引用本文： 竇艷華, 趙錦, 張力, 王雪鷹, 苑紅, 苑春慧. 自體骨髓單個核細胞移植治療糖尿病重癥下肢動脈硬化閉塞癥的隨訪研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(7): 893-898. doi: 10.7507/1002-1892.20150192 復制
糖尿病下肢動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是糖尿病全身動脈病變的局部表現，以膝下動脈多節段長段閉塞性病變為主，病變血管鈣化嚴重[1]。隨病情進展，ASO的藥物治療效果不佳，多采用血管腔內治療[2-3]和動脈血管搭橋手術治療[4]，以重建糖尿病ASO患者下肢遠端血供，降低截肢率和死亡率。但由于糖尿病下肢ASO常表現為彌漫性病變和動脈遠端重度狹窄或閉塞，部分患者無法接受經皮血管成形術或外科動脈搭橋，截肢成為這類糖尿病患者生存的唯一選擇[5]。自2002年Tateishi-Yuyama等[6]率先報道細胞移植治療ASO的短期有效性以來，已有多個研究組采用骨髓或外周血來源的細胞治療下肢ASO，結果表明BMSCs[7-9]、動員外周血干細胞[9-10]、MSCs[11]等移植均能改善患者下肢側支循環和血流灌注，患肢冷感、疼痛、間歇性跛行、潰瘍明顯好轉，為ASO患者進一步治療爭取了時間；但缺乏長期隨訪的臨床資料，特別是糖尿病重癥ASO患者經骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BM-MNC）移植后的總生存（overall survival，OS）、保肢生存（amputation-free survival，AFS）和致瘤性的資料。本研究比較了行內科常規治療和內科常規治療聯合BM-MNC移植治療的糖尿病重癥ASO患者在3年內的死亡、截肢情況，結合動脈硬化風險因素復診結果，探討BM-MNC移植在糖尿病重癥下肢ASO治療中應用的安全性和長期療效。報告如下。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① 根據1999年世界衛生組織（WHO）標準診斷為糖尿病的患者；② 根據姚克純等[12]提出的Doppler下肢血管病變程度分級方法，篩選下肢動脈重度病變患者；③ 行下肢數字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）檢查顯示患側肢體膝以下脛前動脈、脛后動脈、腓總動脈至少2支動脈血管完全閉塞。
排除標準：① 糖尿病合并急性心肌缺血、急性腦血管病變、急慢性肝腎功能不全者；② 糖尿病合并增殖期視網膜病變者；③ 伴發惡性腫瘤者；④ 合并嚴重感染者；⑤ 患側下肢髂總動脈、髂外動脈、股動脈、腘動脈單一或多段血管完全閉塞者。
2007年1月－2010年1月共61例糖尿病重癥下肢ASO患者符合選擇標準納入研究，隨機分為2 組。對照組29例僅采用內科常規治療，治療組32例在內科常規治療基礎上行自體BM-MNC移植治療。移植前均按照2005年國務院《醫院管理條例》第33條規定告知治療組患者治療風險，自體BM-MNC移植術經錦州市中心醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。
1.2 一般資料
對照組：男20例，女9例；年齡46～78歲，平均68.2歲。病程1～25年，平均9.7年。Fontatine分期3期9例，4期20例。足部潰瘍20例。治療組：男22例，女10例；年齡48～78歲，平均65.7歲。病程3個月～30年，平均7.1年。Fontatine分期3 期12例，4期20例。足部潰瘍20例。兩組患者性別、年齡、病程、Fontatine分期以及動脈硬化風險指標血糖、甘油三脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，CHOL）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表 1。
表1
兩組患者治療前后動脈硬化風險指標比較（1.3 治療方法
