引用本文： 蘇春燕, 蘇鴻君, 王鵬, 馮佩, 吳燕峰. 人BMSCs分化過程中免疫能力的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(8): 1003-1008. doi: 10.7507/1002-1892.20150215 復制
MSCs是一種多能干細胞，存在于機體多種組織中，成人體內以BMSCs數量較為豐富[1-2]。近年研究發現，BMSCs除了支持造血干細胞外，還具有向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞分化的功能和低免疫原性、高免疫抑制能力等特點[3-5]，可廣泛應用于同種異體干細胞治療、組織工程修復與再生醫學領域[6-8]。然而，同種異體BMSCs作為干細胞移植治療與組織工程再生醫學的種子細胞，其在種植、分化過程中是否仍保持原有的低免疫原性和高免疫抑制能力的特點，目前尚缺乏這方面的研究。因此，本研究擬通過體外分離、培養BMSCs，并觀察其在成骨、成軟骨及成脂分化過程中人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）Ⅰ、Ⅱ類分子表達和對外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）增殖的抑制能力變化，闡明BMSCs分化過程中免疫原性和免疫抑制能力變化規律，為同種異體BMSCs的臨床應用提供理論依據和實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
H-DMEM培養基、RPMI1640培養基、青-鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PBS緩沖液、4%多聚甲醛（上海碧云天生物技術有限公司）；石蠟、二甲苯（廣州化學試劑廠）；Percoll分離液（Pharmacia Biotech公司，瑞典）；地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、胰島素、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、丙酮酸鈉、脯氨酸、羧基熒光素二醋酸鹽琥珀亞胺酯（carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CFSE）、茜素紅、甲苯胺藍、油紅O（Sigma公司，美國）；抗CD3微球、抗CD28微球（BD公司，美國）；胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑（insulin-transferrin-selenium，ITS；Corning公司，美國）；重組人TGF-β3（Peprotech公司，美國）；抗人CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、HLA-Ⅰ-PE、HLA-Ⅱ-FITC抗體（Meltenyi公司，德國）；離心管（15、50 mL）、6孔板、24孔板、25 cm2培養瓶（Corning公司，美國）；移液器（Eppendorf公司，德國）。
生物安全柜、CO2恒溫培養箱、低溫高速離心機（Thermo Fisher公司，美國）； FACSCalibur流式細胞儀（BD公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；石蠟切片機（Leica公司，德國）。
1.2 BMSCs體外分離、培養及鑒定
1.2.1 BMSCs體外分離、培養
9份骨髓樣本分別來自9名25～30歲健康志愿者，經中山大學孫逸仙紀念醫院倫理委員會批準并經志愿者知情同意。骨髓樣本加入PBS緩沖液按1∶1比例混勻，用注射器緩慢加入等量1.073 g/mL Percoll分離液，以900×g離心30 min。吸取中間白膜層并用PBS緩沖液洗滌3次，用含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基重懸后，以2×106個/cm2密度接種于25 cm2培養瓶中，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養。72 h后洗去未貼壁細胞，此后每3天換液1次。于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化，當細胞達80%～90%融合時，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化傳代，取第2～3代細胞用于后續實驗。
