引用本文： 朱厚毅, 王鋒, 王運濤. MSCs衰老的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(7): 899-904. doi: 10.7507/1002-1892.20150193 復制
在人的整個生命周期中，不同的人體組織細胞壽命有所不同，但都會衰老死亡被新的細胞取代，這些新細胞由各種干細胞分化而來。干細胞在保持機體穩態和組織器官的動態平衡、修復、再生等方面有著舉足輕重的作用。在各種成人干細胞中，MSCs的臨床應用比較廣泛。MSCs可從多種結締組織中分離出來，包括骨髓、脂肪組織、牙髓、羊水、臍帶膠質和臍帶血等。MSCs應用于細胞療法有許多優點，包括多向分化潛力、歸巢、免疫調節功能和傷口愈合效果突出等[1]，近年來廣泛用于組織工程研究。理論上，MSCs可無限增殖、生長，但它們并不是永生的。有報道培養7～12代或更多代數后人MSCs會出現衰老[1-3]。隨著MSCs的老化，其數量和功能出現與年齡相關的下降，由此引起細胞干性、組織動態平衡、再生和修復功能的損失[4]，但衰老相關因素和具體機制尚不十分清楚。MSCs衰老是一極其復雜的過程，影響大多數有機體的生物學功能，破壞組織器官的穩態性，降低機體對損傷或應激的反應能力，并最終導致疾病和死亡。對于MSCs衰老的機制有諸多學說，包括氧化反應損傷、端粒的磨損短縮、DNA損傷和逐漸下降的DNA修復能力，以及表觀遺傳學的改變等。現對近年來關于MSCs衰老機制的研究進展進行綜述，為提高MSCs后期實驗及臨床應用的有效性提供思路。
1 MSCs特性及衰老的特征
MSCs具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控等特點。在適宜的體內或體外環境下可分化為造血細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、肝細胞等多種細胞；也可通過細胞與細胞之間的直接接觸，分泌可溶性因子來調節T細胞和B細胞功能，包括細胞的活化、增殖和趨化作用等。將MSCs用于治療前，其體外分離增殖至關重要。MSCs在體外培養有很強的增殖能力，但研究報道人和動物MSCs體外傳代培養后會出現衰老征象，并表現出相關特征[2-6]。MSCs的衰老涵蓋了逐漸喪失的增殖能力、分化潛能[7]，同樣包括其分泌多種細胞因子的能力，最終影響其功能的實現[8-9]。對MSCs衰老的研究也主要集中于形態學及干細胞相關功能改變。
1.1 形態學的改變
老化的MSCs在形態上的變化主要表現為細胞變得寬大扁平，足突增多[10]，多角形及星形細胞比例增加；細胞核增大，細胞質內出現細小顆粒或空泡，細胞核質比減少；細胞折光度差，黏附力增加；細胞群落變小，數量減少，增殖變慢[11]。
1.2 增殖潛能的改變
MSCs老化的標志之一是增殖分化能力的丟失[11]。有研究顯示[3]，來自不同捐贈者的MSCs，其同一代的培養倍增時間有明顯差異。該研究對8 名健康成年捐贈者的MSCs隨機編號，研究第9代細胞倍增時間，5號捐贈者為24 h，而1號捐贈者則達到了97.75 h；但來自同一捐贈者的細胞倍增時間會隨著代數增加而不斷延長，6號捐贈者在第6代的時間為24 h，第11代則達到了68 h。說明MSCs的增殖潛力存在個體差異，并會隨著傳代次數的增加而逐漸降低[3, 12-13]。
目前關于捐贈者年齡對MSCs影響的研究并不確切，但大多數研究結果傾向于年齡越大對MSCs負面影響越大[8-9, 14-15]。有報道對不同年齡組（＜30歲、35～50歲、＞60歲）脂肪來源MSCs細胞特性進行研究時發現，＞60歲組p16和p21的mRNA表達及衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associated-β-galactosidase，SA-β-gal）活性明顯升高，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降；細胞集落的數量、大小及生長趨勢均會隨捐贈者年齡增長而下降，倍增時間逐漸延長[14]。類似結果在動物實驗中也得到了驗證。