兩組患者均給予內科常規治療，包括：生活方式干預控制患者每日總熱量；胰島素或聯合鹽酸二甲雙胍、阿卡波糖控制血糖，空腹血糖降至8 mmol/ L左右，餐后2 h血糖降至10 mmol/L左右；鈣離子拮抗劑、血管轉換酶抑制劑降壓，SBP控制在140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、DBP 90 mm Hg以下；他汀類調脂，LDL低于2.5 mmol/L；拜阿司匹林0.1 g/d抗血小板聚集；口服鹽酸沙格雷酯100 mg/次，每天3 次；伴足部潰瘍者行足部清創換藥。
治療組在此基礎上參考谷涌泉等[13]方法行自體BM-MNC移植治療。① 制備BM-MNC細胞懸液。給予患者人重組粒細胞集落刺激因子300～ 600 U/ d，共3 d；第4天在無菌手術間局麻下于雙側髂后上棘處抽取自體骨髓200～220 mL，采用密度梯度離心法分離出BM-MNC，以生理鹽水稀釋為細胞懸液40～60 mL，含BM-MNC （1.3～9.8） ×1012 個 / L。② 患肢局部注射BM-MNC。靜脈滴注丙泊酚注射液麻醉（誘導期20 mg/10 s，維持期4～10 mg/ kg），麻醉滿意后，予以患側小腿肌肉多點注射BM-MNC，每點0.8～1.0 mL，深度1～2 cm，間隔2～3 cm，從上到下順序注射。③ 細胞移植后患者取平臥位，完全清醒后給予常規飲食，同時心電監護監測生命體征變化，注意觀察患肢注射點有無滲血、紅腫，指導患者盡早離床活動。
1.4 隨訪指標
患者出院后定期隨訪，患者死亡或截肢隨訪終止，記錄死亡及截肢情況，比較兩組患者總OS率、OS時間及AFS率、AFS時間，并逐年比較兩組治療后1、2、3年的OS率、OS時間及AFS率、AFS時間。末次隨訪時檢查血糖、TG、CHOL、LDL-C、HbA1c、SBP、DPB等動脈硬化風險指標；隨訪期間觀察有無惡性腫瘤發生。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
治療后兩組患者均獲隨訪，對照組隨訪時間2～36個月，平均21.3個月；治療組隨訪時間3～36個月，平均24.2個月。治療組患者接受BM-MNC移植后行細胞移植后常規護理，1例患者出現低燒反應（＜39℃），3 d后自行緩解。兩組均未發生局部炎性反應、過敏反應及全身性不良反應。隨訪期間所有患者均未發生惡性腫瘤。
對照組5例患者于治療后6～30個月死亡，總OS率為82.76%，OS時間為（32.31±9.08）個月；治療組7例患者于治療后14～26個月死亡，總OS率為78.13%，OS時間為（32.47±6.96）個月；兩組患者總OS率和OS時間比較差異均無統計學意義（χ2=0.207，P=0.753；t=0.077，P=0.939）。除對照組1 例患者因壞疽并發呼吸功能衰竭死亡外，余11例均死于心腦血管疾病，兩組死亡原因比較差異無統計學意義（χ2=1.527，P=0.417）。死亡患者均為接受截肢手術者。對照組15例患者于治療后2～32個月截肢，總AFS率為37.50%，AFS時間為（21.28±13.35）個月；治療組8例患者于治療后9～36個月截肢，總AFS率為68.00%，AFS時間為（28.38±9.48）個月；兩組患者總AFS率和AFS時間比較差異均有統計學意義（χ2=4.573，P=0.046；t=2.412，P=0.019）。
對照組治療后1、2、3年OS率分別為89.66%（26/29）、96.15%（25/26）、96.00%（24/25），治療組分別為100%（32/32）、81.25%（26/32）、96.15%（25/26）；對照組OS時間分別為（11.55±1.40）、（23.83±0.82）、（35.76±1.20）個月，治療組分別為（12.00±0.00）、（23.03±2.29）、（35.62±1.96）個月。對照組AFS率分別為73.08%（19/26）、72.22%（13/18）、75.00%（9/12），治療組分別為90.63%（29/32）、86.96%（20/23）、89.47%（17/19）；對照組AFS時間分別為（10.00± 3.80）、（22.68±3.37）、（34.08±3.17）個月，治療組分別為（11.91±0.53）、（22.52±2.73）、（35.10±2.79）個月。除治療后1年對照組的AFS時間明顯短于治療組（t=2.806，P=0.007）外，兩組逐年的OS率、OS時間、AFS率、AFS時間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。
