成復雜網絡調控，GDNF、ChABC通過不同信號途徑促進軸突再生和神經功能恢復，二者在神經修復過程中是否具有相互作用，目前仍不清楚。本研究將全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）干預培養的鼠胚NSCs聯合GDNF和ChABC移植至大鼠脊髓損傷部位，采用BBB評分、體感誘發電位（somatosensory evoked potentials，SEP）檢測和免疫組織熒光染色觀察評估大鼠脊髓功能恢復情況，探索促進脊髓損傷再生修復的方法以及GDNF、ChABC在修復過程中的相互作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑 、儀器
健康成年雌性SD大鼠60只，體重200～250 g，由瀘州醫學院實驗動物中心提供。經ATRA（1.0 μmol/L）干預培養的鼠胚NSCs由本課題組前期實驗完成并凍存備用[13-14]。于移植前1 d采用BrdU標記NSCs，移植前30 min采用0.25%胰蛋白酶消化10 min，以離心半徑6 cm、1 000 r/min離心5 min，用培養基調節濃度為2×105個/μL的細胞懸液備用。
GDNF、ChABC（PeproTech公司，美國）；將GDNF凍干粉（10 μg/支）及ChABC（5 U/支）分別采用無菌PBS液溶解，調整濃度為10 μg/mL及5 U/ mL，無菌EP管分裝，-20℃保存備用。
DAPI（Sigma公司，美國）； B27輔助生長因子、DMEM/F12（1∶1）、FBS（GIBCO公司，美國）；小鼠抗微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）IgG、FITC標記山羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物科技有限公司）；鼠抗神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）IgG、羅丹明標記山羊抗兔IgG、兔抗BrdU多克隆IgG（北京博奧森生物技術有限公司）。 BX60熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image Pro-Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將60只SD大鼠隨機分為5組（n=12），分別為假手術組（A組）、損傷對照組（B組）、NSCs+GDNF移植組（C組）、NSCs+ChABC移植組（D組）、NSCs+GDNF+ChABC移植組（E組）。各組大鼠采用2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，以T9～11棘突為中心作背部正中切口，剝離雙側椎旁肌肉，A組僅行椎板切除術、蛛網膜下腔放置PE-10號導管；其余各組咬除椎板，暴露T9～11節段脊髓，尖刀片橫斷脊髓，解剖顯微鏡下將PE-10號導管穿皮下經蛛網膜下腔置入脊髓橫斷處，固定導管。檢查無活動性出血，解剖顯微鏡下縫合硬脊膜，常規逐層縫合切口。體外導管熱壓封閉，以備后期細胞移植。術后每日協助排尿2次，直至恢復排尿反射；腹腔注射青霉素12萬U/d，連續1周。
術后第8天，C、D、E組采用微量注射器經留置導管注入BrdU標記NSCs 10 μL，A、B組注入等量生理鹽水。第8～14天每天C組經留置導管注入GDNF、生理鹽水各10 μL，D組注射ChABC、生理鹽水各10 μL，E組注射GDNF、ChABC各10 μL，A、B組注射生理鹽水20 μL。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察并記錄造模術后及細胞移植后各組大鼠切口感染情況和死亡情況。
1.3.2 后肢運動功能評定
術前1 d、術后7 d及移植后1、2、5、8周采用BBB評分 [15]評價各組大鼠后肢運動功能。
1.3.3 神經電生理檢查
術前1 d、術后7 d及移植后1、2、5、8周對各組大鼠進行SEP檢測。大鼠同上法麻醉后固定、顱頂備皮。刺激電極置于踝關節上方脛后神經處，參考電極置于遠側1 cm處，記錄電極置于冠狀縫和矢狀縫相交處頭皮下后肢皮質感覺區，給予直流單方波電脈沖刺激，刺激強度7.5 V，波寬0.2 ms，頻率3 Hz，觀察記錄SEP潛伏期的變化。