有研究將來自4月齡及15月齡的大鼠MSCs進行對比，結果顯示后者端粒酶活性降低，DNA雙鏈斷裂標志泛素化組蛋白（γ-H2AX）活性明顯升高[8-9]；有研究對1、6、16月齡大鼠MSCs進行比較，結果顯示16月齡大鼠SA-β-gal陽性的MSCs數量增多，SA-β-gal活性明顯升高，通過流式細胞法檢測細胞周期發現S期的時相比例下降等，也印證了增殖能力會隨年齡增長而逐漸下降的結論[15]。然而，最近Hwang等[16]研究認為MSCs喪失增殖潛能的模型并不能被完全復制，他們在對＜20歲、20～39歲、40～59歲、＞60歲4組捐贈者MSCs的比較研究中，通過細胞計數盒檢測生長曲線并計算增殖率，結果發現捐贈者的年齡并未影響其增殖能力。也有研究對來自8個月～6歲組和38～58歲組兩組捐贈者的MSCs進行檢測，檢測指標包括脂褐素、遷移能力、端粒長度、誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、p16的表達產物和SOD活性，各項檢測結果顯示兩組間比較差異均無統計學意義；雖然從38～58歲組提取的MSCs在培養期間細胞量相對較少，并且倍增時間稍長，但與8個月～6歲組相比差異均無統計學意義，能達到較滿意的應用標準；而且該研究認為，用于細胞療法MSCs的捐獻者年齡最高可放寬到58歲[17]。對此爭議，目前一般認為體外培養環境較為單一，不足以反映機體內環境的復雜性；另外，實驗設計中對于年齡段的劃分尚無公認標準，導致各組之間年齡區分度不同，會影響研究的可信度；并且MSCs種屬來源、性別及來源組織均對結論的差異有影響。因此，充分考慮相關干擾因素有利于對此方面作深入研究。
1.3 分化潛能的改變
關于MSCs衰老對其本身分化潛能的影響有不同報道。Choudhery等[14]研究將＜30歲、35～50歲、 ＞60歲3個不同年齡組MSCs在體外分別誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經元樣細胞，細胞衰老檢測顯示p16、p21 mRNA水平及SA-β-gal活性隨年齡增長而上調，MSCs呈衰老表型。但其成脂特異性過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ）和脂蛋白脂肪酶（lipoproteinlipase，LPL）的mRNA水平、油紅O染色定量分析及陽性細胞計數比較，差異均無統計學意義；RT-PCR分析神經元樣細胞特定基因神經微絲蛋白和神經元特異性烯醇化酶的基因表達，也未發現與年齡分組相關的差異；而在成骨分化中對骨鈣蛋白和ALP基因的表達、鈣化基質的定性定量檢測及軟骨分化相關Ⅱ型膠原酶及蛋白多糖基因的表達水平檢測均發現，隨衰老水平上升出現明顯下降。有研究將12名捐贈者分為＜20歲、20～39歲、40～59歲及＞60歲不同年齡組，取各組MSCs進行體外培養，檢測發現各組間細胞增殖能力并無明顯差別；誘導成骨分化后檢測成骨分化特定標志BMP-2、Runx2、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原、骨鈣素、成骨細胞特異性轉錄因子和骨橋蛋白（osteoponin，OP）的mRNA表達水平，結果顯示，除了40～59歲及＞60歲組OP水平較＜20歲、20～39 歲組明顯降低外，其他基因表達差異無統計學意義[16]。Zhu等[18]的研究也認為成骨分化潛力與年齡有關，但成脂分化則無相關性。但Khan等[19]將志愿者分為兩組，一組年齡（57±3）歲，另一組（86±3）歲，取各組脂肪來源的MSCs培養，研究發現兩組細胞增殖能力及成骨分化能力無明顯不同。對此爭議，根據目前的實驗方法及條件，應充分考慮并避免個體差異、取材年齡段不同的劃分標準及取材標本數量給實驗造成的誤差，才能合理揭示MSCs衰老對分化潛能的影響。
目前研究認為，MSCs的衰老會導致成骨分化潛能降低[20]。成骨細胞的減少導致骨細胞被破壞后的損失無法彌補，最終骨形成減少和成骨疾病風險增加，如骨質疏松癥等[21-22]。有研究通過暴露于電離輻射導致DNA損傷誘導BMSCs衰老，發現其衰老后成骨分化潛能下降與p53表達上升相關[23]。Liu等[24]報道MSCs單獨敲除p53基因或敲除p53基因聯合端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）基因過度表達后，成脂分化特異性標記PPAR-γ、LPL表達和油紅O染色程度顯著增強；僅單獨上調TERT基因表達，成脂分化未見明顯差異；在成骨及成軟骨方面，上述3種情況的成骨標志OP和ALP、成軟骨標志Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的表達均較正常MSCs明顯上調。Molchadsky等[25]將MSCs的p53基因敲除或過表達其活性，行成骨、成脂、成軟骨分化誘導，最后結果也證明分化潛能的改變與p53相關的MSCs衰老緊密相關。