1.2.2 BMSCs三向分化鑒定
① 成骨分化：將BMSCs以1×105個/孔密度接種于6孔板，待細胞完全貼壁后換為成骨誘導培養基（含10%FBS、50 mg/ L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基），此后每3天換液1次。誘導14 d后行茜素紅染色，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結節形成情況。② 成軟骨分化：調整BMSCs密度為1×106 個 /μL，吸取20 μL接種于24孔板，2 h后加入成軟骨誘導培養基（含10%FBS、50 mg/L抗壞血酸、1%ITS-Premix、1 mmol/ L丙酮酸鈉、10 nmol/L地塞米松、10 ng/mL TGF-β3、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基），此后每3天換液1次。誘導14 d后收獲軟骨球，多聚甲醛固定、石蠟包埋切片后行甲苯胺藍染色，倒置相差顯微鏡下觀察軟骨形成情況。③ 成脂分化：將BMSCs以1×105個/孔密度接種于6孔板，待細胞完全貼壁后換為成脂誘導培養基（含10%FBS、10 μg/mL胰島素、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.2 mmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基），此后每3天換液1次。誘導14 d后行油紅O染色，倒置相差顯微鏡下觀察脂肪滴形成情況。
1.2.3 流式細胞儀鑒定
取第2～3代未分化BMSCs用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以450×g離心5 min后PBS緩沖液重懸計數，調整濃度為1×107個/mL。吸取90 μL細胞懸液分至各流式檢測管中，分別加入抗人CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、HLA-Ⅰ-PE、HLA-Ⅱ-FITC抗體10 μL，陰性對照管加入10 μL PBS緩沖液，充分混勻后室溫避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌3次后重懸，于FACSCalibur流式細胞儀上機檢測。
1.3 BMSCs分化過程中HLA分子表達檢測
將BMSCs以1×105個/孔密度接種于6孔板，分別加入成骨、成軟骨、成脂誘導培養基誘導分化7、14、21 d，同時將未誘導分化的BMSCs（0 d）作為對照。0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后以450×g離心5 min，用PBS緩沖液重懸并調整濃度為1×107 個 / mL。每個樣本吸取90 μL細胞懸液，分別加入抗人HLA-Ⅰ-PE和HLA-Ⅱ-FITC抗體10 μL，于4℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌3次后重懸，通過FACSCalibur流式細胞儀檢測未分化及成骨、成軟骨、成脂分化過程中BMSCs的HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ類分子表達水平。
1.4 BMSCs分化過程中免疫抑制能力檢測
1.4.1 PBMC制備
20份外周血樣本分別來自20名25～35歲健康志愿者，經中山大學孫逸仙紀念醫院倫理委員會批準并經志愿者知情同意。外周血樣本用PBS緩沖液1∶1稀釋，用注射器緩慢加入等量1.073 g/mL Percoll分離液，以900×g離心30 min。吸取中間白膜層并用PBS緩沖液洗滌3次，用PBS緩沖液調整密度為1×107個/mL。吸取1 mL細胞懸液并加入1 μL CFSE，于37℃避光孵育30 min，加入4℃預冷的FBS終止反應，并用PBS緩沖液洗滌3次，用含10%FBS的RPMI1640培養基重懸，計數備用。
1.4.2 分化BMSCs免疫抑制能力檢測
