引用本文： 徐立璋, 鄧國英, 王偉恒, 黃曉東, 楊向群, 葉曉健. BMSCs旁分泌對軟骨細胞IL-1β損傷后的保護作用. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(8): 996-1002. doi: 10.7507/1002-1892.20150214 復制
組織工程研究主要涉及種子細胞、支架材料及生長因子三大要素[1]。在種子細胞方面，研究者不斷從生物體內尋找來源更廣、功能更強的種子細胞[2]，甚至成功使用基因重組技術實現了成體細胞向具有完全干性細胞的轉變[3]，使其更好地適應植入體內后的局部環境，實現局部組織的功能性再生。組織工程的最終目的是實現缺損組織的修復和再生，因此最后所有研究均將圍繞在體實驗進行。無論以何種方式（手術移植或介入注射）將組織工程復合物植入體內，均面臨同樣問題：有創操作后局部炎性反應不可避免[4]，會產生IL-1β等多種炎性因子，導致局部微環境變化乃至周圍細胞的損傷與凋亡[5]，繼而導致移植物難以融合。因此，移植同時抑制局部炎癥，減少細胞凋亡，對成功融合具有重要意義。本研究擬通過經典的炎癥刺激模擬體內損傷，再由Transwell小室間接共同培養系統模擬體內細胞旁分泌作用過程，研究BMSCs對軟骨細胞IL-1β損傷后的保護作用，以及BMSCs存在時軟骨細胞對于IL-1β抵抗能力的變化。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年SD大鼠8只，體重（100±10）g；3周齡SD大鼠6只，體重（40±5）g；雌雄不限，均購自第二軍醫大學動物中心。本實驗中對所有動物的實驗處理過程均符合動物實驗倫理要求。
DMEM/F12培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；兔抗大鼠Ⅱ型膠原抗體、小鼠抗兔單克隆熒光二抗（Abcam公司，美國）；兔抗大鼠波形蛋白（Vimentin）抗體（Santa公司，美國）；CD45、CD31、CD90、CD29流式分析抗體及同型對照，Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（BD公司，美國）；成骨及成脂分化培養基（Cyagen公司，美國）；0.4 μm孔徑Transwell小室（Millipore公司，美國）；IL-1β ELISA試劑盒（RD公司，美國）；SYBR Green Realtime PCR master Mix試劑盒（TOYOBO Biotech公司，日本）；Revert Aid一步法逆轉錄試劑盒（Fermentas公司，美國）；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）ELISA試劑盒（Novus Biologicals公司，美國）。流式細胞儀（BD公司，美國）；BX53熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Mx3000P PCR儀（Stratagene公司，美國）；Model 680酶標儀、MyiQTM儀器（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 細胞培養及鑒定
1.2.1 BMSCs
取3周齡SD大鼠6只以CO2窒息處死后，置于75%乙醇中消毒10 min；無菌條件下取雙側股骨和脛骨，仔細剝離干凈后剪除兩端骨骺，用5 mL注射器吸取DMEM/F12培養液沖洗骨髓腔至骨髓腔變白；將骨髓腔沖洗液以半徑15 cm、1 000 r/min離心5 min后，用完全培養基[含10%FBS、1%三抗（青-鏈-慶大霉素）的DMEM/F12培養基]重懸。收集細胞懸液，以1×105個/ mL濃度、15 mL/瓶接種于T75培養瓶中，于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養；24 h后換液，之后每3天換液；6～7 d傳代，首次傳代無需擴增，仍傳于T75培養瓶內，后每3～4天傳代，擴增比例為1∶2。實驗使用第4～5代細胞，使用前行CD45、CD31、CD90、CD29流式細胞儀檢測；并行成骨、成脂誘導分化鑒定以及Vimentin免疫熒光染色鑒定。
1.2.2 軟骨細胞