1.4 分泌功能的改變
MSCs除了增殖和分化能力外，還具有分泌功能，可分泌多種細胞因子，包括非造血生長因子、趨化因子、黏附分子、細胞基質分子及細胞外基質分子等，并通過這些因子誘導造血干細胞表達歸巢受體，調節骨髓微環境，調節免疫功能，促進造血干細胞及MSCs的增殖分化。然而隨著MSCs的衰老，其分泌功能也會出現諸多變化。Asumda等[9]研究發現，15月齡大鼠MSCs表達VEGF、IGF、EGF和粒細胞集落刺激因子的水平較4月齡大鼠MSCs顯著降低。在研究衰老MSCs對免疫功能的影響中，衰老組（第13代MSCs）中與免疫抑制有關的血紅素加氧酶1、IL-10、iNOS和IL-2基因的表達水平比對照組（第5代MSCs）明顯上調，而促炎因子IL-1α、IL-1β和IFN-γ基因的表達水平下降，免疫調節因子吲哚胺2，3雙加氧酶1、環氧合酶2和TGF-β的表達水平未發生明顯變化，衰老MSCs分泌功能的變化影響了其對免疫的調控功能[26]。寧雪等[27]在研究衰老MSCs的生物學特性及基因譜的表達中發現，利用基因芯片篩選出的差異基因中涉及多項生物學進程，如物質合成、代謝及其運輸及分泌過程的調節等。其中脫氧核糖核酸代謝過程的相關基因上調最為顯著，還有其他上調的生物進程包括翻譯的終止、主要組織相容性復合體Ⅰ介導的抗原遞呈、宿主對病毒防御反應的調節、脂多糖介導的信號轉導等。下調的生物進程最為顯著的是紡錘體微管-染色體的附著，此外還包括微管功能、運輸（核定位系統介導的核內物質運送、Smad蛋白向核內的運輸）、調節（負性趨化、樹突發育的正性調控）、包被（高爾基體囊泡的蛋白質包被、高爾基體運輸囊泡的包被）、細胞內部對紫外線的反應以及內質網對未折疊蛋白質的處理等，從另一角度論證了MSCs衰老后，造成其整個分泌功能的減退。
2 MSCs衰老的機制
MSCs衰老調控機制極為復雜，多種影響因素參與其中。MSCs衰老機制有諸多學說，主要集中在端粒與端粒酶調控、應激損傷兩大方面。
2.1 端粒與端粒酶調控
端粒是真核細胞染色體末端富含G的DNA重復序列，端粒磨損會促進衰老。端粒酶是一種能延長端粒末端的核酸蛋白酶，該酶由蛋白質和RNA組成，以其自身的內源性RNA為模板，通過RNA指導的DNA合成作用向端粒末端添加（TTAGGG）n序列，使端粒延長，進而延長細胞壽命[25, 28]。研究表明，無論在體外還是體內的老化，人MSCs的增殖能力與端粒長度之間均具有相關性[24]。許多實驗發現MSCs體外擴增衰老伴隨端粒縮短的現象[1, 5-6, 12]。有報道MSCs端粒縮短的速率是50～ 100 bp/ PD[5, 12]。端粒的平均長度從早期傳代細胞的10.4 kbp減少至晚期傳代細胞的7.1 kbp，經長期培養的MSCs端粒長度遠低于早期細胞的平均值[5]。有報道當MSCs端粒長度＜10 kbp時將停止分裂[12]。以上研究均證實了MSCs衰老與端粒長度之間的相關性。而且研究發現人MSCs端粒長度比大鼠MSCs更短，至衰老階段時人MSCs端粒長度的損失超過了50%，而大鼠MSCs只損失了15%，但兩者平均每代縮短的長度卻類似。說明端粒的縮短程度不僅與端粒的保護機制有關，而且與其初始長度也有密切關系[29]。
生殖細胞和胚胎干細胞因可持續表達TERT基因，使得其可保持較高的端粒酶活性和無限增殖能力[27, 30]。有報道TERT的轉染或過度表達會提高端粒酶活性，延長MSCs細胞壽命周期[24-25, 31-32]。目前多將攜帶TERT基因的載體轉染MSCs，激活其端粒酶，使被轉染的MSCs端粒酶活性升高。有實驗將人乳頭狀瘤病毒16型E6E7區基因（HPV16 E6E7）聯合人TERT基因轉染至人MSCs，能升高MSCs的DNA甲基化水平，使其一直保持干細胞特性，包括無限增殖潛能及高分化效率。而且發現HPV16 E6E7與人TERT基因聯合轉染MSCs的干細胞特性優于單獨轉染HPV16 E6E7的MSCs，從側面證實了TERT在MSCs衰老過程中的重要作用[32]。同時其他研究通過TERT基因轉染也得到了類似結果[23, 33-34]。這為解決由端粒縮短引起的MSCs衰老提供了一種新思路。另外，盡管研究MSCs端粒酶活性的檢測報道很多，但目前尚未達成共識。可能是由于端粒酶活性檢測方法眾多，不同檢測方法的敏感性不同，使得來自不同物種和年齡的MSCs檢測結果存在差異。
