引用本文： 卞泗善, 蘇慶紅, 肖毅, 徐展望. FBS對成骨生長肽促進BMSCs增殖分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(2): 221-226. doi: 10.7507/1002-1892.20150047 復制
成骨生長肽（osteogenic growth peptide，OGP）是一種具有促進成骨作用的多肽類成骨生長因子，研究表明其在促進骨折愈合以及預防、治療骨質疏松癥方面具有良好效果，同時在骨組織工程等方面也具有潛在應用前景[1-2]。OGP促進成骨作用主要是促進骨源細胞BMSCs的增殖及向成骨細胞方向的特定分化[3]，因此其促進BMSCs增殖分化的作用越來越受到關注。但OGP促進BMSCs增殖分化的作用濃度一直存在爭議，王璐等[4]認為OGP濃度為1×10-9 mol/L時促增殖作用最強，1×10-8 mol/ L時促成骨能力最強；而徐楊等[5]提出1×10-9 mol/ L濃度下促成骨能力最強；肖毅等[6]研究表明，1×10-11～1×10-10 mol/L濃度范圍均能促進細胞增殖。相同藥物作用于相同細胞，其藥物最佳作用濃度差異較大，因此需要進一步探討培養體系對藥物作用于細胞的影響因素。FBS是細胞體外培養體系中不可缺少的組分，但FBS富含有絲分裂因子及多種細胞因子，具有促增殖和分化的作用，對BMSCs的實驗結果有一定影響[7]。目前，關于培養體系中FBS對OGP影響的研究罕見報道。為此，本實驗初步探究不同濃度FBS對OGP促進BMSCs增殖分化的影響，以期為體外細胞實驗選擇合理的OGP濃度和血清濃度提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級5周齡SD大鼠8只，雌雄不限，體重(100±10) g，購自山東中醫藥大學實驗動物中心。L-DMEM培養基、青-鏈霉素(GIBCO公司，美國)；FBS（天津康源生物技術有限公司）；OGP、MTT、胰蛋白酶、對硝基苯磷酸二鈉（p-nitrophenyl phosphate disodium，pNPP）、Triton X-100（北京博奧森生物技術有限責任公司）；BCA蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）。
超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；Sorvall T21高速低溫離心機（Sorvall Products公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2培養箱（TAI ESPEC公司，日本）；酶標儀（Bio-Tek公司，美國）。
1.2 BMSCs分離、培養與傳代
取SD大鼠拉頸脫臼處死，75%乙醇浸泡5 min，無菌條件下分離四肢股骨與脛骨，剪開兩端骨骺，用無菌注射器吸入含10%FBS的L-DMEM培養基，反復沖洗股骨與脛骨骨髓腔，收集沖洗液。用L-DMEM培養基調整細胞密度為1×107個/mL，接種至100 mL塑料培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養，每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。待細胞生長至瓶底面積80%后，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第3代形狀典型的BMSCs進行實驗。
1.3 MTT檢測細胞增殖
取BMSCs以含10%FBS的L-DMEM培養基調整密度至1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL。于37℃、5%CO2培養箱孵育8 h使細胞完全貼壁，更換不含血清的L-DMEM培養基繼續孵育12 h，使細胞周期同步，進行后續實驗。每枚96孔板均鋪設以下實驗組，分別為OGP 1×10-10 mol/L組、OGP 1×10-9 mol/L組、OGP 1×10-8 mol/L組和正常培養對照組，各組同時設FBS濃度為0、2%、5%、8%和10% 5個梯度亞組，各亞組設3個復孔，每3天換液1次。分別在培養后1、3、5、7、9、12 d取1枚96孔板進行MTT檢測，每孔加入10 μL MTT孵育4 h，棄去100 μL上清，補加100 μL 10%SDS，37℃過夜培養。酶標儀檢測各孔570 nm波長處吸光度（A）值。
1.4 pNPP法測定細胞內ALP活性