取成年SD大鼠2只以CO2窒息處死后，置于75%乙醇中消毒10 min；無菌條件下取膝關節及髖關節軟骨置于無血清DMEM/F12培養基中，顯微鏡下將附著韌帶、結締組織膜去除干凈。加入3%Ⅱ型膠原酶，使用顯微剪剪碎至1 mm大小，37℃孵育45 min后加入5倍體積無血清DMEM/F12培養基，37℃孵育12 h。消化結束后，加入完全培養基同上法離心5 min；棄上清，使用完全培養基重懸后，200目網篩過濾，以1×104個/mL濃度、15 mL/ 瓶接種于T75培養瓶內。之后每3天換液，6～7 d傳代。實驗使用第4～5代細胞，使用前行Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定。
1.3 動物體內損傷現象研究
1.3.1 實驗分組
取成年SD大鼠6只隨機分為2 組，每組3只。采用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，無菌條件下，手術打開膝關節囊，暴露膝關節軟骨。實驗組用顯微剪于膝關節軟骨股骨面制造一2 mm×2 mm的缺損，深度約1 mm；對照組為假手術組，暴露膝關節軟骨后不作損傷處理。6 h后取實驗組缺損處附近軟骨及對照組相應位置軟骨進行以下檢測。
1.3.2 實時定量PCR（quantitative
real-time PCR，qRT-PCR）檢測 使用Trizol提取軟骨細胞和組織內RNA后，用Revert Aid一步法逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。根據目的基因在GeneBank中的已知序列，采用Primer5.0設計引物，引物序列見表 1。純度測定合格后，使用MyiQTM儀器，以SYBR Green Realtime PCR master Mix試劑盒完成qRT-PCR測定，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt方法計算IL-1β mRNA相對表達量，分別獨立重復3次，取均 值。
表1
qRT-PCR檢測中各基因引物序列
Table1.
Primer sequence for qRT-PCR
1.3.3 ELISA法檢測
取相應部位軟骨進行組織勻漿，4℃以半徑10 cm、2 500 r/min離心10 min后，取上清液100 μL/孔加入酶標板，37℃孵育90 min；加入100 μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，洗滌3次；加入100 μL酶結合物工作液，37℃孵育30 min，洗滌5次；加入90 μL底物溶液，37℃孵育15 min，加入50 μL終止液，置于酶標儀450 nm波長處測量吸光度（A）值，計算IL-1β的相對含量。
1.4 BMSCs修復功能實驗
1.4.1 實驗分組
將軟骨細胞以1×105個/孔密度接種于6孔板內，BMSCs以相同密度接種于Transwell小室內備用。隨機選取18孔軟骨細胞，使用含20 ng/mL IL-1β的無血清DMEM/F12培養基干預其中12個孔（分為損傷組和共同培養組，每組6孔），空白組6孔僅使用無血清DMEM/F12培養基培養。24 h后所有細胞均使用PBS洗滌并更換為完全培養基，共同培養組6孔置入含BMSCs的Transwell小室，余兩組僅更換完全培養基，每孔內培養基含量為5 mL以確保上層細胞完全浸入。24 h后取各組細胞進行以下檢測。
1.4.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率
3組隨機各取3孔經AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒染色后使用流式細胞儀分析。分別將孔內上清液中懸浮細胞和經胰蛋白酶消化下來的貼壁細胞一同收集至離心管中，使用試劑盒內自帶結合緩沖液洗滌3次后，調整細胞密度為1×106個/mL，取100 μL細胞懸液，分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 和5 μL碘化啶，染色15 min后，使用結合緩沖液稀釋至500 μL后上流式細胞儀檢測。使用同種細胞單染調電壓和分群，所有樣本在染色1 h內完成檢測；以雙陽性和FITC陽性細胞占選定范圍內細胞比例為細胞凋亡 率。
1.4.3 qRT-PCR檢測
取3組其余各孔細胞，同1.3.2方法采用qRT-PCR法測定Caspase-3和含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶4（a disintegrin and metalloprotease with Thrombospondin motifs 4，ADAMTS-4）、ADAMTS-5 mRNA相對表達量。各引物序列見表 1。