2.2 應激損傷
在眾多應激影響因素中，氧化應激對MSCs衰老的影響十分重要。有研究顯示長期亞致死水平的氧化應激會降低MSCs分化能力和增殖率，并誘導細胞周期G0/G1阻滯及衰老相關的形態學特征，SA-β-gal陽性率明顯提高，同時SOD1、SOD2基因表達升高[35]。Li等[36]采用400 μmol H2O2作用于MSCs 12 h建立氧化損傷模型，通過綠原酸干預后發現，可通過上調叉頭轉錄因子O亞族基因及抗凋亡基因B淋巴細胞瘤2的表達及激活P13K/Akt信號通路來抑制活性氧族（reactive oxygen species，ROS）產生，對MSCs起到保護作用，為防止氧化應激導致MSCs的過早衰老提供了思路。
有研究認為氧化應激損傷主要通過調控p21、p53基因表達來誘導衰老[37-38]。氧化應激導致細胞的抗氧化系統失衡，胞內產生大量ROS，ROS通過作用于p53使得下游靶點p21抑制CDK/cyclin復合體的活性，并下調pRb/E2F軸，從而降低MSCs的自我更新及再生能力，促使其衰老[38]。也有實驗使用老年大鼠（64～68周齡）血清處理MSCs后發現，MSCs受到氧化應激損傷，p53/p21、ROS及SA-β-gal表達上調，同時DNA損傷的標志γ-H2AX在細胞中表達水平明顯升高，細胞呈現衰老表型[39]。但有研究發現，長時間低水平的氧化應激對MSCs的增殖及形態無任何影響，只有亞致死水平或高水平的氧化應激才會誘導MSCs衰老、甚至凋亡[40]。Tsai等[41]研究也顯示，低氧有利于MSCs增殖傳代，并且發現低氧條件下低氧誘導因子1α和堿螺旋-環-螺旋結構的轉錄因子水平明顯升高，二者均可通過抑制p21的表達來延緩MSCs衰老。上述研究表明，氧化應激水平的不同對MSCs造成的影響不盡相同，但相關研究均證實了在氧化應激誘導的MSCs老化中，p53/p21信號通路有重要調節作用[37-41]。
此外，DNA的復制應激也會促進細胞衰老的發生。已有研究證明DNA復制過程中，基因突變會引起單鏈DNA斷裂，復制叉停滯，出現復制應激。復制應激誘導的DNA損傷會下調端粒酶功能，進而誘導了端粒DNA的損傷[42]。并且復制應激對端粒DNA造成的損傷無法彌補，導致DNA損傷的持續累積，引發細胞衰老的進程[43]。
目前一些研究也關注了微環境對MSCs老化的影響。在研究16～17月齡大鼠血清對MSCs的老化影響中發現，老年大鼠血清促進MSCs衰老并減少細胞的增殖和存活，免疫熒光染色顯示衰老MSCs中的β-連環蛋白（β-catenin）表達增加；結果表明，經過老年大鼠血清處理后在細胞內的Wnt/β-catenin信號通路被激活，且MSCs衰老和功能障礙可被Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK1或β-catenin的小干擾RNA逆轉，表明Wnt/β-catenin信號通路在老年大鼠血清引起的MSCs衰老中發揮了關鍵作用[39]。而將氧化應激誘導的髓核細胞與BMSCs共培養研究發現，損傷髓核細胞微環境下BMSCs呈現衰老變化，其細胞體積增大、扁平，細胞質和細胞核比例增加，核膜內折、核染色質濃縮，細胞質內顆粒或空泡狀物質增多，SA-β-gal活性上調；研究結果顯示BMSCs在對損傷的髓核細胞進行修復同時，也受到衰老髓核細胞營造的微環境影響，其自身生物學行為也會發生相應改變[44]。
3 總結與展望
與胚胎干細胞相比，雖然MSCs的增殖、分化潛能相對較受限制，但MSCs的致瘤性方面更為安全[1]。目前面臨的問題是MSCs的性質會因衰老逐漸受到損害，包括多向分化潛能、造血支持、歸巢、免疫調節等。將MSCs安全地用于臨床，需對其衰老過程、機制及影響因素深入了解。可通過調節衰老相關的端粒酶活性、干預應激狀態或微環境中的P13K/Akt、Wnt/β-catenin等信號通路或p16、p21、p53基因表達來延緩或防止MSCs的衰老，更好地將其應用于組織工程，以提高臨床療效。但基于MSCs衰老類型的不同機制及其影響其各個功能的途徑十分復雜，更確切的機制有待于進一步研究。