取BMSCs以含10%FBS的L-DMEM培養基調整密度至1×105個/mL接種于6孔板中，每孔3 mL。同1.3方法培養后進行后續實驗。實驗分為OGP 1×10-10 mol/L、OGP 1×10-9 mol/L組、OGP 1×10-8 mol/L組和正常培養對照組，各組同時設FBS濃度為5%、8%和10% 3個梯度亞組，各亞組設3個復孔，每3天換液1次。培養第9天時刮取6孔板內細胞，以1 500 × g 離心2 min后收集細胞至1.5 mL離心管中。每支離心管加入含0.1%Triton X-100的細胞裂解液200～500 μL，4℃冰上裂解20 min。4℃以10 000 × g離心10 min，收集上層裂解液。按照BCA蛋白測定試劑盒方法測定裂解液中總蛋白濃度，以蛋白含量（μg）為橫坐標，570 nm處A值為縱坐標，繪出總蛋白標準曲線，根據標準曲線算出樣品實際濃度（g/L）。ALP活性標準曲線測量方法：制備pNPP反應液，并在405 nm波長下測定不同濃度對硝基苯酚的A值，以ALP的活性單位（μ/g protein）作為自變量，對應的A值為應變量求直線回歸方程，得ALP活性反應的標準曲線。ALP活性的檢測和計算：取20 μL裂解液上清于96孔板中，加入100 μL pNPP反應液，37℃反應15 min，NaOH終止反應，于405 nm波長處測定A值。參考ALP活性標準曲線查活力值，并根據總蛋白含量的測定值得到檢測樣品中每克蛋白所含的ALP活性值。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，分離的細胞呈球形，大小不一，細胞邊緣清晰，胞體透亮，折光性強，為多種細胞相互混雜（圖 1 a）。24 h后可見少量細胞貼壁生長，形態逐漸呈不規則狀。首次換液后可見大量細胞伸展貼壁，呈棒狀，偶可見明顯偽足（圖 1 b）。隨培養時間延長，貼壁細胞數量繼續增多，體積增大，形態逐漸呈梭形；懸浮雜細胞隨著換液被棄除。7 d細胞增殖迅速，具有匯合趨勢，密集處呈漩渦狀分布（圖 1 c）。細胞形態符合BMSCs的典型特征。
圖1
細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 分離培養1 h ? 培養3 d ? 培養7 d? ?圖 2 MTT檢測各組細胞增殖變化 ? FBS濃度為0 ? FBS濃度為2% ? FBS濃度為5% ? FBS濃度為8% ? FBS濃度為10%? ?圖 3 各組ALP活性檢測結果
Figure1.
Morphology observation of BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ? At 1 hour after isolation culture ? At 3 days after culture ? At 7 days after culture? ? Fig. 2 Proliferation changes of cells in each group at different FBS concentrations by MTT test ? 0%FBS ? 2%FBS ? 5%FBS ? 8%FBS ? 10%FBS? ? Fig. 3 The activity of ALP in each group
2.2 MTT檢測細胞增殖
MTT檢測示，當培養液中FBS濃度為0時，加入OGP后1、3、5 d時均能短時促進BMSCs增殖，各OGP組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），但各OGP濃度組間差異無統計學意義（P＞0.05）。5 d后各組細胞均進入生長平臺期，隨后開始老化死亡。見圖 2 a。
當FBS濃度為2%時，加入OGP后1、3、5 d時均能促進BMSCs增殖，各OPG組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；各OGP濃度組間差異亦有統計學意義（P＜0.05），其中OGP 1×10-8 mol/L組促增殖效果最顯著。但7、9、12 d時隨著OGP劑量的降低，其促細胞增殖能力逐漸減弱（P＜0.05），呈現劑量依賴效應。見圖 2 b。
當FBS濃度為5%時，各時間點各組細胞促增殖效果明顯強于FBS濃度為0及2%時，差異有統計學意義（P＜0.05）。各OGP濃度組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。其中OGP 1×10-8 mol/ L組促增殖效果最顯著，各OGP濃度組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2 c。