共49例存活患者（對照組24例、治療組25例）獲得有效隨訪，血糖、TG、CHOL、LDL-C、HbA1c、SBP、DBP兩組內治療前后比較以及治療前后兩組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
3 討論
本研究通過比較內科常規治療和內科常規治療聯合自體BM-MNC移植治療糖尿病重癥下肢ASO的長期療效，結合隨訪檢查動脈硬化風險指標，考察BM-MNC移植后的不良反應和致瘤情況，評價自體BM-MNC移植的長期療效和安全性。
3.1 隨訪3年期間患者OS情況分析
ASO是導致糖尿病患者重度下肢缺血的最普遍原因之一，對于不能接受動脈旁路手術和血管腔內成形術的患者或手術失敗、效果不佳及術后復發患者，6個月截肢率高達40%，死亡率20%[14]，且糖尿病患者并發ASO增加冠狀動脈疾病或心血管疾病的風險[15]。既往有關糖尿病ASO患者長期療效評價的報道少，且樣本量小、隨訪時間短，得出的結論存在差異。Shigematsu等（1992）報道日本ASO重度下肢缺血患者1年OS率為81.5%，而2007年Nor gren等[16]報道的重度下肢缺血患者1年OS率不足80%。2011年Onodera等[9]的研究結果表明，BM-MNC移植治療ASO患者1年OS率為93%，而外周血單個核細胞移植后的1年OS率為76%，并得出BM-MNC移植提高了患者1年OS率的結論。我們在隨訪研究中也關注了這一點，隨訪第1年治療組OS率為100%，而對照組OS率為89.66%，但差異無統計學意義（χ2=3.482，P=0.102）。比較3年隨訪期以及逐年比較對照組和治療組的OS時間和OS率也發現，BM-MNC移植未明顯改變患者的OS率和OS時間（P＞0.05）。通過對3年隨訪期患者的動脈硬化風險指標隨訪發現，兩組患者治療前后各指標控制平穩（P＞0.05），組間比較也無統計學意義（P＞0.05）。考察隨訪患者死亡原因，我們發現死亡患者中僅有1例因糖尿病重癥下肢ASO導致壞疽并發呼吸功能衰竭死亡，而余11例均死于糖尿病引起的心腦血管疾病。因此我們推測，糖尿病重癥下肢ASO患者通過內科控制動脈硬化風險指標，加強潰瘍和壞疽的診治和護理，能減少下肢ASO引起的患者死亡。而糖尿病重癥下肢ASO患者在OS率和OS時間上并未從BM-MNC移植治療中獲益。
3.2 隨訪3年期間患者AFS情況分析
目前研究表明，細胞移植治療糖尿病ASO有血管發生、血管新生、動脈形成和旁分泌機制，從而改善和恢復下肢供血和供氧，達到保肢目的[17]。雖然對細胞移植治療的分子細胞學機制還存在諸多爭議[18]，但許多臨床研究表明細胞移植的短期（＜6個月）療效包括能減輕靜息痛、間歇性跛行等臨床癥狀[19]，改善經皮氧分壓、踝肱指數等指標[18-19]，以及明顯緩解下肢缺血性潰瘍和壞疽癥狀等[20-21]，進而降低了截肢風險[18-19]。我們的研究發現，對照組和治療組3年隨訪總AFS率分別為37.50%和68.00%，差異有統計學意義（χ2=4.573，P=0.046），而AFS時間治療組也較對照組延長（t=2.412，P=0.019）。值得關注的是，隨訪第1年治療組截肢患者AFS時間為（11.91±0.53）個月，明顯長于對照組的（10.00±3.80）個月（t=2.806，P=0.007）。該結果提示，BM-MNC移植短期和長期均能延長截肢時間、減少截肢率，可為手術、介入或更進一步的細胞治療帶來時間收益。
我科既往研究也觀察到了BM-MNC移植的短期療效[22]，但結合本研究OS和AFS的結果我們發現，單療程BM-MNC移植的1～3年臨床收益不能預示長期預后良好，其表現在經BM-MNC移植后糖尿病重癥下肢ASO患者的仍舊無法完全避免截肢（3 年隨訪期AFS率68.00%）。而且保肢存活患者下肢ASO癥狀依舊存在，可能隨著隨訪期的延長截肢率依舊會上升，這與Onodera等[9]和Gupta等[23]的觀點一致。