1.3.4 組織學及免疫熒光染色觀察
移植后8周神經電生理檢查后，各組大鼠給予生理鹽水和4%中性多聚甲醛PBS緩沖液心臟灌注固定。原入路暴露脊髓，以橫斷面為中心切取長約4 cm脊髓組織，石蠟包埋、連續5 μm厚切片。每組標本隨機取8張切片行HE染色，光鏡下觀察損傷區域改變情況。取8張采用一抗兔抗BrdU多克隆IgG標記神經元、二抗羅丹明標記山羊抗兔IgG顯色，DAPI復染，熒光顯微鏡下BrdU陽性細胞胞體呈橘紅色熒光。取8張加入一抗兔抗BrdU（1∶50）和鼠抗GFAP（1∶100) 混合物，二抗羅丹明標記山羊抗兔IgG（1∶50）和FITC標記羊抗小鼠IgG（1∶50）混合物顯色，熒光顯微鏡下GFAP陽性細胞呈草綠色熒光。取8 張加入一抗兔抗BrdU（1∶50）和小鼠抗MAP-2（1∶100），其余步驟同BrdU/GFAP免疫熒光雙標染色，熒光顯微鏡下MAP-2陽性細胞軸突呈草綠色熒光。每張切片取10個視野，熒光顯微鏡高倍鏡下觀察，采用Image Pro-Plus圖像分析軟件計數各免疫熒光染色陽性細胞。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
除A組外，其余各組大鼠造模、麻醉清醒后雙側后肢均表現為完全癱瘓，提示造模成功。造模術后1 只大鼠死于切口感染，4只死于腸梗阻，均給予補充。
2.2 后肢運動功能評定
細胞移植后各組大鼠雙側后肢運動功能均有所恢復，C、D、E組較B組恢復明顯，以E組恢復最佳。
各組大鼠術前BBB評分均為21分。術后7 d，除A組外，其余各組均為0分。移植后各時間點B～E組BBB評分均顯著低于A組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；移植后1周，B～E組組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；移植后2、5、8周，C～E組BBB評分逐步上升且均高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；5、8周時，E組BBB評分高于C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）。其余時間點各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠各時間點后肢運動功能BBB評分比較（n=12，2.3 神經電生理檢查
術前各組大鼠SEP潛伏期比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。術后7 d，B～E組潛伏期較A組明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05），B～E組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。移植后1、2、5、8周B～E組潛伏期亦顯著長于A組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；2、5、8周，C、D、E組潛伏期逐漸縮短，與B組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；5、8周，E組與C、D組比較潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余時間點各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠各時間點SEP潛伏期比較(n=12，ms，2.4 組織學觀察
A組大鼠灰、白質分界清楚（圖 1 a），神經纖維束排列規則，細胞輪廓清楚、結構完整（圖 1 b）。B組大鼠脊髓破壞嚴重，損傷區域灰白質結構紊亂、無明顯界限，神經元壞死減少，有較大囊腔形成（圖 1 c）。C～E組大鼠脊髓損傷區域細胞增生明顯，星形膠質細胞增生并聚集于膠質瘢痕周圍，壞死囊腔較B組小，C、D、E組間未見明顯差異（圖 1 d～f）。
圖1
移植后8周各組HE染色觀察 ? A組（×100） ? A組（×200） ? B組（×200） ? C組（×200） ? D組（×200） ? E組（×200）
Figure1.