將BMSCs按1.3方法分別成骨、成軟骨、成脂誘導分化7、14、21 d后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后以450×g離心5 min，以3.3×104個/mL密度接種于6 孔板，將未誘導分化的BMSCs（0 d）作為對照，于培養箱中靜置12 h貼壁。吸去培養基，按3.3×105個 / mL密度將PBMC接種于上述6孔板，按10∶1比例將PBMC與BMSCs共培養5 d，同時加入抗CD3（0.2 μg/ mL）、CD28（1 μg/mL）微球刺激PBMC增殖，分別以未加入抗CD3、CD28微球為陰性對照，以加入抗CD3、CD28微球但未加入BMSCs作為陽性對照。刺激增殖5 d后收集共培養體系中的PBMC，用PBS緩沖液洗滌、重懸后通過FACSCalibur流式細胞儀檢測其CFSE熒光強弱水平作為PBMC的增殖能力指標，以檢測未分化及成骨、成軟骨、成脂分化過程中BMSCs的免疫抑制能力。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs的形態、分化與表型鑒定
原代及傳代后BMSCs均呈梭形、成纖維細胞樣生長（圖 1）。成骨誘導14 d后茜素紅染色呈陽性，鏡下可見多個大小不等的紅色鈣結節；成軟骨誘導14 d后甲苯胺藍染色呈陽性，鏡下可見軟骨球切片呈藍紫色；成脂誘導14 d后油紅O染色呈陽性，鏡下可見細胞內多個紅色脂肪滴形成（圖 2）。流式細胞儀檢測示，BMSCs表型CD14、CD45、HLA-DR表達為陰性，CD29、CD44、CD105表達為陽性，符合MSCs表型特征（圖 3）。
圖1
第3代BMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? ?2.2 BMSCs分化過程中HLA分子表達檢測
未分化BMSCs表達HLA-Ⅰ類分子，基本不表達HLA-Ⅱ類分子。成骨、成軟骨分化過程中HLA-Ⅰ、Ⅱ類分子表達無明顯改變，各時間點間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），且HLA-Ⅱ類分子表達水平均較低。成脂分化14、21 d HLA-Ⅰ類分子表達升高，與0、7 d比較差異有統計學意義（P＜0.05）；14、21 d間差異無統計學意義（P＞0.05）。成脂分化7、14、21 d HLA-Ⅱ類分子表達也逐漸出現并升高，均顯著高于0 d，差異有統計學意義（P＜0.05）；7、14、21 d間差異亦有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
圖5
流式細胞儀檢測BMSCs分化過程中對PBMC增殖的抑制能力 ? 單純PBMC ? 加入抗CD3、CD28微球刺激后 ? 未分化BMSCs ? BMSCs成骨分化7 d ? BMSCs成骨分化14 d ? BMSCs成骨分化21 d ? BMSCs成軟骨分化7 d ? BMSCs成軟骨分化14 d ? BMSCs成軟骨分化21 d ? BMSCs成脂分化7 d ? BMSCs成脂分化14 d ? BMSCs成脂分化21 d ? ?2.3 BMSCs分化過程中免疫抑制能力檢測
PBMC在無抗CD3、CD28微球刺激下無明顯增殖，加入抗CD3、CD28微球后顯著增殖，未分化BMSCs能顯著抑制PBMC的增殖。成骨、成軟骨分化過程中BMSCs抑制PBMC增殖能力無明顯改變，各時間點間差異均無統計學意義（P＞0.05）。成脂分化7、14、21 d，BMSCs抑制PBMC增殖能力逐漸減弱，共培養體系中PBMC增殖顯著增加，各時間點間差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 5、6。
3 討論
同種異體干細胞移植、組織工程與再生醫學是當前多種自身免疫性疾病治療、組織缺損修復的研究熱點。MSCs具有自我更新和多向分化潛能，同時具備低免疫原性和強免疫抑制能力的特點，是干細胞治療、組織工程與再生醫學的重要種子細胞[9-12]。BMSCs作為MSCs中的一類，在成人體內數量豐富，取材、分離、培養方法簡便。我們在體外成功分離、培養了BMSCs，觀察顯示其在細胞形態及細胞表型方面與其他MSCs一致，也具備向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂細胞分化的能力，同時未分化的BMSCs表達HLA-Ⅰ類分子、不表達HLA-Ⅱ類分子、能夠抑制PBMC的增殖，這與既往文獻報道結果一致[6]，說明BMSCs具備作為主要種子細胞的潛在優勢。目前，BMSCs已開始應用于軟骨缺損修復[13]、骨組織修復[7]、慢性損傷治療[14]等組織工程和再生醫學的前期臨床研究，而BMSCs的免疫學特性卻很大程度上影響其移植后的功能發揮[15-16]。然而，體內移植后分化的BMSCs是否仍具有未分化前的低免疫原性和強免疫抑制能力，以防止分化后的體內排斥反應？BMSCs在體外按照需要定向誘導分化后再進行移植治療，是否仍能保持其低免疫原性和強免疫抑制能力的特點？這些問題目前仍缺乏相關研究。因此，本研究通過流式細胞術檢測BMSCs成骨、成軟骨和成脂分化過程中的HLA表達及對PBMC增殖的抑制能力，以期明確BMSCs在分化過程中免疫原性和免疫抑制能力的變化。