當FBS濃度為8%時，各組細胞增殖差異更明顯，各時間點對照組與OGP 1×10-8 mol/L組及OGP 1×10-9 mol/L組比較差異有統計學意義（P＜0.05），但與OGP 1×10-10 mol/L組差異無統計學意義(P＞0.05) 。各OGP濃度組在各時間點均呈現出明顯的劑量依賴效應，其中OGP 1×10-8 mol/L組促增殖效果大于OGP 1×10-9 mol/L組和OGP 1×10-10 mol/L組（P＜0.05）。見圖 2 d。
當FBS濃度為10%時，OGP 1×10-10 mol/L組各時間點促增殖效果均低于對照組（P＜0.05）；OGP 1×10-9 mol/L組和OGP 1×10-8 mol/L組促增殖效果仍高于對照組（P＜0.05），但OGP 1×10-9 mol/L組和OGP 1×10-8 mol/L組差異縮小，差異無統計學意義(P＞0.05) ，OGP 1×10-8 mol/L組不再表現其促增殖的優勢。對照組隨著血清濃度由0增加到10%，細胞增殖加快，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2 e。
2.3 細胞內ALP活性檢測
各組組內隨FBS濃度增加，ALP活性相應增加，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。同一FBS濃度組間比較：當FBS濃度為5%、8%時，各OGP濃度組ALP活性均大于對照組，并且隨OGP濃度增大ALP活性也增加，OGP 1×10-8 mol/ L組ALP活性均高于其他OGP濃度組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。當FBS濃度為10%時，雖然各OGP濃度組ALP活性仍大于對照組（P＜0.05），但OGP 1×10-8 mol/L組與OGP 1×10-9 mol/L組比較差異已無統計學意義(P＞0.05) 。見圖 3。
3 討論
干細胞療法已成為治療各種疾病，包括創傷修復和組織再生的一種新方法[8]。BMSCs是一種存在于骨髓中的成體干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，在體外極易被擴增和定向分化為不同的細胞譜系[9]。體外培養BMSCs受培養基中的糖濃度、血清濃度、種植細胞密度、培養溫度、培養pH值等多種因素影響[10]，Barry等[11]認為培養基中的FBS使BMSCs更易于向成骨分化。目前，體外培養BMSCs時常在基礎培養基中添加牛血清以維持細胞增殖和生長，其可提供細胞所需的大多數因子，常添加濃度為10%的FBS。FBS一般來源于8～10月齡胎牛的血液，含有多種蛋白成分和含量不等的各種生長因子。血清中的生長因子是一組相對分子質量為（5～30）×103的蛋白，主要包括VEGF、EGF、FGF、NGF、PDGF和IGF，它們以特異的細胞表面受體作為生物起始信號，刺激細胞增殖和分化[12]。
BMSCs向特定細胞分化過程經歷了增殖和分化兩個階段，一般認為這兩個階段是一動態平衡過程，良好的增殖將有利于更多干細胞向所需要的細胞分化[13]。OGP在體外實驗中既能促進成骨細胞樣細胞增殖，又能促進其骨向分化，提高ALP活性。ALP活性的增加是成骨細胞早期分化的指標之一，ALP可水解有機磷酸酯，進而釋放磷酸鹽，使得游離的磷酸鹽與鈣發生結合，形成磷酸鈣沉積在細胞周圍基質的膠原中，最終形成新生骨[14]。因此，本實驗前期通過MTT檢測OGP對BMSCs增殖的影響，后期選取ALP作為分化能力檢測指標，以觀察在OGP作用下BMSCs成骨分化情況，并觀察不同血清濃度對增殖和分化的影響。
通過不同FBS濃度對3種濃度OGP促進BMSCs增殖的影響實驗，我們發現當FBS濃度為0 和2%時，血清濃度太低不能為細胞生長提供必需營養，以致無法持續增殖；5%FBS濃度因細胞生長緩慢，難以達到大量增殖進而分化的目的。因此，無血清或低血清普通培養基無法促進干細胞增殖，這可能與血清會誘導細胞內的鈣離子震蕩，而鈣離子震蕩對細胞的增殖和分化具有重要作用有關[15]。而8%FBS濃度能夠較好地促進細胞持續增殖，并使不同OGP濃度組間呈現出對細胞增殖的明顯差異。10%濃度的FBS因各種生長因子含量相對較高，促進了干細胞的增殖，并干擾了OGP的增殖作用，這也說明FBS中的其他生長因子對BMSCs的增殖作用不容忽視。