HE staining observation at 8 weeks after transplantation ? Group A (×100) ? Group A (×200) ? Group B (×200) ? Group C (×200) ? Group D (×200) ? Group E (×200)
2.5 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡觀察示，A、B組內未見BrdU陽性細胞；C～E組可見胞體呈橘紅色的陽性細胞，主要分布于灰、白質。高倍鏡下NSCs呈圓形或橢圓形分布于纖維束和空洞周圍（圖 2）。C、D、E組BrdU陽性細胞計數分別為（95.2±10.2）、（92.7±8.9）、（109.0±10.8）個/視野，E組顯著多于C、D組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
圖2
移植后8周各組BrdU免疫熒光染色觀察（×200） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組 ? ?各組均可見GFAP染色陽性細胞分布于斷端灰、白質空洞部位，神經元胞體向四周伸出放射狀突起，部分相互交織成網（圖 3）。A～E組陽性細胞計數分別為（16.9±2.2）、（19.8±3.0）、（13.5±2.5）（12.8±2.4）、（10.3±1.9）個/視野。C～E組GFAP陽性細胞少于A、B組，E組少于C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
各組均可見MAP-2標記陽性細胞，主要分布于脊髓灰質神經元的胞體和突起（圖 4）。A～E組MAP-2陽性細胞計數分別為（8.4±1.7）、（8.3±1.8）、（11.7±2.2）、（10.6±2.4）、（14.2±2.3）個/視野，C～E組陽性細胞多于A、B組，E組多于C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
脊髓損傷時可出現脊髓結構破壞、脊髓中神經細胞凋亡和壞死，從而遺留永久性神經功能障礙。臨床常采用手術減壓、藥物營養神經、康復理療、生物治療等方式治療脊髓損傷，但療效欠佳，很難達到滿意治療效果。因此，如何治療中樞神經系統損傷仍是研究熱點。NSCs是一類具有分化為各種細胞潛能的成體干細胞。移植NSCs于損傷脊髓處，誘導其定向分化為神經元、修復并補充脊髓中受損的神經元，對于脊髓損傷的治療具有重要意義，這種治療方式也是目前臨床和基礎學科研究治療脊髓損傷的熱點方式。Salewski等[2] 及Yao等[3]通過移植鼠胚NSCs于大鼠損傷脊髓節段的相關研究，證實NSCs移植可促進損傷脊髓的修復和功能障礙的恢復。然而NSCs定向分化為神經元及脊髓功能障礙改善仍然有限[4]。本課題組既往通過使用不同濃度的ATRA對鼠胚NSCs進行培養，發現經1.0 μmol/ L ATRA誘導培養的鼠胚NSCs向神經元分化的比例高達70%[13, 16]。因此，本實驗選取經1.0 μmol/L ATRA誘導的NSCs進行移植，以增加移植NSCs向神經元分化的比例。
動物實驗發現[17]，移植的NSCs在損傷脊髓局部微環境中細胞因子的作用下，大量向星形膠質細胞分化，從而促進膠質瘢痕形成，并且移植的NSCs在損傷脊髓處存活數量和時間均有限。隨著移植時間延長，移植的NSCs逐漸出現選擇性消融，從而導致已恢復的運動功能再次惡化[18]。導致上述改變的原因可能與損傷脊髓局部微循環中的細胞因子改變密切相關。脊髓損傷局部存在各種神經營養因子和神經修復、再生抑制因子，這些因子對促進脊髓損傷的修復意義重大。GDNF是由神經膠質細胞分泌的一種神經營養因子，它廣泛分布于脊髓中，具有促進觸突再生、脊髓損傷后神經功能恢復等作用[19]。相關研究證實，GDNF可通過激活細胞內的胞漿蛋白酪氨酸激酶Fyn和FAK等信號途徑，從而促進軸突再生和髓鞘化[8-9]。在中樞神經損傷部位還存在一些抑制因子，這些抑制因子具有抑制軸突再生、延長等作用[20-22]。CSPGs是目前認為具有抑制軸突再生的重要因子之一，是由膠質瘢痕中的星形膠質細胞分泌的多糖蛋白，對于NSCs增殖和軸突生長均具有明顯抑制作用[23]。ChABC是由普通變形桿菌產生的一種酶類，它具有催化分解黏多糖類的功能[24]。研究發現[25]，ChABC不僅可通過降低損傷脊髓局部的CAPGs，從而促進損傷軸突修復和再生，還能夠促進脊髓損傷后功能障礙的恢復。