在人的整個生命周期中，不同的人體組織細胞壽命有所不同，但都會衰老死亡被新的細胞取代，這些新細胞由各種干細胞分化而來。干細胞在保持機體穩態和組織器官的動態平衡、修復、再生等方面有著舉足輕重的作用。在各種成人干細胞中，MSCs的臨床應用比較廣泛。MSCs可從多種結締組織中分離出來，包括骨髓、脂肪組織、牙髓、羊水、臍帶膠質和臍帶血等。MSCs應用于細胞療法有許多優點，包括多向分化潛力、歸巢、免疫調節功能和傷口愈合效果突出等[1]，近年來廣泛用于組織工程研究。理論上，MSCs可無限增殖、生長，但它們并不是永生的。有報道培養7～12代或更多代數后人MSCs會出現衰老[1-3]。隨著MSCs的老化，其數量和功能出現與年齡相關的下降，由此引起細胞干性、組織動態平衡、再生和修復功能的損失[4]，但衰老相關因素和具體機制尚不十分清楚。MSCs衰老是一極其復雜的過程，影響大多數有機體的生物學功能，破壞組織器官的穩態性，降低機體對損傷或應激的反應能力，并最終導致疾病和死亡。對于MSCs衰老的機制有諸多學說，包括氧化反應損傷、端粒的磨損短縮、DNA損傷和逐漸下降的DNA修復能力，以及表觀遺傳學的改變等。現對近年來關于MSCs衰老機制的研究進展進行綜述，為提高MSCs后期實驗及臨床應用的有效性提供思路。
1 MSCs特性及衰老的特征
MSCs具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控等特點。在適宜的體內或體外環境下可分化為造血細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、肝細胞等多種細胞；也可通過細胞與細胞之間的直接接觸，分泌可溶性因子來調節T細胞和B細胞功能，包括細胞的活化、增殖和趨化作用等。將MSCs用于治療前，其體外分離增殖至關重要。MSCs在體外培養有很強的增殖能力，但研究報道人和動物MSCs體外傳代培養后會出現衰老征象，并表現出相關特征[2-6]。MSCs的衰老涵蓋了逐漸喪失的增殖能力、分化潛能[7]，同樣包括其分泌多種細胞因子的能力，最終影響其功能的實現[8-9]。對MSCs衰老的研究也主要集中于形態學及干細胞相關功能改變。
1.1 形態學的改變
老化的MSCs在形態上的變化主要表現為細胞變得寬大扁平，足突增多[10]，多角形及星形細胞比例增加；細胞核增大，細胞質內出現細小顆粒或空泡，細胞核質比減少；細胞折光度差，黏附力增加；細胞群落變小，數量減少，增殖變慢[11]。
1.2 增殖潛能的改變
MSCs老化的標志之一是增殖分化能力的丟失[11]。有研究顯示[3]，來自不同捐贈者的MSCs，其同一代的培養倍增時間有明顯差異。該研究對8 名健康成年捐贈者的MSCs隨機編號，研究第9代細胞倍增時間，5號捐贈者為24 h，而1號捐贈者則達到了97.75 h；但來自同一捐贈者的細胞倍增時間會隨著代數增加而不斷延長，6號捐贈者在第6代的時間為24 h，第11代則達到了68 h。說明MSCs的增殖潛力存在個體差異，并會隨著傳代次數的增加而逐漸降低[3, 12-13]。
目前關于捐贈者年齡對MSCs影響的研究并不確切，但大多數研究結果傾向于年齡越大對MSCs負面影響越大[8-9, 14-15]。有報道對不同年齡組（＜30歲、35～50歲、＞60歲）脂肪來源MSCs細胞特性進行研究時發現，＞60歲組p16和p21的mRNA表達及衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associated-β-galactosidase，SA-β-gal）活性明顯升高，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降；細胞集落的數量、大小及生長趨勢均會隨捐贈者年齡增長而下降，倍增時間逐漸延長[14]。類似結果在動物實驗中也得到了驗證。有研究將來自4月齡及15月齡的大鼠MSCs進行對比，結果顯示后者端粒酶活性降低，DNA雙鏈斷裂標志泛素化組蛋白（γ-H2AX）活性明顯升高[8-9]；有研究對1、6、16月齡大鼠MSCs進行比較，結果顯示16月齡大鼠SA-β-gal陽性的MSCs數量增多，SA-β-gal活性明顯升高，通過流式細胞法檢測細胞周期發現S期的時相比例下降等，也印證了增殖能力會隨年齡增長而逐漸下降的結論[15]。