1.4.4 ELISA法檢測
同1.3.3方法采用ELISA法檢測各組Caspase-3的相對含量。
1.5 BMSCs保護功能實驗
將軟骨細胞以1×105個/孔密度接種于6孔板內，BMSCs以相同密度接種于Transwell小室內備用。隨機選擇12孔軟骨細胞，分為兩組，共同培養組6 孔置入含BMSCs的Transwell小室，對照組不置入Transwell小室。兩組同時使用含20 ng/mL IL-1β的無血清DMEM/F12培養基干預，每孔內培養基含量為5 mL以確保上層細胞完全浸入。24 h后，同1.4.2方法采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，同1.3.2方法采用qRT-PCR檢測Caspase-3、ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA相對表達量，并采用Caspase-3試劑盒直接測定各樣本中Caspase-3的相對含量。
1.6 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs及軟骨細胞鑒定
BMSCs流式細胞儀分析結果示，CD29、CD90表達陽性，CD31、CD45表達陰性（圖 1）。BMSCs經成骨和成脂誘導培養2周后，可見明顯的鈣結節及脂滴，具有成骨、成脂分化潛能（圖 2）。免疫熒光染色示，鏡下幾乎所有BMSCs的Vimentin表達均陽性（圖 3 a）；軟骨細胞形態均一，且Ⅱ型膠原呈強陽性表達（圖 3 b）。
圖1
BMSCs流式細胞儀檢測 ? CD29 ? CD90 ? CD31 ? CD45 ? ?2.2 動物體內損傷現象研究
對照組和實驗組IL-1β mRNA相對表達量分別為1.024±0.109和3.083±0.130，ELISA法檢測IL-1β含量分別為1.027±0.106和2.613±0.159，比較差異均有統計學意義（t=12.20，P=0.000；t=8.254，P=0.001）。
2.3 BMSCs修復功能實驗結果
各檢測結果示，損傷組和共同培養組Caspase-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5 mRNA相對表達量及Caspase-3含量、細胞凋亡率均顯著高于空白組，損傷組顯著高于共同培養組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2、圖 4。
表2
BMSCs修復功能實驗qRT-PCR、ELISA法和細胞凋亡檢測結果（n=6，2.4 BMSCs保護功能實驗結果
共同培養組Caspase-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5 mRNA相對表達量及Caspase-3含量、細胞凋亡率均顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3、圖 5。
表3
BMSCs保護功能實驗qRT-PCR、ELISA法和細胞凋亡檢測結果（n=6，3 討論
目前研究證實，BMSCs可通過分泌細胞因子調節區域微環境，促進細胞增殖[6]，并起到抗炎癥、抗凋亡的作用[7-8]。因此，在組織工程領域，如何將這一常用種子細胞的潛在功能更好地發揮出來，對移植后微環境的改善和維持具有重要意義。在既往研究中，研究者主要使用在體實驗研究BMSCs的優勢，但存在的主要問題是體內環境的復雜性大大增加了對類似BMSCs的種子細胞潛在功能的研究難度，降低了其研究的精確性。
IL-1β作為經典的炎性誘導因子，具有誘導COX2、基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）、MMP-3、MMP-13以及IL-6 mRNA表達的作用[9]，且作為穩定的干預因素被用于諸多細胞實驗[5]。多聚蛋白聚糖主要存在于軟骨，其以特殊的形式與透明質酸相互作用，形成高分子聚合物以耐受壓縮力及水分滲入，從而使得軟骨組織具有承受負荷的獨特能力。目前研究表明多聚蛋白聚糖酶在多聚蛋白聚糖降解中起著重要作用[10]。ADAMTS-4、ADAMTS-5多聚蛋白聚糖酶可在炎癥或其他刺激下表達增多，水解多聚蛋白聚糖造成關節軟骨退變[11]。在一定程度上，其表達量的高低同局部軟骨退變程度密切相關。Caspase-3在凋亡通路中處于最終的核心位置[12]，是重要的凋亡評價指標。