本實驗通過對比研究經ATRA干預培養的NSCs聯合GNDF、ChABC共同移植與其分別聯合GDNF、ChABC移植治療大鼠損傷脊髓，觀察各組大鼠脊髓功能恢復情況和NSCs再生情況。研究結果發現，從移植后2周開始，C～E組大鼠神經功能障礙恢復程度均優于B組大鼠，尤其在移植后5、8周E組大鼠神經功能恢復更明顯，大鼠BBB評分、SEP潛伏期和NSCs存活數量均顯著優于C、D組，且差異有統計學意義。GFAP熒光染色觀察示，E組星形膠質細胞少于C、D組，差異有統計學意義。提示NSCs聯合GDNF、ChABC共同移植，對于降低脊髓損傷局部星形膠質細胞的形成較NSCs分別聯合GDNF、ChABC具有更好效果，對減少局部瘢痕形成、促進神經功能障礙恢復有重要作用。通過本實驗研究，我們初步認為經ATRA干預培養的NSCs聯合GNDF、ChABC移植對促進大鼠損傷脊髓神經功能恢復較單獨聯合移植治療效果更佳，且細胞因子GDNF、ChABC在治療脊髓損傷過程中具有協同作用關系。
神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是存在于哺乳動物脊髓、海馬和室管膜下層，具有分化為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞潛力的神經前體細胞[1]。研究發現，將NSCs移植至小鼠脊髓損傷部位后，小鼠運動功能顯著恢復，免疫組織學觀察發現移植的NSCs在損傷脊髓部位存活并向損傷區域遷移[2-3]。然而，相關動物實驗研究發現，NSCs移植至損傷脊髓后分化為神經元數量有限，這可能與移植局部NGF缺乏、神經抑制因子增加相關[4-5]。膠質細胞源性神經營養因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）是軸突再生的一種重要神經營養因子，對于促進脊髓損傷后神經修復具有重要作用[6-7]。研究發現，GDNF可通過激活細胞內的胞漿蛋白酪氨酸激酶Fyn和FAK等信號途徑促進軸突延長[8-9]。星形膠質細胞可在硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulphate proteoglycans，CSPGs）的刺激下形成膠質瘢痕，從而阻礙神經軸突延長和神經功能恢復[10-11]。而硫酸軟骨素酶ABC （chondroitinase ABC，ChABC）是催化分解CSPGs的一種酶類，Starkey等[12]研究認為，ChABC可通過降低損傷脊髓局部CSPGs含量等相關途徑，促進脊髓功能恢復。脊髓損傷后神經功能修復是由多種細胞因子和信號途徑相互作用形成復雜網絡調控，GDNF、ChABC通過不同信號途徑促進軸突再生和神經功能恢復，二者在神經修復過程中是否具有相互作用，目前仍不清楚。本研究將全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）干預培養的鼠胚NSCs聯合GDNF和ChABC移植至大鼠脊髓損傷部位，采用BBB評分、體感誘發電位（somatosensory evoked potentials，SEP）檢測和免疫組織熒光染色觀察評估大鼠脊髓功能恢復情況，探索促進脊髓損傷再生修復的方法以及GDNF、ChABC在修復過程中的相互作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑 、儀器
健康成年雌性SD大鼠60只，體重200～250 g，由瀘州醫學院實驗動物中心提供。經ATRA（1.0 μmol/L）干預培養的鼠胚NSCs由本課題組前期實驗完成并凍存備用[13-14]。于移植前1 d采用BrdU標記NSCs，移植前30 min采用0.25%胰蛋白酶消化10 min，以離心半徑6 cm、1 000 r/min離心5 min，用培養基調節濃度為2×105個/μL的細胞懸液備用。
GDNF、ChABC（PeproTech公司，美國）；將GDNF凍干粉（10 μg/支）及ChABC（5 U/支）分別采用無菌PBS液溶解，調整濃度為10 μg/mL及5 U/ mL，無菌EP管分裝，-20℃保存備用。