ALP活性檢測結果也提示，隨著培養系統中血清含量的增加，ALP活性也相應變化。對照組ALP活性隨著血清濃度升高呈微弱增加趨勢，可能與高濃度血清促進了BMSCs中的少量前成骨細胞增殖有關。各OGP濃度組隨FBS濃度的增加，ALP活性也顯著增加，說明FBS通過誘導BMSCs增殖，從而增加了細胞分化數量。值得關注的是，8%FBS濃度中OGP 1×10-8 mol/L組ALP活性顯著高于OGP 1×10-9 mol/L組，但10%FBS濃度中OGP 1×10-8 mol/ L組卻不再表現促分化優勢，說明10%FBS中可能含有較高濃度的其他成分對BMSCs增殖分化過程具有一定促進作用，干擾了實驗中OGP最佳藥物濃度的選擇。
針對血清中含有的部分生長因子，有研究者[10]在低糖低血清條件下添加EGF，發現可促使MSCs體外擴增，認為EGF體外刺激MSCs增殖與其是酪氨酸激酶生長因子的主要受體有關。bFGF對MSCs的擴增無明顯作用，但能改變MSCs的形態與克隆集落生成能力，在添加培養MSCs的生長因子時需引起注意[10]。血清中的PDGF是由2條多肽鏈通過二硫鍵連接而成的同型或異型二聚體，能刺激多種細胞如成骨細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等的分裂與增殖。PDGF可誘導c-jun基因的轉錄而影響增殖細胞核抗原的表達，從而刺激MSCs增殖[16]。IGF-1是含有70個氨基酸殘基的單鏈堿性多肽，已有研究證實IGF-1在分化早期階段主要激活MEK-ERK信號通路，通過劑量依賴方式誘導轉錄輔激活蛋白PDZ結合基序的表達，來促進大鼠BMSCs向成骨細胞分化，從而增加BMSCs體外培養時ALP活性和骨鈣素沉積的數量[17]。Binder等[18]研究也認為，10%的血清濃度對體外培養的細胞不是準確的生理環境，高水平血清對細胞增殖分化有影響。結合本研究MTT及ALP活性檢測結果，提示10%FBS濃度會影響BMSCs的增殖分化，而8%FBS濃度能夠保證BMSCs的持續生長，并且有利于對OGP最佳藥物濃度的選擇。
綜上述，本研究通過檢測對不同血清濃度培養條件下施加不同濃度的OGP誘導BMSCs增殖分化的情況，發現8%FBS的培養條件有利于檢測OGP對BMSCs增殖和分化的影響，為優化BMSCs的體外培養條件奠定了實驗基礎，也為深入探索OGP促進BMSCs增殖和分化的作用機制提供了參考。
成骨生長肽（osteogenic growth peptide，OGP）是一種具有促進成骨作用的多肽類成骨生長因子，研究表明其在促進骨折愈合以及預防、治療骨質疏松癥方面具有良好效果，同時在骨組織工程等方面也具有潛在應用前景[1-2]。OGP促進成骨作用主要是促進骨源細胞BMSCs的增殖及向成骨細胞方向的特定分化[3]，因此其促進BMSCs增殖分化的作用越來越受到關注。但OGP促進BMSCs增殖分化的作用濃度一直存在爭議，王璐等[4]認為OGP濃度為1×10-9 mol/L時促增殖作用最強，1×10-8 mol/ L時促成骨能力最強；而徐楊等[5]提出1×10-9 mol/ L濃度下促成骨能力最強；肖毅等[6]研究表明，1×10-11～1×10-10 mol/L濃度范圍均能促進細胞增殖。相同藥物作用于相同細胞，其藥物最佳作用濃度差異較大，因此需要進一步探討培養體系對藥物作用于細胞的影響因素。FBS是細胞體外培養體系中不可缺少的組分，但FBS富含有絲分裂因子及多種細胞因子，具有促增殖和分化的作用，對BMSCs的實驗結果有一定影響[7]。目前，關于培養體系中FBS對OGP影響的研究罕見報道。為此，本實驗初步探究不同濃度FBS對OGP促進BMSCs增殖分化的影響，以期為體外細胞實驗選擇合理的OGP濃度和血清濃度提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級5周齡SD大鼠8只，雌雄不限，體重(100±10) g，購自山東中醫藥大學實驗動物中心。L-DMEM培養基、青-鏈霉素(GIBCO公司，美國)；FBS（天津康源生物技術有限公司）；OGP、MTT、胰蛋白酶、對硝基苯磷酸二鈉（p-nitrophenyl phosphate disodium，pNPP）、Triton X-100（北京博奧森生物技術有限責任公司）；BCA蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）。
