引用本文： 張承昊, 李棋, 唐新, 李箭. 促進腱-骨愈合方法的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(7): 912-916. doi: 10.7507/1002-1892.20150195 復制
腱-骨愈合是決定韌帶重建成功與否的重要因素，無論是膝關節交叉韌帶、側副韌帶、后外側復合體重建、肩關節肩袖修復或踝關節韌帶重建等，腱-骨愈合程度均直接影響術后康復進程及手術效果。研究表明，除手術失誤外，未能達到牢固的腱-骨愈合是韌帶重建手術失敗的主要原因[1-2]。近年，有關提高腱-骨愈合的研究主要關注于促進肌腱位點的韌帶-骨整合方面，包括采用骨膜、生物凝膠、支架、生長因子、干細胞，或其他可促進骨生長或韌帶附著點[3]的重建材料。現回顧分析腱-骨愈合過程及促進腱-骨愈合方法的相關研究進展并進行綜述。
1 腱-骨愈合過程
正常腱-骨連接位點分為非直接止點及直接止點兩類。非直接止點指由較厚的纖維組織直接將肌腱或韌帶連接固定至骨膜上，如內側副韌帶脛骨止點。直接止點指通過典型纖維軟骨組織將軟組織“錨定”于骨深層，其直接嵌入點為一個4層組織的轉化區域，包括骨、鈣化軟骨、非鈣化軟骨、韌帶組織，如前交叉韌帶和肩袖[4]。
目前，肌腱或韌帶重建手術技術及固定方式等的相關研究旨在達到重建術中肌腱與骨獲得最大接觸面積，保證接觸面間穩定、緊密，使外力影響最小化。當肌腱與骨接觸后通過直接或間接腱-骨愈合，形成正常腱-骨界面，建立穩固連接，使重建韌帶發揮作用。直接腱-骨愈合是指具有4層結構特點的腱-骨連接，這種結構存在于愈合后肌腱與隧道口間。間接腱-骨愈合是指肌腱和骨之間通過Sharpey樣纖維連接，該類愈合時間長，愈合后腱-骨之間抗拉力能力較直接愈合低[5]。
動物實驗表明[6]，肌腱植入骨隧道后需經歷壞死期、增殖期和韌帶化期，才能達到真正愈合。壞死期也稱為愈合早期，一般指移植物植入后前4周，該過程中移植物出現壞死，其力學強度顯著低于植入時；增殖期指術后第4～12周，移植物出現重塑、再血管化，細胞活性強；韌帶化期是指增殖期后至移植物重塑結束，可長達半年至數年。Tabuchi等[7]對植入兔骨隧道的肌腱進行了26周觀察，結果顯示從術后12周開始含有Ⅲ型膠原纖維的Sharpey樣纖維逐漸被Ⅰ型膠原替代，直至第26周時移植物內的纖維與Sharpey樣纖維形成連接。在另一個犬實驗研究中，重建的前交叉韌帶在重建后6個月時腱-骨之間形成的連接比3個月時更規律，并可見“潮線”； 12個月時可見分界清楚的4層結構[8]。
2 促進腱-骨愈合方法
2.1 骨膜
目前，促進腱-骨愈合方法中已用于臨床并取得較好效果的是骨膜移植[9-11]。骨膜分為生發層和纖維層，其活性主要來自生發層。生發層內含有豐富的細胞和血管，其中包含多向分化的MSCs。MSCs可向軟骨細胞、骨細胞分化，促進骨整合過程。而豐富的血管組織可在移植后促進新血管生長，從而促進腱-骨之間纖維軟骨形成。纖維層較厚、細胞含量較少，在促進腱-骨愈合過程中作用較弱，主要參與骨膜的支撐和連接作用[12-13]。
由于骨膜具有很強的成骨能力，因此學者們應用骨膜來促進重建肌腱的腱-骨愈合[14]。相關動物實驗結果顯示[15-17]，采用骨膜包裹肌腱的方法可促進腱-骨愈合；將該方法臨床應用于前交叉韌帶重建中，也取得了滿意療效。此外，骨膜具有很強的骨整合能力，主要因為骨膜含有較多的祖細胞且細胞活性高，因此骨膜包裹可加強腱-骨之間連接，促進骨內細胞長入肌腱內，這是腱-骨愈合的重要過程。同時骨膜還起到細胞支架作用，并通過分泌生長因子，如骨膜蛋白[18]，加強肌腱和骨之間黏附過程。骨膜還可合成生長因子，如BMP-2、TGF-β1、IGF-1 等[19-20]，誘導軟骨生成，促進血管生長和骨再吸收。