DAPI（Sigma公司，美國）； B27輔助生長因子、DMEM/F12（1∶1）、FBS（GIBCO公司，美國）；小鼠抗微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）IgG、FITC標記山羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物科技有限公司）；鼠抗神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）IgG、羅丹明標記山羊抗兔IgG、兔抗BrdU多克隆IgG（北京博奧森生物技術有限公司）。 BX60熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image Pro-Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將60只SD大鼠隨機分為5組（n=12），分別為假手術組（A組）、損傷對照組（B組）、NSCs+GDNF移植組（C組）、NSCs+ChABC移植組（D組）、NSCs+GDNF+ChABC移植組（E組）。各組大鼠采用2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，以T9～11棘突為中心作背部正中切口，剝離雙側椎旁肌肉，A組僅行椎板切除術、蛛網膜下腔放置PE-10號導管；其余各組咬除椎板，暴露T9～11節段脊髓，尖刀片橫斷脊髓，解剖顯微鏡下將PE-10號導管穿皮下經蛛網膜下腔置入脊髓橫斷處，固定導管。檢查無活動性出血，解剖顯微鏡下縫合硬脊膜，常規逐層縫合切口。體外導管熱壓封閉，以備后期細胞移植。術后每日協助排尿2次，直至恢復排尿反射；腹腔注射青霉素12萬U/d，連續1周。
術后第8天，C、D、E組采用微量注射器經留置導管注入BrdU標記NSCs 10 μL，A、B組注入等量生理鹽水。第8～14天每天C組經留置導管注入GDNF、生理鹽水各10 μL，D組注射ChABC、生理鹽水各10 μL，E組注射GDNF、ChABC各10 μL，A、B組注射生理鹽水20 μL。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察并記錄造模術后及細胞移植后各組大鼠切口感染情況和死亡情況。
1.3.2 后肢運動功能評定
術前1 d、術后7 d及移植后1、2、5、8周采用BBB評分 [15]評價各組大鼠后肢運動功能。
1.3.3 神經電生理檢查
術前1 d、術后7 d及移植后1、2、5、8周對各組大鼠進行SEP檢測。大鼠同上法麻醉后固定、顱頂備皮。刺激電極置于踝關節上方脛后神經處，參考電極置于遠側1 cm處，記錄電極置于冠狀縫和矢狀縫相交處頭皮下后肢皮質感覺區，給予直流單方波電脈沖刺激，刺激強度7.5 V，波寬0.2 ms，頻率3 Hz，觀察記錄SEP潛伏期的變化。
1.3.4 組織學及免疫熒光染色觀察
移植后8周神經電生理檢查后，各組大鼠給予生理鹽水和4%中性多聚甲醛PBS緩沖液心臟灌注固定。原入路暴露脊髓，以橫斷面為中心切取長約4 cm脊髓組織，石蠟包埋、連續5 μm厚切片。每組標本隨機取8張切片行HE染色，光鏡下觀察損傷區域改變情況。取8張采用一抗兔抗BrdU多克隆IgG標記神經元、二抗羅丹明標記山羊抗兔IgG顯色，DAPI復染，熒光顯微鏡下BrdU陽性細胞胞體呈橘紅色熒光。取8張加入一抗兔抗BrdU（1∶50）和鼠抗GFAP（1∶100) 混合物，二抗羅丹明標記山羊抗兔IgG（1∶50）和FITC標記羊抗小鼠IgG（1∶50）混合物顯色，熒光顯微鏡下GFAP陽性細胞呈草綠色熒光。取8 張加入一抗兔抗BrdU（1∶50）和小鼠抗MAP-2（1∶100），其余步驟同BrdU/GFAP免疫熒光雙標染色，熒光顯微鏡下MAP-2陽性細胞軸突呈草綠色熒光。每張切片取10個視野，熒光顯微鏡高倍鏡下觀察，采用Image Pro-Plus圖像分析軟件計數各免疫熒光染色陽性細胞。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