然而，最近Hwang等[16]研究認為MSCs喪失增殖潛能的模型并不能被完全復制，他們在對＜20歲、20～39歲、40～59歲、＞60歲4組捐贈者MSCs的比較研究中，通過細胞計數盒檢測生長曲線并計算增殖率，結果發現捐贈者的年齡并未影響其增殖能力。也有研究對來自8個月～6歲組和38～58歲組兩組捐贈者的MSCs進行檢測，檢測指標包括脂褐素、遷移能力、端粒長度、誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、p16的表達產物和SOD活性，各項檢測結果顯示兩組間比較差異均無統計學意義；雖然從38～58歲組提取的MSCs在培養期間細胞量相對較少，并且倍增時間稍長，但與8個月～6歲組相比差異均無統計學意義，能達到較滿意的應用標準；而且該研究認為，用于細胞療法MSCs的捐獻者年齡最高可放寬到58歲[17]。對此爭議，目前一般認為體外培養環境較為單一，不足以反映機體內環境的復雜性；另外，實驗設計中對于年齡段的劃分尚無公認標準，導致各組之間年齡區分度不同，會影響研究的可信度；并且MSCs種屬來源、性別及來源組織均對結論的差異有影響。因此，充分考慮相關干擾因素有利于對此方面作深入研究。
1.3 分化潛能的改變
關于MSCs衰老對其本身分化潛能的影響有不同報道。Choudhery等[14]研究將＜30歲、35～50歲、 ＞60歲3個不同年齡組MSCs在體外分別誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經元樣細胞，細胞衰老檢測顯示p16、p21 mRNA水平及SA-β-gal活性隨年齡增長而上調，MSCs呈衰老表型。但其成脂特異性過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ）和脂蛋白脂肪酶（lipoproteinlipase，LPL）的mRNA水平、油紅O染色定量分析及陽性細胞計數比較，差異均無統計學意義；RT-PCR分析神經元樣細胞特定基因神經微絲蛋白和神經元特異性烯醇化酶的基因表達，也未發現與年齡分組相關的差異；而在成骨分化中對骨鈣蛋白和ALP基因的表達、鈣化基質的定性定量檢測及軟骨分化相關Ⅱ型膠原酶及蛋白多糖基因的表達水平檢測均發現，隨衰老水平上升出現明顯下降。有研究將12名捐贈者分為＜20歲、20～39歲、40～59歲及＞60歲不同年齡組，取各組MSCs進行體外培養，檢測發現各組間細胞增殖能力并無明顯差別；誘導成骨分化后檢測成骨分化特定標志BMP-2、Runx2、骨涎蛋白、Ⅰ型膠原、骨鈣素、成骨細胞特異性轉錄因子和骨橋蛋白（osteoponin，OP）的mRNA表達水平，結果顯示，除了40～59歲及＞60歲組OP水平較＜20歲、20～39 歲組明顯降低外，其他基因表達差異無統計學意義[16]。Zhu等[18]的研究也認為成骨分化潛力與年齡有關，但成脂分化則無相關性。但Khan等[19]將志愿者分為兩組，一組年齡（57±3）歲，另一組（86±3）歲，取各組脂肪來源的MSCs培養，研究發現兩組細胞增殖能力及成骨分化能力無明顯不同。對此爭議，根據目前的實驗方法及條件，應充分考慮并避免個體差異、取材年齡段不同的劃分標準及取材標本數量給實驗造成的誤差，才能合理揭示MSCs衰老對分化潛能的影響。
目前研究認為，MSCs的衰老會導致成骨分化潛能降低[20]。成骨細胞的減少導致骨細胞被破壞后的損失無法彌補，最終骨形成減少和成骨疾病風險增加，如骨質疏松癥等[21-22]。有研究通過暴露于電離輻射導致DNA損傷誘導BMSCs衰老，發現其衰老后成骨分化潛能下降與p53表達上升相關[23]。Liu等[24]報道MSCs單獨敲除p53基因或敲除p53基因聯合端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）基因過度表達后，成脂分化特異性標記PPAR-γ、LPL表達和油紅O染色程度顯著增強；僅單獨上調TERT基因表達，成脂分化未見明顯差異；在成骨及成軟骨方面，上述3種情況的成骨標志OP和ALP、成軟骨標志Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的表達均較正常MSCs明顯上調。Molchadsky等[25]將MSCs的p53基因敲除或過表達其活性，行成骨、成脂、成軟骨分化誘導，最后結果也證明分化潛能的改變與p53相關的MSCs衰老緊密相關。