除以上特點外，骨膜還具有取材容易、不易出現炎性反應和排斥反應的優勢，是目前用于臨床促進腱-骨愈合的最佳方法之一。但是骨膜也存在取材量有限、損傷供區以及骨膜兩面活性和結構存在較大差異等缺點，限制了其進一步臨床應用。
2.2 材料
由于骨膜的局限性及組織工程和材料工程的發展，促進腱-骨愈合的材料也不斷出現。目前材料可分為3類：骨引導材料、可降解支架及其他促進腱-骨愈合的材料。
2.2.1 骨引導材料
骨引導材料中以磷酸鈣或磷酸鎂類為主[21]。Zhao等[22]分別使用磷酸鈣黏合材料及羥基磷灰石促進肩袖損傷愈合，比較發現兩種材料均可促進細胞黏附、增殖以及新骨生成，但磷酸鈣黏合材料作用更明顯。磷酸鈣除能直接促進腱-骨愈合，還可促進生長因子分泌，間接促進腱-骨愈合。Weimin等[23]使用復合BMP的注射型磷酸鈣黏合材料促進兔重建前交叉韌帶愈合，結果顯示與未復合BMP的磷酸鈣黏合材料相比，其具有更好的骨整合和重建韌帶抗拉力效果。有研究報道，以鎂為主要成分的骨黏合劑也具有良好的促進骨長入肌腱表面的作用[24]。以磷酸鈣或磷酸鎂類為主的促進腱-骨愈合材料具有易獲得、價格便宜等特點，但還需進一步研究提高其生物適應性，并進行臨床試驗觀察效果。
2.2.2 可降解支架
生物相容性支架或可降解多孔支架是通過在腱-骨之間建立一個適合細胞增殖和分化的環境來促進腱骨細胞附著和長入，如纖維蛋白膠、聚乙醇酸等材料。Wu等[25]研究表明，采用纖維蛋白膠三維培養可促進細胞增殖和分化。Yokoya等[26]研究發現在兔肩袖損傷模型中，使用聚乙醇酸薄片可使肌腱在類似纖維軟骨層界面愈合。這類支架在重建的移植物和骨之間建立一個橋梁，促進細胞遷移和增殖，從而在腱-骨愈合處形成一高細胞活性區域，最終達到促進腱-骨愈合的目的。
2.2.3 其他可促進腱-骨愈合的材料
在腱-骨愈合過程中Sharpey纖維起到重要作用，有學者擬通過合成材料模擬該纖維的作用來促進腱-骨愈合。Lovric 等[27]將去礦物質骨基質（demineralized bone matrix，DBM）置于腱-骨界面，將其作為一潛在的釋放誘導成骨蛋白的載體促進腱-骨愈合。Kadonishi等[28]將已用于治療牙周缺損的釉基質衍生物（enamel matrix derivative，EMD）來促進重建的前交叉韌帶腱-骨表面愈合，組織學觀察發現術后8周時EMD組愈合優于空白組，但12周時兩組之間無明顯差異； EMD組在8周時最大負載力也明顯高于空白組，但12周時該差異顯著縮小。因此，此類合成材料能否有效促進腱-骨愈合以及相關遠期效果，有待進一步研究明確。
2.3 生長因子及細胞基質
促進腱-骨愈合方法中研究最集中、最深入的是誘導成骨類生長因子，主要包括TGF、BMP、FGF、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、IGF。這些生長因子在促進腱-骨愈合及肌腱修復過程中起到積極作用，并能減少組織的無結構化[29-32]。