除A組外，其余各組大鼠造模、麻醉清醒后雙側后肢均表現為完全癱瘓，提示造模成功。造模術后1 只大鼠死于切口感染，4只死于腸梗阻，均給予補充。
2.2 后肢運動功能評定
細胞移植后各組大鼠雙側后肢運動功能均有所恢復，C、D、E組較B組恢復明顯，以E組恢復最佳。
各組大鼠術前BBB評分均為21分。術后7 d，除A組外，其余各組均為0分。移植后各時間點B～E組BBB評分均顯著低于A組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；移植后1周，B～E組組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；移植后2、5、8周，C～E組BBB評分逐步上升且均高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；5、8周時，E組BBB評分高于C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）。其余時間點各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠各時間點后肢運動功能BBB評分比較（n=12，2.3 神經電生理檢查
術前各組大鼠SEP潛伏期比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。術后7 d，B～E組潛伏期較A組明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05），B～E組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。移植后1、2、5、8周B～E組潛伏期亦顯著長于A組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；2、5、8周，C、D、E組潛伏期逐漸縮短，與B組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；5、8周，E組與C、D組比較潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.05）；其余時間點各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠各時間點SEP潛伏期比較(n=12，ms，2.4 組織學觀察
A組大鼠灰、白質分界清楚（圖 1 a），神經纖維束排列規則，細胞輪廓清楚、結構完整（圖 1 b）。B組大鼠脊髓破壞嚴重，損傷區域灰白質結構紊亂、無明顯界限，神經元壞死減少，有較大囊腔形成（圖 1 c）。C～E組大鼠脊髓損傷區域細胞增生明顯，星形膠質細胞增生并聚集于膠質瘢痕周圍，壞死囊腔較B組小，C、D、E組間未見明顯差異（圖 1 d～f）。
圖1
移植后8周各組HE染色觀察 ? A組（×100） ? A組（×200） ? B組（×200） ? C組（×200） ? D組（×200） ? E組（×200）
Figure1.
HE staining observation at 8 weeks after transplantation ? Group A (×100) ? Group A (×200) ? Group B (×200) ? Group C (×200) ? Group D (×200) ? Group E (×200)
2.5 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡觀察示，A、B組內未見BrdU陽性細胞；C～E組可見胞體呈橘紅色的陽性細胞，主要分布于灰、白質。高倍鏡下NSCs呈圓形或橢圓形分布于纖維束和空洞周圍（圖 2）。C、D、E組BrdU陽性細胞計數分別為（95.2±10.2）、（92.7±8.9）、（109.0±10.8）個/視野，E組顯著多于C、D組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
圖2