通過流式細胞術檢測我們發現，成骨、成軟骨分化7、14、21 d，BMSCs的HLA-Ⅰ、Ⅱ類分子表達與未分化BMSCs無顯著差異，而成脂分化7、14、21 d，BMSCs的HLA-Ⅰ、Ⅱ類分子表達逐漸增加并顯著高于未分化BMSCs，提示BMSCs在成骨、成軟骨分化過程中免疫原性無明顯改變，而在成脂分化過程中BMSCs的免疫原性卻可能有所增強。我們以抗CD3、CD28微球刺激PBMC增殖模擬體內環境，進一步檢測分化過程中BMSCs免疫抑制能力的改變。結果發現成骨、成軟骨分化過程中BMSCs抑制PBMC增殖能力均無明顯改變，而成脂分化7、14、21 d BMSCs抑制PBMC增殖能力逐漸降低，提示BMSCs免疫抑制能力在成骨、成軟骨分化過程中變化不大，而在成脂分化過程中持續降 低。
Le Blanc等[17]曾研究BMSCs在分化過程中 的HLA表達及其免疫學特性，結果提示BMSCs在成骨、成軟骨及成脂分化后HLA表達均無明顯改變，分化前后BMSCs均具有免疫調節效應，這與本研究的部分結論有所不同。然而，該研究僅檢測了BMSCs分化6、12 d的免疫原性及免疫抑制能力，屬于BMSCs分化早期階段，而BMSCs在體內移植后的分化屬于一長期過程，故該研究具有一定局限性。我們通過對BMSCs整個分化過程（7、14、21 d）中的免疫學特性進行檢測，發現其免疫原性及免疫抑制能力的顯著性變化出現在成脂分化14 d后（中晚期階段），提示BMSCs分化早期免疫學特性可能無明顯變化而中晚期變化明顯。楊大威等[18]也曾對臍帶血來源MSCs成骨分化后免疫原性進行研究，發現成骨分化后臍帶血來源MSCs免疫原性增加而免疫抑制能力降低，這不僅說明不同組織來源的MSCs在分化后免疫學特性可能出現不同改變，也說明BMSCs相對臍帶血來源MSCs更適合作為同種異體干細胞移植治療與組織工程再生醫學的種子細胞。
綜上述，本研究結果提示BMSCs除具有向成骨、成軟骨、成脂分化潛能，還具有低免疫原性和強免疫抑制能力，成骨、成軟骨分化的BMSCs免疫原性無明顯改變而免疫抑制能力顯著增加，適合作為組織工程種子細胞；而成脂分化的BMSCs免疫原性顯著增加而免疫抑制能力降低，不適合作為組織工程的種子細胞。下一步我們將深入研究BMSCs分化過程中出現免疫學特性改變的原因，為BMSCs在組織工程與再生醫學中的應用提供更多理論基礎和實驗依據。
MSCs是一種多能干細胞，存在于機體多種組織中，成人體內以BMSCs數量較為豐富[1-2]。近年研究發現，BMSCs除了支持造血干細胞外，還具有向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞分化的功能和低免疫原性、高免疫抑制能力等特點[3-5]，可廣泛應用于同種異體干細胞治療、組織工程修復與再生醫學領域[6-8]。然而，同種異體BMSCs作為干細胞移植治療與組織工程再生醫學的種子細胞，其在種植、分化過程中是否仍保持原有的低免疫原性和高免疫抑制能力的特點，目前尚缺乏這方面的研究。因此，本研究擬通過體外分離、培養BMSCs，并觀察其在成骨、成軟骨及成脂分化過程中人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）Ⅰ、Ⅱ類分子表達和對外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）增殖的抑制能力變化，闡明BMSCs分化過程中免疫原性和免疫抑制能力變化規律，為同種異體BMSCs的臨床應用提供理論依據和實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
H-DMEM培養基、RPMI1640培養基、青-鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PBS緩沖液、4%多聚甲醛（上海碧云天生物技術有限公司）；石蠟、二甲苯（廣州化學試劑廠）；Percoll分離液（Pharmacia Biotech公司，瑞典）；地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、胰島素、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、丙酮酸鈉、脯氨酸、羧基熒光素二醋酸鹽琥珀亞胺酯（carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CFSE）、茜素紅、甲苯胺藍、油紅O（Sigma公司，美國）；抗CD3微球、抗CD28微球（BD公司，美國）；胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑（insulin-transferrin-selenium，ITS；Corning公司，美國）；重組人TGF-β3（Peprotech公司，美國）；抗人CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、HLA-Ⅰ-PE、HLA-Ⅱ-FITC抗體（Meltenyi公司，德國）；離心管（15、50 