Buchmann等[31]在大鼠肩袖修補模型中單獨及聯合應用了G-CSF、bFGF兩種生長因子，結果顯示單獨應用兩種生長因子可促進腱-骨愈合進程，特別是移植物的再血管化；聯合應用兩種生長因子可同時促進Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成。Kim等[33]將BMP-2用于重建的兔肩袖腱-骨結合處，組織學觀察顯示，與未應用生長因子組比較，應用BMP-2后髕骨和髕腱錨釘縫合位點有更多新骨形成，在腱-骨愈合過程中骨纖維軟骨組織整合程度也更明顯，腱-骨之間斷裂的最大負載力也顯著提高。Kovacevic等[34]研究發現TGF-β3結合磷酸鈣可促進大鼠腱-骨愈合，術后4周重建肩袖抗拉力與空白組或單獨使用磷酸鈣組比較明顯提高，同時重建部位Ⅰ、Ⅲ型膠原比例更合適。但以上研究均為動物實驗，目前尚缺少生長因子用于臨床韌帶與肌腱修復的研究報道。此外，生長因子的應用技術也有待研究明確，包括生長因子載體、釋放速度以及應用環境。
因此，學者們選擇含細胞基質的材料進行研究，希望通過細胞基質中的生長因子及細胞因子來促進腱-骨愈合進程，如DBM等。Hsu 等[35]將DBM用于兔重建前交叉韌帶模型，術后X線片檢查示DBM組脛骨隧道內肌腱與空白組相比更小，提示術后隧道擴大程度較輕，為腱-骨愈合提供了更緊密的接觸；免疫組織化學染色觀察示DBM組分泌更多的BMP-2和VEGF，促進重建前交叉韌帶腱-骨愈合。
2.4 富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）
PRP是從自體全血中衍生出的超過生理劑量濃度的血小板，具有促進骨骼、肌腱等組織修復的潛力，它通過提供富含生長因子及其他細胞因子的局部環境來促進組織重建或再生。體外和動物研究發現，PRP可通過提供高濃度的生長因子及細胞因子促進多種細胞遷移和增殖[36-37]。目前，PRP已廣泛用于臨床各種組織的修復，如骨、軟骨、肌腱、肌肉，特別是創傷后的局部環境中，如淺表創面，肌肉、肌腱損傷及骨軟骨缺損等[38-40]。
雖然體外及動物研究已證實PRP可促進腱-骨愈合，如PRP可促進犬重建前交叉韌帶移植物與骨之間的早期腱-骨愈合，加強連接強度并促進纖維交聯成形，提高修復組織代謝活性[41]。但臨床研究結果卻不甚理想，Zhao等[42]對8篇肩袖修補手術使用PRP的臨床隨機對照試驗文獻進行了Meta分析，結果顯示使用PRP對修復肩袖的再損傷率及療效無明顯影響。隨后，Malavolta等[43]也進行了臨床對照研究，比較PRP對肩袖修補手術療效的影響，結果顯示，除12個月時PRP組美國加州大學洛杉磯分校（UCLA）評分略高于未使用PRP組外，兩組其他臨床結果，包括Constant評分、疼痛評分、術后MRI等檢查及術后再損傷率比較，均無顯著差異。
雖然上述文獻顯示目前臨床應用PRP對腱-骨愈合及肌腱修復促進作用尚不理想，但有研究者提出這可能與PRP應用條件、手術方式及相關適應證的選擇尚未達最佳有關。Seijas等[44]將PRP注射于重建的前交叉韌帶隧道中，MRI檢查顯示其可加快髕腱移植物的重建。Rha等[45]比較了干針針灸或PRP局部注射治療小于1 cm的肩袖損傷效果，經隨訪6周發現PRP組關節疼痛和功能受限程度顯著低于干針針灸組。Dallaudière等[46]觀察了408例在超聲引導下接受PRP注射治療的肌腱損傷或肌腱炎等肌腱病患者，結果發現所有患者疼痛均顯著緩解，關節功能評分均提高。
3 小結及展望
目前，促進腱-骨愈合主要通過兩種方式完成，其一為通過改變腱-骨之間局部環境，增加兩者之間連接，促進骨中細胞向移植物遷移，為腱-骨愈合提供活性較高的微環境；其二為通過加入具有較高骨整合活性的組織，如骨膜等，來促進腱-骨愈合。目前除骨膜已應用于臨床且療效明確外，其余方法尚無明確結論，有待進一步深入研究。