因此，本實驗應用0.4 μm孔徑Transwell小室建立體外細胞間接作用模型，可將兩種細胞有效隔離，在模擬體內細胞旁分泌作用過程的同時，保證BMSCs不能通過變形運動實現遷移，從而直接而單純地研究下層細胞變化。使用IL-1β相對含量對動物體內損傷進行評估，是在復雜的損傷反應表達中相對恰當的指標；而在細胞實驗中則排除與干預因素相同的IL-1β及其平行因子，選用由炎癥激活且在軟骨退變中具有重要意義的ADAMTS-4、ADAMTS-5作為炎癥評價指標[13-14]。本實驗首次體外多層面明確表明了BMSCs可通過旁分泌途徑促進損傷后軟骨細胞修復，并且能提高軟骨細胞對IL-1β的抵抗作用。本實驗以IL-1β為線索，自大體評估到體外干預，相對完整地論證了BMSCs作為種子細胞時，其旁分泌功能可能具有的抗炎癥、抗凋亡能力，在組織工程臨床應用中具有重要意義。
有關研究表明，炎性培養基中的BMSCs可降低NF-κB的活性，從而控制一系列炎性反應[15]。在由脂多糖誘導的急性肺損傷中模型中，BMSCs可大量分泌具有較強抗炎能力的TNF誘導基因6蛋白[16]。而在脂多糖或燒傷誘導的動物損傷模型中，MSCs可通過增加另一種抗炎因子IL-10的分泌，上調蛋白激酶B、絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶1和Rik1相關因子1的基因表達，來降低器官損傷[17]。另外，MSCs還可通過旁分泌IGF-1激活基質細胞衍生因子1α信號通路，以動員BMSCs促進缺血的心肌修復[18]。同時，BMSCs分泌的TGF-β和前列腺素E2可通過抑制淋巴細胞來降低炎性反應[19-20]。BMSCs旁分泌的抗凋亡作用則可能是通過其產生的具有抑制氧化應激作用的生長因子實現，這些生長因子可能可促進抗氧化物活性以及調節過度活化的線粒體。體內外實驗均證實，MSCs及其上清液可顯著提高治療組Akt水平，進而可通過磷酸化途徑降低促凋亡基因BAD凋亡通路的活性，實現抗凋亡效果[21-23]。
本研究結果顯示炎癥刺激后軟骨細胞ADAMTS-4、ADAMTS-5的基因表達顯著增高，與BMSCs共同培養后，其表達量顯著降低。因此可認為，在控制軟骨退變中，BMSCs旁分泌功能也起到積極作用。作為組織工程復合體，移植過程不僅造成了直接的破壞和炎癥損傷，也由于局部微環境和力學改變可引起近期和遠期的軟骨退變。而種子細胞旁分泌功能在抗炎癥、抗凋亡作用外，在減緩軟骨退行性病變中也具有相當的潛力。
綜上述，在組織工程復合材料向大體內移植的過程中，醫源性損傷所導致的炎性反應難以避免，作為種子細胞的BMSCs可通過旁分泌實現對損傷細胞的治療作用，并可增強未損傷細胞對IL-1β所造成炎性反應的抵抗能力。進一步發掘種子細胞潛在的抗炎癥和抗凋亡能力，在組織工程在體應用中具有重要意義。
組織工程研究主要涉及種子細胞、支架材料及生長因子三大要素[1]。在種子細胞方面，研究者不斷從生物體內尋找來源更廣、功能更強的種子細胞[2]，甚至成功使用基因重組技術實現了成體細胞向具有完全干性細胞的轉變[3]，使其更好地適應植入體內后的局部環境，實現局部組織的功能性再生。組織工程的最終目的是實現缺損組織的修復和再生，因此最后所有研究均將圍繞在體實驗進行。無論以何種方式（手術移植或介入注射）將組織工程復合物植入體內，均面臨同樣問題：有創操作后局部炎性反應不可避免[4]，會產生IL-1β等多種炎性因子，導致局部微環境變化乃至周圍細胞的損傷與凋亡[5]，繼而導致移植物難以融合。因此，移植同時抑制局部炎癥，減少細胞凋亡，對成功融合具有重要意義。本研究擬通過經典的炎癥刺激模擬體內損傷，再由Transwell小室間接共同培養系統模擬體內細胞旁分泌作用過程，研究BMSCs對軟骨細胞IL-1β損傷后的保護作用，以及BMSCs存在時軟骨細胞對于IL-1β抵抗能力的變化。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年SD大鼠8只，體重（100±10）g；3周齡SD大鼠6只，體重（40±5）g；雌雄不限，均購自第二軍醫大學動物中心。本實驗中對所有動物的實驗處理過程均符合動物實驗倫理要求。