mL）、6孔板、24孔板、25 cm2培養瓶（Corning公司，美國）；移液器（Eppendorf公司，德國）。
生物安全柜、CO2恒溫培養箱、低溫高速離心機（Thermo Fisher公司，美國）； FACSCalibur流式細胞儀（BD公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；石蠟切片機（Leica公司，德國）。
1.2 BMSCs體外分離、培養及鑒定
1.2.1 BMSCs體外分離、培養
9份骨髓樣本分別來自9名25～30歲健康志愿者，經中山大學孫逸仙紀念醫院倫理委員會批準并經志愿者知情同意。骨髓樣本加入PBS緩沖液按1∶1比例混勻，用注射器緩慢加入等量1.073 g/mL Percoll分離液，以900×g離心30 min。吸取中間白膜層并用PBS緩沖液洗滌3次，用含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基重懸后，以2×106個/cm2密度接種于25 cm2培養瓶中，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養。72 h后洗去未貼壁細胞，此后每3天換液1次。于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化，當細胞達80%～90%融合時，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化傳代，取第2～3代細胞用于后續實驗。
1.2.2 BMSCs三向分化鑒定
① 成骨分化：將BMSCs以1×105個/孔密度接種于6孔板，待細胞完全貼壁后換為成骨誘導培養基（含10%FBS、50 mg/ L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基），此后每3天換液1次。誘導14 d后行茜素紅染色，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結節形成情況。② 成軟骨分化：調整BMSCs密度為1×106 個 /μL，吸取20 μL接種于24孔板，2 h后加入成軟骨誘導培養基（含10%FBS、50 mg/L抗壞血酸、1%ITS-Premix、1 mmol/ L丙酮酸鈉、10 nmol/L地塞米松、10 ng/mL TGF-β3、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基），此后每3天換液1次。誘導14 d后收獲軟骨球，多聚甲醛固定、石蠟包埋切片后行甲苯胺藍染色，倒置相差顯微鏡下觀察軟骨形成情況。③ 成脂分化：將BMSCs以1×105個/孔密度接種于6孔板，待細胞完全貼壁后換為成脂誘導培養基（含10%FBS、10 μg/mL胰島素、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.2 mmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基），此后每3天換液1次。誘導14 d后行油紅O染色，倒置相差顯微鏡下觀察脂肪滴形成情況。
1.2.3 流式細胞儀鑒定
取第2～3代未分化BMSCs用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以450×g離心5 min后PBS緩沖液重懸計數，調整濃度為1×107個/mL。吸取90 μL細胞懸液分至各流式檢測管中，分別加入抗人CD14-PE、CD45-FITC、HLA-DR-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、HLA-Ⅰ-PE、HLA-Ⅱ-FITC抗體10 μL，陰性對照管加入10 μL PBS緩沖液，充分混勻后室溫避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌3次后重懸，于FACSCalibur流式細胞儀上機檢測。