腱-骨愈合是決定韌帶重建成功與否的重要因素，無論是膝關節交叉韌帶、側副韌帶、后外側復合體重建、肩關節肩袖修復或踝關節韌帶重建等，腱-骨愈合程度均直接影響術后康復進程及手術效果。研究表明，除手術失誤外，未能達到牢固的腱-骨愈合是韌帶重建手術失敗的主要原因[1-2]。近年，有關提高腱-骨愈合的研究主要關注于促進肌腱位點的韌帶-骨整合方面，包括采用骨膜、生物凝膠、支架、生長因子、干細胞，或其他可促進骨生長或韌帶附著點[3]的重建材料。現回顧分析腱-骨愈合過程及促進腱-骨愈合方法的相關研究進展并進行綜述。
1 腱-骨愈合過程
正常腱-骨連接位點分為非直接止點及直接止點兩類。非直接止點指由較厚的纖維組織直接將肌腱或韌帶連接固定至骨膜上，如內側副韌帶脛骨止點。直接止點指通過典型纖維軟骨組織將軟組織“錨定”于骨深層，其直接嵌入點為一個4層組織的轉化區域，包括骨、鈣化軟骨、非鈣化軟骨、韌帶組織，如前交叉韌帶和肩袖[4]。
目前，肌腱或韌帶重建手術技術及固定方式等的相關研究旨在達到重建術中肌腱與骨獲得最大接觸面積，保證接觸面間穩定、緊密，使外力影響最小化。當肌腱與骨接觸后通過直接或間接腱-骨愈合，形成正常腱-骨界面，建立穩固連接，使重建韌帶發揮作用。直接腱-骨愈合是指具有4層結構特點的腱-骨連接，這種結構存在于愈合后肌腱與隧道口間。間接腱-骨愈合是指肌腱和骨之間通過Sharpey樣纖維連接，該類愈合時間長，愈合后腱-骨之間抗拉力能力較直接愈合低[5]。
動物實驗表明[6]，肌腱植入骨隧道后需經歷壞死期、增殖期和韌帶化期，才能達到真正愈合。壞死期也稱為愈合早期，一般指移植物植入后前4周，該過程中移植物出現壞死，其力學強度顯著低于植入時；增殖期指術后第4～12周，移植物出現重塑、再血管化，細胞活性強；韌帶化期是指增殖期后至移植物重塑結束，可長達半年至數年。Tabuchi等[7]對植入兔骨隧道的肌腱進行了26周觀察，結果顯示從術后12周開始含有Ⅲ型膠原纖維的Sharpey樣纖維逐漸被Ⅰ型膠原替代，直至第26周時移植物內的纖維與Sharpey樣纖維形成連接。在另一個犬實驗研究中，重建的前交叉韌帶在重建后6個月時腱-骨之間形成的連接比3個月時更規律，并可見“潮線”； 12個月時可見分界清楚的4層結構[8]。
2 促進腱-骨愈合方法
2.1 骨膜
目前，促進腱-骨愈合方法中已用于臨床并取得較好效果的是骨膜移植[9-11]。骨膜分為生發層和纖維層，其活性主要來自生發層。生發層內含有豐富的細胞和血管，其中包含多向分化的MSCs。MSCs可向軟骨細胞、骨細胞分化，促進骨整合過程。而豐富的血管組織可在移植后促進新血管生長，從而促進腱-骨之間纖維軟骨形成。纖維層較厚、細胞含量較少，在促進腱-骨愈合過程中作用較弱，主要參與骨膜的支撐和連接作用[12-13]。
由于骨膜具有很強的成骨能力，因此學者們應用骨膜來促進重建肌腱的腱-骨愈合[14]。相關動物實驗結果顯示[15-17]，采用骨膜包裹肌腱的方法可促進腱-骨愈合；將該方法臨床應用于前交叉韌帶重建中，也取得了滿意療效。此外，骨膜具有很強的骨整合能力，主要因為骨膜含有較多的祖細胞且細胞活性高，因此骨膜包裹可加強腱-骨之間連接，促進骨內細胞長入肌腱內，這是腱-骨愈合的重要過程。同時骨膜還起到細胞支架作用，并通過分泌生長因子，如骨膜蛋白[18]，加強肌腱和骨之間黏附過程。骨膜還可合成生長因子，如BMP-2、TGF-β1、IGF-1 等[19-20]，誘導軟骨生成，促進血管生長和骨再吸收。