超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；Sorvall T21高速低溫離心機（Sorvall Products公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2培養箱（TAI ESPEC公司，日本）；酶標儀（Bio-Tek公司，美國）。
1.2 BMSCs分離、培養與傳代
取SD大鼠拉頸脫臼處死，75%乙醇浸泡5 min，無菌條件下分離四肢股骨與脛骨，剪開兩端骨骺，用無菌注射器吸入含10%FBS的L-DMEM培養基，反復沖洗股骨與脛骨骨髓腔，收集沖洗液。用L-DMEM培養基調整細胞密度為1×107個/mL，接種至100 mL塑料培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養，每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。待細胞生長至瓶底面積80%后，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第3代形狀典型的BMSCs進行實驗。
1.3 MTT檢測細胞增殖
取BMSCs以含10%FBS的L-DMEM培養基調整密度至1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL。于37℃、5%CO2培養箱孵育8 h使細胞完全貼壁，更換不含血清的L-DMEM培養基繼續孵育12 h，使細胞周期同步，進行后續實驗。每枚96孔板均鋪設以下實驗組，分別為OGP 1×10-10 mol/L組、OGP 1×10-9 mol/L組、OGP 1×10-8 mol/L組和正常培養對照組，各組同時設FBS濃度為0、2%、5%、8%和10% 5個梯度亞組，各亞組設3個復孔，每3天換液1次。分別在培養后1、3、5、7、9、12 d取1枚96孔板進行MTT檢測，每孔加入10 μL MTT孵育4 h，棄去100 μL上清，補加100 μL 10%SDS，37℃過夜培養。酶標儀檢測各孔570 nm波長處吸光度（A）值。
1.4 pNPP法測定細胞內ALP活性
取BMSCs以含10%FBS的L-DMEM培養基調整密度至1×105個/mL接種于6孔板中，每孔3 mL。同1.3方法培養后進行后續實驗。實驗分為OGP 1×10-10 mol/L、OGP 1×10-9 mol/L組、OGP 1×10-8 mol/L組和正常培養對照組，各組同時設FBS濃度為5%、8%和10% 3個梯度亞組，各亞組設3個復孔，每3天換液1次。培養第9天時刮取6孔板內細胞，以1 500 × g 離心2 min后收集細胞至1.5 mL離心管中。每支離心管加入含0.1%Triton X-100的細胞裂解液200～500 μL，4℃冰上裂解20 min。4℃以10 000 × g離心10 min，收集上層裂解液。按照BCA蛋白測定試劑盒方法測定裂解液中總蛋白濃度，以蛋白含量（μg）為橫坐標，570 nm處A值為縱坐標，繪出總蛋白標準曲線，根據標準曲線算出樣品實際濃度（g/L）。ALP活性標準曲線測量方法：制備pNPP反應液，并在405 nm波長下測定不同濃度對硝基苯酚的A值，以ALP的活性單位（μ/g protein）作為自變量，對應的A值為應變量求直線回歸方程，得ALP活性反應的標準曲線。ALP活性的檢測和計算：取20 μL裂解液上清于96孔板中，加入100 μL pNPP反應液，37℃反應15 min，NaOH終止反應，于405 nm波長處測定A值。參考ALP活性標準曲線查活力值，并根據總蛋白含量的測定值得到檢測樣品中每克蛋白所含的ALP活性值。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，分離的細胞呈球形，大小不一，細胞邊緣清晰，胞體透亮，折光性強，為多種細胞相互混雜（圖 1 a）。24 h后可見少量細胞貼壁生長，形態逐漸呈不規則狀。首次換液后可見大量細胞伸展貼壁，呈棒狀，偶可見明顯偽足（圖 1 b）。隨培養時間延長，貼壁細胞數量繼續增多，體積增大，形態逐漸呈梭形；懸浮雜細胞隨著換液被棄除。7 d細胞增殖迅速，具有匯合趨勢，密集處呈漩渦狀分布（圖 1 c）。細胞形態符合BMSCs的典型特征。
圖1
細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 分離培養1 h ? 培養3 d ? 培養7 d? ?圖 2 MTT檢測各組細胞增殖變化 ? FBS濃度為0 ? FBS濃度為2% ? FBS濃度為5% ? FBS濃度為8% ? FBS濃度為10%? ?圖 3 各組ALP活性檢測結果
Figure1.