1.3 BMSCs分化過程中HLA分子表達檢測
將BMSCs以1×105個/孔密度接種于6孔板，分別加入成骨、成軟骨、成脂誘導培養基誘導分化7、14、21 d，同時將未誘導分化的BMSCs（0 d）作為對照。0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后以450×g離心5 min，用PBS緩沖液重懸并調整濃度為1×107 個 / mL。每個樣本吸取90 μL細胞懸液，分別加入抗人HLA-Ⅰ-PE和HLA-Ⅱ-FITC抗體10 μL，于4℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌3次后重懸，通過FACSCalibur流式細胞儀檢測未分化及成骨、成軟骨、成脂分化過程中BMSCs的HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ類分子表達水平。
1.4 BMSCs分化過程中免疫抑制能力檢測
1.4.1 PBMC制備
20份外周血樣本分別來自20名25～35歲健康志愿者，經中山大學孫逸仙紀念醫院倫理委員會批準并經志愿者知情同意。外周血樣本用PBS緩沖液1∶1稀釋，用注射器緩慢加入等量1.073 g/mL Percoll分離液，以900×g離心30 min。吸取中間白膜層并用PBS緩沖液洗滌3次，用PBS緩沖液調整密度為1×107個/mL。吸取1 mL細胞懸液并加入1 μL CFSE，于37℃避光孵育30 min，加入4℃預冷的FBS終止反應，并用PBS緩沖液洗滌3次，用含10%FBS的RPMI1640培養基重懸，計數備用。
1.4.2 分化BMSCs免疫抑制能力檢測
將BMSCs按1.3方法分別成骨、成軟骨、成脂誘導分化7、14、21 d后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后以450×g離心5 min，以3.3×104個/mL密度接種于6 孔板，將未誘導分化的BMSCs（0 d）作為對照，于培養箱中靜置12 h貼壁。吸去培養基，按3.3×105個 / mL密度將PBMC接種于上述6孔板，按10∶1比例將PBMC與BMSCs共培養5 d，同時加入抗CD3（0.2 μg/ mL）、CD28（1 μg/mL）微球刺激PBMC增殖，分別以未加入抗CD3、CD28微球為陰性對照，以加入抗CD3、CD28微球但未加入BMSCs作為陽性對照。刺激增殖5 d后收集共培養體系中的PBMC，用PBS緩沖液洗滌、重懸后通過FACSCalibur流式細胞儀檢測其CFSE熒光強弱水平作為PBMC的增殖能力指標，以檢測未分化及成骨、成軟骨、成脂分化過程中BMSCs的免疫抑制能力。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs的形態、分化與表型鑒定
原代及傳代后BMSCs均呈梭形、成纖維細胞樣生長（圖 1）。成骨誘導14 d后茜素紅染色呈陽性，鏡下可見多個大小不等的紅色鈣結節；成軟骨誘導14 d后甲苯胺藍染色呈陽性，鏡下可見軟骨球切片呈藍紫色；成脂誘導14 d后油紅O染色呈陽性，鏡下可見細胞內多個紅色脂肪滴形成（圖 2）。流式細胞儀檢測示，BMSCs表型CD14、CD45、HLA-DR表達為陰性，CD29、CD44、CD105表達為陽性，符合MSCs表型特征（圖 3）。
圖1
第3代BMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? ?2.2 BMSCs分化過程中HLA分子表達檢測
未分化BMSCs表達HLA-Ⅰ類分子，基本不表達HLA-Ⅱ類分子。成骨、成軟骨分化過程中HLA-Ⅰ、Ⅱ類分子表達無明顯改變，各時間點間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），且HLA-Ⅱ類分子表達水平均較低。成脂分化14、21 d HLA-Ⅰ類分子表達升高，與0、7 d比較差異有統計學意義（P＜0.05）；14、21 d間差異無統計學意義（P＞0.05）。成脂分化7、14、21 d HLA-Ⅱ類分子表達也逐漸出現并升高，均顯著高于0 d，差異有統計學意義（P＜0.05）；7、14、21 d間差異亦有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
圖5
流式細胞儀檢測BMSCs分化過程中對PBMC增殖的抑制能力 ? 單純PBMC ? 加入抗CD3、CD28微球刺激后 ? 未分化BMSCs ? BMSCs成骨分化7 d ? BMSCs成骨分化14 d ? BMSCs成骨分化21 d ? BMSCs成軟骨分化7 d ? BMSCs成軟骨分化14 d ? BMSCs成軟骨分化21 d ? BMSCs成脂分化7 d ? BMSCs成脂分化14 d ? BMSCs成脂分化21 d ? ?2.3 BMSCs分化過程中免疫抑制能力檢測