3.3 隨訪3年期間患者動脈硬化風險指標分析
糖尿病重癥下肢ASO的病因和進展機制非常復雜，是全身性疾病，其死亡原因大多是心腦血管病變，因此其疾病控制既要考慮緩解下肢缺血性病變的癥狀，又要始終重視全身疾病的綜合治療及預防干預，特別是可能伴發的心腦血管疾病，內科治療要積極控制高血糖、高血壓、高血脂等動脈硬化風險因素，才能有效提高OS率和AFS率[16, 24]。本研究結果表明，對照組、治療組治療前后血糖、TG、CHOL、LDL-C、HbA1c、SBP、DBP比較差異無統計學意義（P＞0.05），可能是對照組和治療組隨訪3年死亡率較低的主要原因。而BM-MNC局部移植治療對糖尿病全身血管病變的貢獻可能非常小，這也與本研究考察OS率和OS時間的結果一致。BM-MNC局部移植治療延長了患者AFS時間，提高了3年AFS率，但截肢依舊無法避免，可能也與動脈硬化風險指標無顯著緩解有關。
3.4 隨訪3年期間BM-MNC移植治療安全性分析
許多研究證實了細胞移植治療重度下肢缺血癥的安全性，患者很少出現移植物抗宿主病、細胞移植相關的猝死等嚴重不良反應，而且與移植相關的發熱、血腫、絞痛、局部炎癥和過敏反應等輕微不良反應發生率也很低，采用臨床對癥治療很容易得到緩解[18, 21]。但也有嚴重不良反應報道，Jonsson等[25]發現自體外周血單個核細胞移植治療重度下肢缺血癥時，增加了心肌梗死、心臟衰竭和大規模腸系膜血栓形成的風險。我們的隨訪結果表明，BM-MNC移植未增加心腦血管疾病風險（χ2=1.527，P=0.417），而且在臨床治療過程中，僅發現1例患者出現低燒反應（＜39℃），3 d后自行緩解，說明BM-MNC局部注射是安全的。隨訪過程中，本研究61例患者均無腫瘤發生隱患，但不能認為自體BM-MNC移植不存在致瘤風險。惡性腫瘤在自體骨髓或外周血干細胞移植后也可能發生，與患者自身攜帶腫瘤細胞有關，因此骨髓采集前檢查患者腫瘤標志物水平是必要的。
綜上述，BM-MNC經患肢肌肉移植治療糖尿病重癥下肢ASO是安全的，積極控制動脈硬化風險因素聯合BM-MNC移植能有效提高3年AFS率，延長患者截肢時間。
糖尿病下肢動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是糖尿病全身動脈病變的局部表現，以膝下動脈多節段長段閉塞性病變為主，病變血管鈣化嚴重[1]。隨病情進展，ASO的藥物治療效果不佳，多采用血管腔內治療[2-3]和動脈血管搭橋手術治療[4]，以重建糖尿病ASO患者下肢遠端血供，降低截肢率和死亡率。但由于糖尿病下肢ASO常表現為彌漫性病變和動脈遠端重度狹窄或閉塞，部分患者無法接受經皮血管成形術或外科動脈搭橋，截肢成為這類糖尿病患者生存的唯一選擇[5]。自2002年Tateishi-Yuyama等[6]率先報道細胞移植治療ASO的短期有效性以來，已有多個研究組采用骨髓或外周血來源的細胞治療下肢ASO，結果表明BMSCs[7-9]、動員外周血干細胞[9-10]、MSCs[11]等移植均能改善患者下肢側支循環和血流灌注，患肢冷感、疼痛、間歇性跛行、潰瘍明顯好轉，為ASO患者進一步治療爭取了時間；但缺乏長期隨訪的臨床資料，特別是糖尿病重癥ASO患者經骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BM-MNC）移植后的總生存（overall survival，OS）、保肢生存（amputation-free survival，AFS）和致瘤性的資料。本研究比較了行內科常規治療和內科常規治療聯合BM-MNC移植治療的糖尿病重癥ASO患者在3年內的死亡、截肢情況，結合動脈硬化風險因素復診結果，探討BM-MNC移植在糖尿病重癥下肢ASO治療中應用的安全性和長期療效。報告如下。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① 根據1999年世界衛生組織（WHO）標準診斷為糖尿病的患者；② 根據姚克純等[12]提出的Doppler下肢血管病變程度分級方法，篩選下肢動脈重度病變患者；③ 行下肢數字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）檢查顯示患側肢體膝以下脛前動脈、脛后動脈、腓總動脈至少2支動脈血管完全閉塞。