DMEM/F12培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國）；兔抗大鼠Ⅱ型膠原抗體、小鼠抗兔單克隆熒光二抗（Abcam公司，美國）；兔抗大鼠波形蛋白（Vimentin）抗體（Santa公司，美國）；CD45、CD31、CD90、CD29流式分析抗體及同型對照，Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（BD公司，美國）；成骨及成脂分化培養基（Cyagen公司，美國）；0.4 μm孔徑Transwell小室（Millipore公司，美國）；IL-1β ELISA試劑盒（RD公司，美國）；SYBR Green Realtime PCR master Mix試劑盒（TOYOBO Biotech公司，日本）；Revert Aid一步法逆轉錄試劑盒（Fermentas公司，美國）；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）ELISA試劑盒（Novus Biologicals公司，美國）。流式細胞儀（BD公司，美國）；BX53熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Mx3000P PCR儀（Stratagene公司，美國）；Model 680酶標儀、MyiQTM儀器（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 細胞培養及鑒定
1.2.1 BMSCs
取3周齡SD大鼠6只以CO2窒息處死后，置于75%乙醇中消毒10 min；無菌條件下取雙側股骨和脛骨，仔細剝離干凈后剪除兩端骨骺，用5 mL注射器吸取DMEM/F12培養液沖洗骨髓腔至骨髓腔變白；將骨髓腔沖洗液以半徑15 cm、1 000 r/min離心5 min后，用完全培養基[含10%FBS、1%三抗（青-鏈-慶大霉素）的DMEM/F12培養基]重懸。收集細胞懸液，以1×105個/ mL濃度、15 mL/瓶接種于T75培養瓶中，于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養；24 h后換液，之后每3天換液；6～7 d傳代，首次傳代無需擴增，仍傳于T75培養瓶內，后每3～4天傳代，擴增比例為1∶2。實驗使用第4～5代細胞，使用前行CD45、CD31、CD90、CD29流式細胞儀檢測；并行成骨、成脂誘導分化鑒定以及Vimentin免疫熒光染色鑒定。
1.2.2 軟骨細胞
取成年SD大鼠2只以CO2窒息處死后，置于75%乙醇中消毒10 min；無菌條件下取膝關節及髖關節軟骨置于無血清DMEM/F12培養基中，顯微鏡下將附著韌帶、結締組織膜去除干凈。加入3%Ⅱ型膠原酶，使用顯微剪剪碎至1 mm大小，37℃孵育45 min后加入5倍體積無血清DMEM/F12培養基，37℃孵育12 h。消化結束后，加入完全培養基同上法離心5 min；棄上清，使用完全培養基重懸后，200目網篩過濾，以1×104個/mL濃度、15 mL/ 瓶接種于T75培養瓶內。之后每3天換液，6～7 d傳代。實驗使用第4～5代細胞，使用前行Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定。
1.3 動物體內損傷現象研究
1.3.1 實驗分組
取成年SD大鼠6只隨機分為2 組，每組3只。采用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，無菌條件下，手術打開膝關節囊，暴露膝關節軟骨。實驗組用顯微剪于膝關節軟骨股骨面制造一2 mm×2 mm的缺損，深度約1 mm；對照組為假手術組，暴露膝關節軟骨后不作損傷處理。6 h后取實驗組缺損處附近軟骨及對照組相應位置軟骨進行以下檢測。
1.3.2 實時定量PCR（quantitative
real-time PCR，qRT-PCR）檢測 使用Trizol提取軟骨細胞和組織內RNA后，用Revert Aid一步法逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。根據目的基因在GeneBank中的已知序列，采用Primer5.0設計引物，引物序列見表 1。純度測定合格后，使用MyiQTM儀器，以SYBR Green Realtime PCR master Mix試劑盒完成qRT-PCR測定，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt方法計算IL-1β mRNA相對表達量，分別獨立重復3次，取均 值。
表1
qRT-PCR檢測中各基因引物序列
Table1.