Morphology observation of BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ? At 1 hour after isolation culture ? At 3 days after culture ? At 7 days after culture? ? Fig. 2 Proliferation changes of cells in each group at different FBS concentrations by MTT test ? 0%FBS ? 2%FBS ? 5%FBS ? 8%FBS ? 10%FBS? ? Fig. 3 The activity of ALP in each group
2.2 MTT檢測細胞增殖
MTT檢測示，當培養液中FBS濃度為0時，加入OGP后1、3、5 d時均能短時促進BMSCs增殖，各OGP組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），但各OGP濃度組間差異無統計學意義（P＞0.05）。5 d后各組細胞均進入生長平臺期，隨后開始老化死亡。見圖 2 a。
當FBS濃度為2%時，加入OGP后1、3、5 d時均能促進BMSCs增殖，各OPG組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；各OGP濃度組間差異亦有統計學意義（P＜0.05），其中OGP 1×10-8 mol/L組促增殖效果最顯著。但7、9、12 d時隨著OGP劑量的降低，其促細胞增殖能力逐漸減弱（P＜0.05），呈現劑量依賴效應。見圖 2 b。
當FBS濃度為5%時，各時間點各組細胞促增殖效果明顯強于FBS濃度為0及2%時，差異有統計學意義（P＜0.05）。各OGP濃度組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。其中OGP 1×10-8 mol/ L組促增殖效果最顯著，各OGP濃度組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2 c。
當FBS濃度為8%時，各組細胞增殖差異更明顯，各時間點對照組與OGP 1×10-8 mol/L組及OGP 1×10-9 mol/L組比較差異有統計學意義（P＜0.05），但與OGP 1×10-10 mol/L組差異無統計學意義(P＞0.05) 。各OGP濃度組在各時間點均呈現出明顯的劑量依賴效應，其中OGP 1×10-8 mol/L組促增殖效果大于OGP 1×10-9 mol/L組和OGP 1×10-10 mol/L組（P＜0.05）。見圖 2 d。
當FBS濃度為10%時，OGP 1×10-10 mol/L組各時間點促增殖效果均低于對照組（P＜0.05）；OGP 1×10-9 mol/L組和OGP 1×10-8 mol/L組促增殖效果仍高于對照組（P＜0.05），但OGP 1×10-9 mol/L組和OGP 1×10-8 mol/L組差異縮小，差異無統計學意義(P＞0.05) ，OGP 1×10-8 mol/L組不再表現其促增殖的優勢。對照組隨著血清濃度由0增加到10%，細胞增殖加快，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2 e。
2.3 細胞內ALP活性檢測
各組組內隨FBS濃度增加，ALP活性相應增加，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。同一FBS濃度組間比較：當FBS濃度為5%、8%時，各OGP濃度組ALP活性均大于對照組，并且隨OGP濃度增大ALP活性也增加，OGP 1×10-8 mol/ L組ALP活性均高于其他OGP濃度組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。當FBS濃度為10%時，雖然各OGP濃度組ALP活性仍大于對照組（P＜0.05），但OGP 1×10-8 mol/L組與OGP 1×10-9 mol/L組比較差異已無統計學意義(P＞0.05) 。見圖 3。
3 討論