1.4 分泌功能的改變
MSCs除了增殖和分化能力外，還具有分泌功能，可分泌多種細胞因子，包括非造血生長因子、趨化因子、黏附分子、細胞基質分子及細胞外基質分子等，并通過這些因子誘導造血干細胞表達歸巢受體，調節骨髓微環境，調節免疫功能，促進造血干細胞及MSCs的增殖分化。然而隨著MSCs的衰老，其分泌功能也會出現諸多變化。Asumda等[9]研究發現，15月齡大鼠MSCs表達VEGF、IGF、EGF和粒細胞集落刺激因子的水平較4月齡大鼠MSCs顯著降低。在研究衰老MSCs對免疫功能的影響中，衰老組（第13代MSCs）中與免疫抑制有關的血紅素加氧酶1、IL-10、iNOS和IL-2基因的表達水平比對照組（第5代MSCs）明顯上調，而促炎因子IL-1α、IL-1β和IFN-γ基因的表達水平下降，免疫調節因子吲哚胺2，3雙加氧酶1、環氧合酶2和TGF-β的表達水平未發生明顯變化，衰老MSCs分泌功能的變化影響了其對免疫的調控功能[26]。寧雪等[27]在研究衰老MSCs的生物學特性及基因譜的表達中發現，利用基因芯片篩選出的差異基因中涉及多項生物學進程，如物質合成、代謝及其運輸及分泌過程的調節等。其中脫氧核糖核酸代謝過程的相關基因上調最為顯著，還有其他上調的生物進程包括翻譯的終止、主要組織相容性復合體Ⅰ介導的抗原遞呈、宿主對病毒防御反應的調節、脂多糖介導的信號轉導等。下調的生物進程最為顯著的是紡錘體微管-染色體的附著，此外還包括微管功能、運輸（核定位系統介導的核內物質運送、Smad蛋白向核內的運輸）、調節（負性趨化、樹突發育的正性調控）、包被（高爾基體囊泡的蛋白質包被、高爾基體運輸囊泡的包被）、細胞內部對紫外線的反應以及內質網對未折疊蛋白質的處理等，從另一角度論證了MSCs衰老后，造成其整個分泌功能的減退。
2 MSCs衰老的機制
MSCs衰老調控機制極為復雜，多種影響因素參與其中。MSCs衰老機制有諸多學說，主要集中在端粒與端粒酶調控、應激損傷兩大方面。
2.1 端粒與端粒酶調控
端粒是真核細胞染色體末端富含G的DNA重復序列，端粒磨損會促進衰老。端粒酶是一種能延長端粒末端的核酸蛋白酶，該酶由蛋白質和RNA組成，以其自身的內源性RNA為模板，通過RNA指導的DNA合成作用向端粒末端添加（TTAGGG）n序列，使端粒延長，進而延長細胞壽命[25, 28]。研究表明，無論在體外還是體內的老化，人MSCs的增殖能力與端粒長度之間均具有相關性[24]。許多實驗發現MSCs體外擴增衰老伴隨端粒縮短的現象[1, 5-6, 12]。有報道MSCs端粒縮短的速率是50～ 100 bp/ PD[5, 12]。端粒的平均長度從早期傳代細胞的10.4 kbp減少至晚期傳代細胞的7.1 kbp，經長期培養的MSCs端粒長度遠低于早期細胞的平均值[5]。有報道當MSCs端粒長度＜10 kbp時將停止分裂[12]。以上研究均證實了MSCs衰老與端粒長度之間的相關性。而且研究發現人MSCs端粒長度比大鼠MSCs更短，至衰老階段時人MSCs端粒長度的損失超過了50%，而大鼠MSCs只損失了15%，但兩者平均每代縮短的長度卻類似。說明端粒的縮短程度不僅與端粒的保護機制有關，而且與其初始長度也有密切關系[29]。
生殖細胞和胚胎干細胞因可持續表達TERT基因，使得其可保持較高的端粒酶活性和無限增殖能力[27, 30]。有報道TERT的轉染或過度表達會提高端粒酶活性，延長MSCs細胞壽命周期[24-25, 31-32]。目前多將攜帶TERT基因的載體轉染MSCs，激活其端粒酶，使被轉染的MSCs端粒酶活性升高。有實驗將人乳頭狀瘤病毒16型E6E7區基因（HPV16 E6E7）聯合人TERT基因轉染至人MSCs，能升高MSCs的DNA甲基化水平，使其一直保持干細胞特性，包括無限增殖潛能及高分化效率。而且發現HPV16 E6E7與人TERT基因聯合轉染MSCs的干細胞特性優于單獨轉染HPV16 E6E7的MSCs，從側面證實了TERT在MSCs衰老過程中的重要作用[32]。同時其他研究通過TERT基因轉染也得到了類似結果[23, 33-34]。這為解決由端粒縮短引起的MSCs衰老提供了一種新思路。另外，盡管研究MSCs端粒酶活性的檢測報道很多，但目前尚未達成共識。可能是由于端粒酶活性檢測方法眾多，不同檢測方法的敏感性不同，使得來自不同物種和年齡的MSCs檢測結果存在差異。