Primer sequence for qRT-PCR
1.3.3 ELISA法檢測
取相應部位軟骨進行組織勻漿，4℃以半徑10 cm、2 500 r/min離心10 min后，取上清液100 μL/孔加入酶標板，37℃孵育90 min；加入100 μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，洗滌3次；加入100 μL酶結合物工作液，37℃孵育30 min，洗滌5次；加入90 μL底物溶液，37℃孵育15 min，加入50 μL終止液，置于酶標儀450 nm波長處測量吸光度（A）值，計算IL-1β的相對含量。
1.4 BMSCs修復功能實驗
1.4.1 實驗分組
將軟骨細胞以1×105個/孔密度接種于6孔板內，BMSCs以相同密度接種于Transwell小室內備用。隨機選取18孔軟骨細胞，使用含20 ng/mL IL-1β的無血清DMEM/F12培養基干預其中12個孔（分為損傷組和共同培養組，每組6孔），空白組6孔僅使用無血清DMEM/F12培養基培養。24 h后所有細胞均使用PBS洗滌并更換為完全培養基，共同培養組6孔置入含BMSCs的Transwell小室，余兩組僅更換完全培養基，每孔內培養基含量為5 mL以確保上層細胞完全浸入。24 h后取各組細胞進行以下檢測。
1.4.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率
3組隨機各取3孔經AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒染色后使用流式細胞儀分析。分別將孔內上清液中懸浮細胞和經胰蛋白酶消化下來的貼壁細胞一同收集至離心管中，使用試劑盒內自帶結合緩沖液洗滌3次后，調整細胞密度為1×106個/mL，取100 μL細胞懸液，分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 和5 μL碘化啶，染色15 min后，使用結合緩沖液稀釋至500 μL后上流式細胞儀檢測。使用同種細胞單染調電壓和分群，所有樣本在染色1 h內完成檢測；以雙陽性和FITC陽性細胞占選定范圍內細胞比例為細胞凋亡 率。
1.4.3 qRT-PCR檢測
取3組其余各孔細胞，同1.3.2方法采用qRT-PCR法測定Caspase-3和含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶4（a disintegrin and metalloprotease with Thrombospondin motifs 4，ADAMTS-4）、ADAMTS-5 mRNA相對表達量。各引物序列見表 1。
1.4.4 ELISA法檢測
同1.3.3方法采用ELISA法檢測各組Caspase-3的相對含量。
1.5 BMSCs保護功能實驗
將軟骨細胞以1×105個/孔密度接種于6孔板內，BMSCs以相同密度接種于Transwell小室內備用。隨機選擇12孔軟骨細胞，分為兩組，共同培養組6 孔置入含BMSCs的Transwell小室，對照組不置入Transwell小室。兩組同時使用含20 ng/mL IL-1β的無血清DMEM/F12培養基干預，每孔內培養基含量為5 mL以確保上層細胞完全浸入。24 h后，同1.4.2方法采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，同1.3.2方法采用qRT-PCR檢測Caspase-3、ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA相對表達量，并采用Caspase-3試劑盒直接測定各樣本中Caspase-3的相對含量。
1.6 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs及軟骨細胞鑒定
BMSCs流式細胞儀分析結果示，CD29、CD90表達陽性，CD31、CD45表達陰性（圖 1）。BMSCs經成骨和成脂誘導培養2周后，可見明顯的鈣結節及脂滴，具有成骨、成脂分化潛能（圖 2）。免疫熒光染色示，鏡下幾乎所有BMSCs的Vimentin表達均陽性（圖 3 a）；軟骨細胞形態均一，且Ⅱ型膠原呈強陽性表達（圖 3 b）。
圖1
BMSCs流式細胞儀檢測 ? CD29 ? CD90 ? CD31 ? CD45 ? ?2.2 動物體內損傷現象研究
對照組和實驗組IL-1β mRNA相對表達量分別為1.024±0.109和3.083±0.130，ELISA法檢測IL-1β含量分別為1.027±0.106和2.613±0.159，比較差異均有統計學意義（t=12.20，P=0.000；t=8.254，P=0.001）。
2.3 BMSCs修復功能實驗結果