干細胞療法已成為治療各種疾病，包括創傷修復和組織再生的一種新方法[8]。BMSCs是一種存在于骨髓中的成體干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，在體外極易被擴增和定向分化為不同的細胞譜系[9]。體外培養BMSCs受培養基中的糖濃度、血清濃度、種植細胞密度、培養溫度、培養pH值等多種因素影響[10]，Barry等[11]認為培養基中的FBS使BMSCs更易于向成骨分化。目前，體外培養BMSCs時常在基礎培養基中添加牛血清以維持細胞增殖和生長，其可提供細胞所需的大多數因子，常添加濃度為10%的FBS。FBS一般來源于8～10月齡胎牛的血液，含有多種蛋白成分和含量不等的各種生長因子。血清中的生長因子是一組相對分子質量為（5～30）×103的蛋白，主要包括VEGF、EGF、FGF、NGF、PDGF和IGF，它們以特異的細胞表面受體作為生物起始信號，刺激細胞增殖和分化[12]。
BMSCs向特定細胞分化過程經歷了增殖和分化兩個階段，一般認為這兩個階段是一動態平衡過程，良好的增殖將有利于更多干細胞向所需要的細胞分化[13]。OGP在體外實驗中既能促進成骨細胞樣細胞增殖，又能促進其骨向分化，提高ALP活性。ALP活性的增加是成骨細胞早期分化的指標之一，ALP可水解有機磷酸酯，進而釋放磷酸鹽，使得游離的磷酸鹽與鈣發生結合，形成磷酸鈣沉積在細胞周圍基質的膠原中，最終形成新生骨[14]。因此，本實驗前期通過MTT檢測OGP對BMSCs增殖的影響，后期選取ALP作為分化能力檢測指標，以觀察在OGP作用下BMSCs成骨分化情況，并觀察不同血清濃度對增殖和分化的影響。
通過不同FBS濃度對3種濃度OGP促進BMSCs增殖的影響實驗，我們發現當FBS濃度為0 和2%時，血清濃度太低不能為細胞生長提供必需營養，以致無法持續增殖；5%FBS濃度因細胞生長緩慢，難以達到大量增殖進而分化的目的。因此，無血清或低血清普通培養基無法促進干細胞增殖，這可能與血清會誘導細胞內的鈣離子震蕩，而鈣離子震蕩對細胞的增殖和分化具有重要作用有關[15]。而8%FBS濃度能夠較好地促進細胞持續增殖，并使不同OGP濃度組間呈現出對細胞增殖的明顯差異。10%濃度的FBS因各種生長因子含量相對較高，促進了干細胞的增殖，并干擾了OGP的增殖作用，這也說明FBS中的其他生長因子對BMSCs的增殖作用不容忽視。
ALP活性檢測結果也提示，隨著培養系統中血清含量的增加，ALP活性也相應變化。對照組ALP活性隨著血清濃度升高呈微弱增加趨勢，可能與高濃度血清促進了BMSCs中的少量前成骨細胞增殖有關。各OGP濃度組隨FBS濃度的增加，ALP活性也顯著增加，說明FBS通過誘導BMSCs增殖，從而增加了細胞分化數量。值得關注的是，8%FBS濃度中OGP 1×10-8 mol/L組ALP活性顯著高于OGP 1×10-9 mol/L組，但10%FBS濃度中OGP 1×10-8 mol/ L組卻不再表現促分化優勢，說明10%FBS中可能含有較高濃度的其他成分對BMSCs增殖分化過程具有一定促進作用，干擾了實驗中OGP最佳藥物濃度的選擇。
針對血清中含有的部分生長因子，有研究者[10]在低糖低血清條件下添加EGF，發現可促使MSCs體外擴增，認為EGF體外刺激MSCs增殖與其是酪氨酸激酶生長因子的主要受體有關。bFGF對MSCs的擴增無明顯作用，但能改變MSCs的形態與克隆集落生成能力，在添加培養MSCs的生長因子時需引起注意[10]。血清中的PDGF是由2條多肽鏈通過二硫鍵連接而成的同型或異型二聚體，能刺激多種細胞如成骨細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等的分裂與增殖。PDGF可誘導c-jun基因的轉錄而影響增殖細胞核抗原的表達，從而刺激MSCs增殖[16]。IGF-1是含有70個氨基酸殘基的單鏈堿性多肽，已有研究證實IGF-1在分化早期階段主要激活MEK-ERK信號通路，通過劑量依賴方式誘導轉錄輔激活蛋白PDZ結合基序的表達，來促進大鼠BMSCs向成骨細胞分化，從而增加BMSCs體外培養時ALP活性和骨鈣素沉積的數量[17]。Binder等[18]研究也認為，10%的血清濃度對體外培養的細胞不是準確的生理環境，高水平血清對細胞增殖分化有影響。結合本研究MTT及ALP活性檢測結果，提示10%FBS濃度會影響BMSCs的增殖分化，而8%FBS濃度能夠保證BMSCs的持續生長，并且有利于對OGP最佳藥物濃度的選擇。
綜上述，本研究通過檢測對不同血清濃度培養條件下施加不同濃度的OGP誘導BMSCs增殖分化的情況，發現8%FBS的培養條件有利于檢測OGP對BMSCs增殖和分化的影響，為優化BMSCs的體外培養條件奠定了實驗基礎，也為深入探索OGP促進BMSCs增殖和分化的作用機制提供了參考。