排除標準：① 糖尿病合并急性心肌缺血、急性腦血管病變、急慢性肝腎功能不全者；② 糖尿病合并增殖期視網膜病變者；③ 伴發惡性腫瘤者；④ 合并嚴重感染者；⑤ 患側下肢髂總動脈、髂外動脈、股動脈、腘動脈單一或多段血管完全閉塞者。
2007年1月－2010年1月共61例糖尿病重癥下肢ASO患者符合選擇標準納入研究，隨機分為2 組。對照組29例僅采用內科常規治療，治療組32例在內科常規治療基礎上行自體BM-MNC移植治療。移植前均按照2005年國務院《醫院管理條例》第33條規定告知治療組患者治療風險，自體BM-MNC移植術經錦州市中心醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。
1.2 一般資料
對照組：男20例，女9例；年齡46～78歲，平均68.2歲。病程1～25年，平均9.7年。Fontatine分期3期9例，4期20例。足部潰瘍20例。治療組：男22例，女10例；年齡48～78歲，平均65.7歲。病程3個月～30年，平均7.1年。Fontatine分期3 期12例，4期20例。足部潰瘍20例。兩組患者性別、年齡、病程、Fontatine分期以及動脈硬化風險指標血糖、甘油三脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，CHOL）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表 1。
表1
兩組患者治療前后動脈硬化風險指標比較（1.3 治療方法
兩組患者均給予內科常規治療，包括：生活方式干預控制患者每日總熱量；胰島素或聯合鹽酸二甲雙胍、阿卡波糖控制血糖，空腹血糖降至8 mmol/ L左右，餐后2 h血糖降至10 mmol/L左右；鈣離子拮抗劑、血管轉換酶抑制劑降壓，SBP控制在140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、DBP 90 mm Hg以下；他汀類調脂，LDL低于2.5 mmol/L；拜阿司匹林0.1 g/d抗血小板聚集；口服鹽酸沙格雷酯100 mg/次，每天3 次；伴足部潰瘍者行足部清創換藥。
治療組在此基礎上參考谷涌泉等[13]方法行自體BM-MNC移植治療。① 制備BM-MNC細胞懸液。給予患者人重組粒細胞集落刺激因子300～ 600 U/ d，共3 d；第4天在無菌手術間局麻下于雙側髂后上棘處抽取自體骨髓200～220 mL，采用密度梯度離心法分離出BM-MNC，以生理鹽水稀釋為細胞懸液40～60 mL，含BM-MNC （1.3～9.8） ×1012 個 / L。② 患肢局部注射BM-MNC。靜脈滴注丙泊酚注射液麻醉（誘導期20 mg/10 s，維持期4～10 mg/ kg），麻醉滿意后，予以患側小腿肌肉多點注射BM-MNC，每點0.8～1.0 mL，深度1～2 cm，間隔2～3 cm，從上到下順序注射。③ 細胞移植后患者取平臥位，完全清醒后給予常規飲食，同時心電監護監測生命體征變化，注意觀察患肢注射點有無滲血、紅腫，指導患者盡早離床活動。
1.4 隨訪指標
患者出院后定期隨訪，患者死亡或截肢隨訪終止，記錄死亡及截肢情況，比較兩組患者總OS率、OS時間及AFS率、AFS時間，并逐年比較兩組治療后1、2、3年的OS率、OS時間及AFS率、AFS時間。末次隨訪時檢查血糖、TG、CHOL、LDL-C、HbA1c、SBP、DPB等動脈硬化風險指標；隨訪期間觀察有無惡性腫瘤發生。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
治療后兩組患者均獲隨訪，對照組隨訪時間2～36個月，平均21.3個月；治療組隨訪時間3～36個月，平均24.2個月。治療組患者接受BM-MNC移植后行細胞移植后常規護理，1例患者出現低燒反應（＜39℃），3 d后自行緩解。兩組均未發生局部炎性反應、過敏反應及全身性不良反應。隨訪期間所有患者均未發生惡性腫瘤。