除以上特點外，骨膜還具有取材容易、不易出現炎性反應和排斥反應的優勢，是目前用于臨床促進腱-骨愈合的最佳方法之一。但是骨膜也存在取材量有限、損傷供區以及骨膜兩面活性和結構存在較大差異等缺點，限制了其進一步臨床應用。
2.2 材料
由于骨膜的局限性及組織工程和材料工程的發展，促進腱-骨愈合的材料也不斷出現。目前材料可分為3類：骨引導材料、可降解支架及其他促進腱-骨愈合的材料。
2.2.1 骨引導材料
骨引導材料中以磷酸鈣或磷酸鎂類為主[21]。Zhao等[22]分別使用磷酸鈣黏合材料及羥基磷灰石促進肩袖損傷愈合，比較發現兩種材料均可促進細胞黏附、增殖以及新骨生成，但磷酸鈣黏合材料作用更明顯。磷酸鈣除能直接促進腱-骨愈合，還可促進生長因子分泌，間接促進腱-骨愈合。Weimin等[23]使用復合BMP的注射型磷酸鈣黏合材料促進兔重建前交叉韌帶愈合，結果顯示與未復合BMP的磷酸鈣黏合材料相比，其具有更好的骨整合和重建韌帶抗拉力效果。有研究報道，以鎂為主要成分的骨黏合劑也具有良好的促進骨長入肌腱表面的作用[24]。以磷酸鈣或磷酸鎂類為主的促進腱-骨愈合材料具有易獲得、價格便宜等特點，但還需進一步研究提高其生物適應性，并進行臨床試驗觀察效果。
2.2.2 可降解支架
生物相容性支架或可降解多孔支架是通過在腱-骨之間建立一個適合細胞增殖和分化的環境來促進腱骨細胞附著和長入，如纖維蛋白膠、聚乙醇酸等材料。Wu等[25]研究表明，采用纖維蛋白膠三維培養可促進細胞增殖和分化。Yokoya等[26]研究發現在兔肩袖損傷模型中，使用聚乙醇酸薄片可使肌腱在類似纖維軟骨層界面愈合。這類支架在重建的移植物和骨之間建立一個橋梁，促進細胞遷移和增殖，從而在腱-骨愈合處形成一高細胞活性區域，最終達到促進腱-骨愈合的目的。
2.2.3 其他可促進腱-骨愈合的材料
在腱-骨愈合過程中Sharpey纖維起到重要作用，有學者擬通過合成材料模擬該纖維的作用來促進腱-骨愈合。Lovric 等[27]將去礦物質骨基質（demineralized bone matrix，DBM）置于腱-骨界面，將其作為一潛在的釋放誘導成骨蛋白的載體促進腱-骨愈合。Kadonishi等[28]將已用于治療牙周缺損的釉基質衍生物（enamel matrix derivative，EMD）來促進重建的前交叉韌帶腱-骨表面愈合，組織學觀察發現術后8周時EMD組愈合優于空白組，但12周時兩組之間無明顯差異； EMD組在8周時最大負載力也明顯高于空白組，但12周時該差異顯著縮小。因此，此類合成材料能否有效促進腱-骨愈合以及相關遠期效果，有待進一步研究明確。
2.3 生長因子及細胞基質
促進腱-骨愈合方法中研究最集中、最深入的是誘導成骨類生長因子，主要包括TGF、BMP、FGF、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、IGF。這些生長因子在促進腱-骨愈合及肌腱修復過程中起到積極作用，并能減少組織的無結構化[29-32]。