各檢測結果示，損傷組和共同培養組Caspase-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5 mRNA相對表達量及Caspase-3含量、細胞凋亡率均顯著高于空白組，損傷組顯著高于共同培養組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2、圖 4。
表2
BMSCs修復功能實驗qRT-PCR、ELISA法和細胞凋亡檢測結果（n=6，2.4 BMSCs保護功能實驗結果
共同培養組Caspase-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5 mRNA相對表達量及Caspase-3含量、細胞凋亡率均顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3、圖 5。
表3
BMSCs保護功能實驗qRT-PCR、ELISA法和細胞凋亡檢測結果（n=6，3 討論
目前研究證實，BMSCs可通過分泌細胞因子調節區域微環境，促進細胞增殖[6]，并起到抗炎癥、抗凋亡的作用[7-8]。因此，在組織工程領域，如何將這一常用種子細胞的潛在功能更好地發揮出來，對移植后微環境的改善和維持具有重要意義。在既往研究中，研究者主要使用在體實驗研究BMSCs的優勢，但存在的主要問題是體內環境的復雜性大大增加了對類似BMSCs的種子細胞潛在功能的研究難度，降低了其研究的精確性。
IL-1β作為經典的炎性誘導因子，具有誘導COX2、基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）、MMP-3、MMP-13以及IL-6 mRNA表達的作用[9]，且作為穩定的干預因素被用于諸多細胞實驗[5]。多聚蛋白聚糖主要存在于軟骨，其以特殊的形式與透明質酸相互作用，形成高分子聚合物以耐受壓縮力及水分滲入，從而使得軟骨組織具有承受負荷的獨特能力。目前研究表明多聚蛋白聚糖酶在多聚蛋白聚糖降解中起著重要作用[10]。ADAMTS-4、ADAMTS-5多聚蛋白聚糖酶可在炎癥或其他刺激下表達增多，水解多聚蛋白聚糖造成關節軟骨退變[11]。在一定程度上，其表達量的高低同局部軟骨退變程度密切相關。Caspase-3在凋亡通路中處于最終的核心位置[12]，是重要的凋亡評價指標。
因此，本實驗應用0.4 μm孔徑Transwell小室建立體外細胞間接作用模型，可將兩種細胞有效隔離，在模擬體內細胞旁分泌作用過程的同時，保證BMSCs不能通過變形運動實現遷移，從而直接而單純地研究下層細胞變化。使用IL-1β相對含量對動物體內損傷進行評估，是在復雜的損傷反應表達中相對恰當的指標；而在細胞實驗中則排除與干預因素相同的IL-1β及其平行因子，選用由炎癥激活且在軟骨退變中具有重要意義的ADAMTS-4、ADAMTS-5作為炎癥評價指標[13-14]。本實驗首次體外多層面明確表明了BMSCs可通過旁分泌途徑促進損傷后軟骨細胞修復，并且能提高軟骨細胞對IL-1β的抵抗作用。本實驗以IL-1β為線索，自大體評估到體外干預，相對完整地論證了BMSCs作為種子細胞時，其旁分泌功能可能具有的抗炎癥、抗凋亡能力，在組織工程臨床應用中具有重要意義。
有關研究表明，炎性培養基中的BMSCs可降低NF-κB的活性，從而控制一系列炎性反應[15]。在由脂多糖誘導的急性肺損傷中模型中，BMSCs可大量分泌具有較強抗炎能力的TNF誘導基因6蛋白[16]。而在脂多糖或燒傷誘導的動物損傷模型中，MSCs可通過增加另一種抗炎因子IL-10的分泌，上調蛋白激酶B、絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶1和Rik1相關因子1的基因表達，來降低器官損傷[17]。另外，MSCs還可通過旁分泌IGF-1激活基質細胞衍生因子1α信號通路，以動員BMSCs促進缺血的心肌修復[18]。同時，BMSCs分泌的TGF-β和前列腺素E2可通過抑制淋巴細胞來降低炎性反應[19-20]。BMSCs旁分泌的抗凋亡作用則可能是通過其產生的具有抑制氧化應激作用的生長因子實現，這些生長因子可能可促進抗氧化物活性以及調節過度活化的線粒體。體內外實驗均證實，MSCs及其上清液可顯著提高治療組Akt水平，進而可通過磷酸化途徑降低促凋亡基因BAD凋亡通路的活性，實現抗凋亡效果[21-23]。
本研究結果顯示炎癥刺激后軟骨細胞ADAMTS-4、ADAMTS-5的基因表達顯著增高，與BMSCs共同培養后，其表達量顯著降低。因此可認為，在控制軟骨退變中，BMSCs旁分泌功能也起到積極作用。作為組織工程復合體，移植過程不僅造成了直接的破壞和炎癥損傷，也由于局部微環境和力學改變可引起近期和遠期的軟骨退變。而種子細胞旁分泌功能在抗炎癥、抗凋亡作用外，在減緩軟骨退行性病變中也具有相當的潛力。
綜上述，在組織工程復合材料向大體內移植的過程中，醫源性損傷所導致的炎性反應難以避免，作為種子細胞的BMSCs可通過旁分泌實現對損傷細胞的治療作用，并可增強未損傷細胞對IL-1β所造成炎性反應的抵抗能力。進一步發掘種子細胞潛在的抗炎癥和抗凋亡能力，在組織工程在體應用中具有重要意義。