對照組5例患者于治療后6～30個月死亡，總OS率為82.76%，OS時間為（32.31±9.08）個月；治療組7例患者于治療后14～26個月死亡，總OS率為78.13%，OS時間為（32.47±6.96）個月；兩組患者總OS率和OS時間比較差異均無統計學意義（χ2=0.207，P=0.753；t=0.077，P=0.939）。除對照組1 例患者因壞疽并發呼吸功能衰竭死亡外，余11例均死于心腦血管疾病，兩組死亡原因比較差異無統計學意義（χ2=1.527，P=0.417）。死亡患者均為接受截肢手術者。對照組15例患者于治療后2～32個月截肢，總AFS率為37.50%，AFS時間為（21.28±13.35）個月；治療組8例患者于治療后9～36個月截肢，總AFS率為68.00%，AFS時間為（28.38±9.48）個月；兩組患者總AFS率和AFS時間比較差異均有統計學意義（χ2=4.573，P=0.046；t=2.412，P=0.019）。
對照組治療后1、2、3年OS率分別為89.66%（26/29）、96.15%（25/26）、96.00%（24/25），治療組分別為100%（32/32）、81.25%（26/32）、96.15%（25/26）；對照組OS時間分別為（11.55±1.40）、（23.83±0.82）、（35.76±1.20）個月，治療組分別為（12.00±0.00）、（23.03±2.29）、（35.62±1.96）個月。對照組AFS率分別為73.08%（19/26）、72.22%（13/18）、75.00%（9/12），治療組分別為90.63%（29/32）、86.96%（20/23）、89.47%（17/19）；對照組AFS時間分別為（10.00± 3.80）、（22.68±3.37）、（34.08±3.17）個月，治療組分別為（11.91±0.53）、（22.52±2.73）、（35.10±2.79）個月。除治療后1年對照組的AFS時間明顯短于治療組（t=2.806，P=0.007）外，兩組逐年的OS率、OS時間、AFS率、AFS時間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。
共49例存活患者（對照組24例、治療組25例）獲得有效隨訪，血糖、TG、CHOL、LDL-C、HbA1c、SBP、DBP兩組內治療前后比較以及治療前后兩組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
3 討論
本研究通過比較內科常規治療和內科常規治療聯合自體BM-MNC移植治療糖尿病重癥下肢ASO的長期療效，結合隨訪檢查動脈硬化風險指標，考察BM-MNC移植后的不良反應和致瘤情況，評價自體BM-MNC移植的長期療效和安全性。
3.1 隨訪3年期間患者OS情況分析
ASO是導致糖尿病患者重度下肢缺血的最普遍原因之一，對于不能接受動脈旁路手術和血管腔內成形術的患者或手術失敗、效果不佳及術后復發患者，6個月截肢率高達40%，死亡率20%[14]，且糖尿病患者并發ASO增加冠狀動脈疾病或心血管疾病的風險[15]。既往有關糖尿病ASO患者長期療效評價的報道少，且樣本量小、隨訪時間短，得出的結論存在差異。Shigematsu等（1992）報道日本ASO重度下肢缺血患者1年OS率為81.5%，而2007年Nor gren等[16]報道的重度下肢缺血患者1年OS率不足80%。2011年Onodera等[9]的研究結果表明，BM-MNC移植治療ASO患者1年OS率為93%，而外周血單個核細胞移植后的1年OS率為76%，并得出BM-MNC移植提高了患者1年OS率的結論。我們在隨訪研究中也關注了這一點，隨訪第1年治療組OS率為100%，而對照組OS率為89.66%，但差異無統計學意義（χ2=3.482，P=0.102）。比較3年隨訪期以及逐年比較對照組和治療組的OS時間和OS率也發現，BM-MNC移植未明顯改變患者的OS率和OS時間（P＞0.05）。通過對3年隨訪期患者的動脈硬化風險指標隨訪發現，兩組患者治療前后各指標控制平穩（P＞0.05），組間比較也無統計學意義（P＞0.05）。考察隨訪患者死亡原因，我們發現死亡患者中僅有1例因糖尿病重癥下肢ASO導致壞疽并發呼吸功能衰竭死亡，而余11例均死于糖尿病引起的心腦血管疾病。因此我們推測，糖尿病重癥下肢ASO患者通過內科控制動脈硬化風險指標，加強潰瘍和壞疽的診治和護理，能減少下肢ASO引起的患者死亡。而糖尿病重癥下肢ASO患者在OS率和OS時間上并未從BM-MNC移植治療中獲益。