PBMC在無抗CD3、CD28微球刺激下無明顯增殖，加入抗CD3、CD28微球后顯著增殖，未分化BMSCs能顯著抑制PBMC的增殖。成骨、成軟骨分化過程中BMSCs抑制PBMC增殖能力無明顯改變，各時間點間差異均無統計學意義（P＞0.05）。成脂分化7、14、21 d，BMSCs抑制PBMC增殖能力逐漸減弱，共培養體系中PBMC增殖顯著增加，各時間點間差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 5、6。
3 討論
同種異體干細胞移植、組織工程與再生醫學是當前多種自身免疫性疾病治療、組織缺損修復的研究熱點。MSCs具有自我更新和多向分化潛能，同時具備低免疫原性和強免疫抑制能力的特點，是干細胞治療、組織工程與再生醫學的重要種子細胞[9-12]。BMSCs作為MSCs中的一類，在成人體內數量豐富，取材、分離、培養方法簡便。我們在體外成功分離、培養了BMSCs，觀察顯示其在細胞形態及細胞表型方面與其他MSCs一致，也具備向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂細胞分化的能力，同時未分化的BMSCs表達HLA-Ⅰ類分子、不表達HLA-Ⅱ類分子、能夠抑制PBMC的增殖，這與既往文獻報道結果一致[6]，說明BMSCs具備作為主要種子細胞的潛在優勢。目前，BMSCs已開始應用于軟骨缺損修復[13]、骨組織修復[7]、慢性損傷治療[14]等組織工程和再生醫學的前期臨床研究，而BMSCs的免疫學特性卻很大程度上影響其移植后的功能發揮[15-16]。然而，體內移植后分化的BMSCs是否仍具有未分化前的低免疫原性和強免疫抑制能力，以防止分化后的體內排斥反應？BMSCs在體外按照需要定向誘導分化后再進行移植治療，是否仍能保持其低免疫原性和強免疫抑制能力的特點？這些問題目前仍缺乏相關研究。因此，本研究通過流式細胞術檢測BMSCs成骨、成軟骨和成脂分化過程中的HLA表達及對PBMC增殖的抑制能力，以期明確BMSCs在分化過程中免疫原性和免疫抑制能力的變化。
通過流式細胞術檢測我們發現，成骨、成軟骨分化7、14、21 d，BMSCs的HLA-Ⅰ、Ⅱ類分子表達與未分化BMSCs無顯著差異，而成脂分化7、14、21 d，BMSCs的HLA-Ⅰ、Ⅱ類分子表達逐漸增加并顯著高于未分化BMSCs，提示BMSCs在成骨、成軟骨分化過程中免疫原性無明顯改變，而在成脂分化過程中BMSCs的免疫原性卻可能有所增強。我們以抗CD3、CD28微球刺激PBMC增殖模擬體內環境，進一步檢測分化過程中BMSCs免疫抑制能力的改變。結果發現成骨、成軟骨分化過程中BMSCs抑制PBMC增殖能力均無明顯改變，而成脂分化7、14、21 d BMSCs抑制PBMC增殖能力逐漸降低，提示BMSCs免疫抑制能力在成骨、成軟骨分化過程中變化不大，而在成脂分化過程中持續降 低。
Le Blanc等[17]曾研究BMSCs在分化過程中 的HLA表達及其免疫學特性，結果提示BMSCs在成骨、成軟骨及成脂分化后HLA表達均無明顯改變，分化前后BMSCs均具有免疫調節效應，這與本研究的部分結論有所不同。然而，該研究僅檢測了BMSCs分化6、12 d的免疫原性及免疫抑制能力，屬于BMSCs分化早期階段，而BMSCs在體內移植后的分化屬于一長期過程，故該研究具有一定局限性。我們通過對BMSCs整個分化過程（7、14、21 d）中的免疫學特性進行檢測，發現其免疫原性及免疫抑制能力的顯著性變化出現在成脂分化14 d后（中晚期階段），提示BMSCs分化早期免疫學特性可能無明顯變化而中晚期變化明顯。楊大威等[18]也曾對臍帶血來源MSCs成骨分化后免疫原性進行研究，發現成骨分化后臍帶血來源MSCs免疫原性增加而免疫抑制能力降低，這不僅說明不同組織來源的MSCs在分化后免疫學特性可能出現不同改變，也說明BMSCs相對臍帶血來源MSCs更適合作為同種異體干細胞移植治療與組織工程再生醫學的種子細胞。
綜上述，本研究結果提示BMSCs除具有向成骨、成軟骨、成脂分化潛能，還具有低免疫原性和強免疫抑制能力，成骨、成軟骨分化的BMSCs免疫原性無明顯改變而免疫抑制能力顯著增加，適合作為組織工程種子細胞；而成脂分化的BMSCs免疫原性顯著增加而免疫抑制能力降低，不適合作為組織工程的種子細胞。下一步我們將深入研究BMSCs分化過程中出現免疫學特性改變的原因，為BMSCs在組織工程與再生醫學中的應用提供更多理論基礎和實驗依據。