Buchmann等[31]在大鼠肩袖修補模型中單獨及聯合應用了G-CSF、bFGF兩種生長因子，結果顯示單獨應用兩種生長因子可促進腱-骨愈合進程，特別是移植物的再血管化；聯合應用兩種生長因子可同時促進Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成。Kim等[33]將BMP-2用于重建的兔肩袖腱-骨結合處，組織學觀察顯示，與未應用生長因子組比較，應用BMP-2后髕骨和髕腱錨釘縫合位點有更多新骨形成，在腱-骨愈合過程中骨纖維軟骨組織整合程度也更明顯，腱-骨之間斷裂的最大負載力也顯著提高。Kovacevic等[34]研究發現TGF-β3結合磷酸鈣可促進大鼠腱-骨愈合，術后4周重建肩袖抗拉力與空白組或單獨使用磷酸鈣組比較明顯提高，同時重建部位Ⅰ、Ⅲ型膠原比例更合適。但以上研究均為動物實驗，目前尚缺少生長因子用于臨床韌帶與肌腱修復的研究報道。此外，生長因子的應用技術也有待研究明確，包括生長因子載體、釋放速度以及應用環境。
因此，學者們選擇含細胞基質的材料進行研究，希望通過細胞基質中的生長因子及細胞因子來促進腱-骨愈合進程，如DBM等。Hsu 等[35]將DBM用于兔重建前交叉韌帶模型，術后X線片檢查示DBM組脛骨隧道內肌腱與空白組相比更小，提示術后隧道擴大程度較輕，為腱-骨愈合提供了更緊密的接觸；免疫組織化學染色觀察示DBM組分泌更多的BMP-2和VEGF，促進重建前交叉韌帶腱-骨愈合。
2.4 富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）
PRP是從自體全血中衍生出的超過生理劑量濃度的血小板，具有促進骨骼、肌腱等組織修復的潛力，它通過提供富含生長因子及其他細胞因子的局部環境來促進組織重建或再生。體外和動物研究發現，PRP可通過提供高濃度的生長因子及細胞因子促進多種細胞遷移和增殖[36-37]。目前，PRP已廣泛用于臨床各種組織的修復，如骨、軟骨、肌腱、肌肉，特別是創傷后的局部環境中，如淺表創面，肌肉、肌腱損傷及骨軟骨缺損等[38-40]。
雖然體外及動物研究已證實PRP可促進腱-骨愈合，如PRP可促進犬重建前交叉韌帶移植物與骨之間的早期腱-骨愈合，加強連接強度并促進纖維交聯成形，提高修復組織代謝活性[41]。但臨床研究結果卻不甚理想，Zhao等[42]對8篇肩袖修補手術使用PRP的臨床隨機對照試驗文獻進行了Meta分析，結果顯示使用PRP對修復肩袖的再損傷率及療效無明顯影響。隨后，Malavolta等[43]也進行了臨床對照研究，比較PRP對肩袖修補手術療效的影響，結果顯示，除12個月時PRP組美國加州大學洛杉磯分校（UCLA）評分略高于未使用PRP組外，兩組其他臨床結果，包括Constant評分、疼痛評分、術后MRI等檢查及術后再損傷率比較，均無顯著差異。
雖然上述文獻顯示目前臨床應用PRP對腱-骨愈合及肌腱修復促進作用尚不理想，但有研究者提出這可能與PRP應用條件、手術方式及相關適應證的選擇尚未達最佳有關。Seijas等[44]將PRP注射于重建的前交叉韌帶隧道中，MRI檢查顯示其可加快髕腱移植物的重建。Rha等[45]比較了干針針灸或PRP局部注射治療小于1 cm的肩袖損傷效果，經隨訪6周發現PRP組關節疼痛和功能受限程度顯著低于干針針灸組。Dallaudière等[46]觀察了408例在超聲引導下接受PRP注射治療的肌腱損傷或肌腱炎等肌腱病患者，結果發現所有患者疼痛均顯著緩解，關節功能評分均提高。
3 小結及展望
目前，促進腱-骨愈合主要通過兩種方式完成，其一為通過改變腱-骨之間局部環境，增加兩者之間連接，促進骨中細胞向移植物遷移，為腱-骨愈合提供活性較高的微環境；其二為通過加入具有較高骨整合活性的組織，如骨膜等，來促進腱-骨愈合。目前除骨膜已應用于臨床且療效明確外，其余方法尚無明確結論，有待進一步深入研究。