3.2 隨訪3年期間患者AFS情況分析
目前研究表明，細胞移植治療糖尿病ASO有血管發生、血管新生、動脈形成和旁分泌機制，從而改善和恢復下肢供血和供氧，達到保肢目的[17]。雖然對細胞移植治療的分子細胞學機制還存在諸多爭議[18]，但許多臨床研究表明細胞移植的短期（＜6個月）療效包括能減輕靜息痛、間歇性跛行等臨床癥狀[19]，改善經皮氧分壓、踝肱指數等指標[18-19]，以及明顯緩解下肢缺血性潰瘍和壞疽癥狀等[20-21]，進而降低了截肢風險[18-19]。我們的研究發現，對照組和治療組3年隨訪總AFS率分別為37.50%和68.00%，差異有統計學意義（χ2=4.573，P=0.046），而AFS時間治療組也較對照組延長（t=2.412，P=0.019）。值得關注的是，隨訪第1年治療組截肢患者AFS時間為（11.91±0.53）個月，明顯長于對照組的（10.00±3.80）個月（t=2.806，P=0.007）。該結果提示，BM-MNC移植短期和長期均能延長截肢時間、減少截肢率，可為手術、介入或更進一步的細胞治療帶來時間收益。
我科既往研究也觀察到了BM-MNC移植的短期療效[22]，但結合本研究OS和AFS的結果我們發現，單療程BM-MNC移植的1～3年臨床收益不能預示長期預后良好，其表現在經BM-MNC移植后糖尿病重癥下肢ASO患者的仍舊無法完全避免截肢（3 年隨訪期AFS率68.00%）。而且保肢存活患者下肢ASO癥狀依舊存在，可能隨著隨訪期的延長截肢率依舊會上升，這與Onodera等[9]和Gupta等[23]的觀點一致。
3.3 隨訪3年期間患者動脈硬化風險指標分析
糖尿病重癥下肢ASO的病因和進展機制非常復雜，是全身性疾病，其死亡原因大多是心腦血管病變，因此其疾病控制既要考慮緩解下肢缺血性病變的癥狀，又要始終重視全身疾病的綜合治療及預防干預，特別是可能伴發的心腦血管疾病，內科治療要積極控制高血糖、高血壓、高血脂等動脈硬化風險因素，才能有效提高OS率和AFS率[16, 24]。本研究結果表明，對照組、治療組治療前后血糖、TG、CHOL、LDL-C、HbA1c、SBP、DBP比較差異無統計學意義（P＞0.05），可能是對照組和治療組隨訪3年死亡率較低的主要原因。而BM-MNC局部移植治療對糖尿病全身血管病變的貢獻可能非常小，這也與本研究考察OS率和OS時間的結果一致。BM-MNC局部移植治療延長了患者AFS時間，提高了3年AFS率，但截肢依舊無法避免，可能也與動脈硬化風險指標無顯著緩解有關。
3.4 隨訪3年期間BM-MNC移植治療安全性分析
許多研究證實了細胞移植治療重度下肢缺血癥的安全性，患者很少出現移植物抗宿主病、細胞移植相關的猝死等嚴重不良反應，而且與移植相關的發熱、血腫、絞痛、局部炎癥和過敏反應等輕微不良反應發生率也很低，采用臨床對癥治療很容易得到緩解[18, 21]。但也有嚴重不良反應報道，Jonsson等[25]發現自體外周血單個核細胞移植治療重度下肢缺血癥時，增加了心肌梗死、心臟衰竭和大規模腸系膜血栓形成的風險。我們的隨訪結果表明，BM-MNC移植未增加心腦血管疾病風險（χ2=1.527，P=0.417），而且在臨床治療過程中，僅發現1例患者出現低燒反應（＜39℃），3 d后自行緩解，說明BM-MNC局部注射是安全的。隨訪過程中，本研究61例患者均無腫瘤發生隱患，但不能認為自體BM-MNC移植不存在致瘤風險。惡性腫瘤在自體骨髓或外周血干細胞移植后也可能發生，與患者自身攜帶腫瘤細胞有關，因此骨髓采集前檢查患者腫瘤標志物水平是必要的。
綜上述，BM-MNC經患肢肌肉移植治療糖尿病重癥下肢ASO是安全的，積極控制動脈硬化風險因素聯合BM-MNC移植能有效提高3年AFS率，延長患者截肢時間。