移植后8周各組BrdU免疫熒光染色觀察（×200） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組 ? ?各組均可見GFAP染色陽性細胞分布于斷端灰、白質空洞部位，神經元胞體向四周伸出放射狀突起，部分相互交織成網（圖 3）。A～E組陽性細胞計數分別為（16.9±2.2）、（19.8±3.0）、（13.5±2.5）（12.8±2.4）、（10.3±1.9）個/視野。C～E組GFAP陽性細胞少于A、B組，E組少于C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
各組均可見MAP-2標記陽性細胞，主要分布于脊髓灰質神經元的胞體和突起（圖 4）。A～E組MAP-2陽性細胞計數分別為（8.4±1.7）、（8.3±1.8）、（11.7±2.2）、（10.6±2.4）、（14.2±2.3）個/視野，C～E組陽性細胞多于A、B組，E組多于C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
脊髓損傷時可出現脊髓結構破壞、脊髓中神經細胞凋亡和壞死，從而遺留永久性神經功能障礙。臨床常采用手術減壓、藥物營養神經、康復理療、生物治療等方式治療脊髓損傷，但療效欠佳，很難達到滿意治療效果。因此，如何治療中樞神經系統損傷仍是研究熱點。NSCs是一類具有分化為各種細胞潛能的成體干細胞。移植NSCs于損傷脊髓處，誘導其定向分化為神經元、修復并補充脊髓中受損的神經元，對于脊髓損傷的治療具有重要意義，這種治療方式也是目前臨床和基礎學科研究治療脊髓損傷的熱點方式。Salewski等[2] 及Yao等[3]通過移植鼠胚NSCs于大鼠損傷脊髓節段的相關研究，證實NSCs移植可促進損傷脊髓的修復和功能障礙的恢復。然而NSCs定向分化為神經元及脊髓功能障礙改善仍然有限[4]。本課題組既往通過使用不同濃度的ATRA對鼠胚NSCs進行培養，發現經1.0 μmol/ L ATRA誘導培養的鼠胚NSCs向神經元分化的比例高達70%[13, 16]。因此，本實驗選取經1.0 μmol/L ATRA誘導的NSCs進行移植，以增加移植NSCs向神經元分化的比例。
動物實驗發現[17]，移植的NSCs在損傷脊髓局部微環境中細胞因子的作用下，大量向星形膠質細胞分化，從而促進膠質瘢痕形成，并且移植的NSCs在損傷脊髓處存活數量和時間均有限。隨著移植時間延長，移植的NSCs逐漸出現選擇性消融，從而導致已恢復的運動功能再次惡化[18]。導致上述改變的原因可能與損傷脊髓局部微循環中的細胞因子改變密切相關。脊髓損傷局部存在各種神經營養因子和神經修復、再生抑制因子，這些因子對促進脊髓損傷的修復意義重大。GDNF是由神經膠質細胞分泌的一種神經營養因子，它廣泛分布于脊髓中，具有促進觸突再生、脊髓損傷后神經功能恢復等作用[19]。相關研究證實，GDNF可通過激活細胞內的胞漿蛋白酪氨酸激酶Fyn和FAK等信號途徑，從而促進軸突再生和髓鞘化[8-9]。在中樞神經損傷部位還存在一些抑制因子，這些抑制因子具有抑制軸突再生、延長等作用[20-22]。CSPGs是目前認為具有抑制軸突再生的重要因子之一，是由膠質瘢痕中的星形膠質細胞分泌的多糖蛋白，對于NSCs增殖和軸突生長均具有明顯抑制作用[23]。ChABC是由普通變形桿菌產生的一種酶類，它具有催化分解黏多糖類的功能[24]。研究發現[25]，ChABC不僅可通過降低損傷脊髓局部的CAPGs，從而促進損傷軸突修復和再生，還能夠促進脊髓損傷后功能障礙的恢復。
本實驗通過對比研究經ATRA干預培養的NSCs聯合GNDF、ChABC共同移植與其分別聯合GDNF、ChABC移植治療大鼠損傷脊髓，觀察各組大鼠脊髓功能恢復情況和NSCs再生情況。研究結果發現，從移植后2周開始，C～E組大鼠神經功能障礙恢復程度均優于B組大鼠，尤其在移植后5、8周E組大鼠神經功能恢復更明顯，大鼠BBB評分、SEP潛伏期和NSCs存活數量均顯著優于C、D組，且差異有統計學意義。GFAP熒光染色觀察示，E組星形膠質細胞少于C、D組，差異有統計學意義。提示NSCs聯合GDNF、ChABC共同移植，對于降低脊髓損傷局部星形膠質細胞的形成較NSCs分別聯合GDNF、ChABC具有更好效果，對減少局部瘢痕形成、促進神經功能障礙恢復有重要作用。通過本實驗研究，我們初步認為經ATRA干預培養的NSCs聯合GNDF、ChABC移植對促進大鼠損傷脊髓神經功能恢復較單獨聯合移植治療效果更佳，且細胞因子GDNF、ChABC在治療脊髓損傷過程中具有協同作用關系。