2.2 應激損傷
在眾多應激影響因素中，氧化應激對MSCs衰老的影響十分重要。有研究顯示長期亞致死水平的氧化應激會降低MSCs分化能力和增殖率，并誘導細胞周期G0/G1阻滯及衰老相關的形態學特征，SA-β-gal陽性率明顯提高，同時SOD1、SOD2基因表達升高[35]。Li等[36]采用400 μmol H2O2作用于MSCs 12 h建立氧化損傷模型，通過綠原酸干預后發現，可通過上調叉頭轉錄因子O亞族基因及抗凋亡基因B淋巴細胞瘤2的表達及激活P13K/Akt信號通路來抑制活性氧族（reactive oxygen species，ROS）產生，對MSCs起到保護作用，為防止氧化應激導致MSCs的過早衰老提供了思路。
有研究認為氧化應激損傷主要通過調控p21、p53基因表達來誘導衰老[37-38]。氧化應激導致細胞的抗氧化系統失衡，胞內產生大量ROS，ROS通過作用于p53使得下游靶點p21抑制CDK/cyclin復合體的活性，并下調pRb/E2F軸，從而降低MSCs的自我更新及再生能力，促使其衰老[38]。也有實驗使用老年大鼠（64～68周齡）血清處理MSCs后發現，MSCs受到氧化應激損傷，p53/p21、ROS及SA-β-gal表達上調，同時DNA損傷的標志γ-H2AX在細胞中表達水平明顯升高，細胞呈現衰老表型[39]。但有研究發現，長時間低水平的氧化應激對MSCs的增殖及形態無任何影響，只有亞致死水平或高水平的氧化應激才會誘導MSCs衰老、甚至凋亡[40]。Tsai等[41]研究也顯示，低氧有利于MSCs增殖傳代，并且發現低氧條件下低氧誘導因子1α和堿螺旋-環-螺旋結構的轉錄因子水平明顯升高，二者均可通過抑制p21的表達來延緩MSCs衰老。上述研究表明，氧化應激水平的不同對MSCs造成的影響不盡相同，但相關研究均證實了在氧化應激誘導的MSCs老化中，p53/p21信號通路有重要調節作用[37-41]。
此外，DNA的復制應激也會促進細胞衰老的發生。已有研究證明DNA復制過程中，基因突變會引起單鏈DNA斷裂，復制叉停滯，出現復制應激。復制應激誘導的DNA損傷會下調端粒酶功能，進而誘導了端粒DNA的損傷[42]。并且復制應激對端粒DNA造成的損傷無法彌補，導致DNA損傷的持續累積，引發細胞衰老的進程[43]。
目前一些研究也關注了微環境對MSCs老化的影響。在研究16～17月齡大鼠血清對MSCs的老化影響中發現，老年大鼠血清促進MSCs衰老并減少細胞的增殖和存活，免疫熒光染色顯示衰老MSCs中的β-連環蛋白（β-catenin）表達增加；結果表明，經過老年大鼠血清處理后在細胞內的Wnt/β-catenin信號通路被激活，且MSCs衰老和功能障礙可被Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK1或β-catenin的小干擾RNA逆轉，表明Wnt/β-catenin信號通路在老年大鼠血清引起的MSCs衰老中發揮了關鍵作用[39]。而將氧化應激誘導的髓核細胞與BMSCs共培養研究發現，損傷髓核細胞微環境下BMSCs呈現衰老變化，其細胞體積增大、扁平，細胞質和細胞核比例增加，核膜內折、核染色質濃縮，細胞質內顆粒或空泡狀物質增多，SA-β-gal活性上調；研究結果顯示BMSCs在對損傷的髓核細胞進行修復同時，也受到衰老髓核細胞營造的微環境影響，其自身生物學行為也會發生相應改變[44]。
3 總結與展望
與胚胎干細胞相比，雖然MSCs的增殖、分化潛能相對較受限制，但MSCs的致瘤性方面更為安全[1]。目前面臨的問題是MSCs的性質會因衰老逐漸受到損害，包括多向分化潛能、造血支持、歸巢、免疫調節等。將MSCs安全地用于臨床，需對其衰老過程、機制及影響因素深入了解。可通過調節衰老相關的端粒酶活性、干預應激狀態或微環境中的P13K/Akt、Wnt/β-catenin等信號通路或p16、p21、p53基因表達來延緩或防止MSCs的衰老，更好地將其應用于組織工程，以提高臨床療效。但基于MSCs衰老類型的不同機制及其影響其各個功能的途徑十分復雜，更確切的機制有待于進一步研究。