引用本文： 王璽, 王勝, 肖玉周. 臍血間充質干細胞誘導分化為類雪旺細胞修復大鼠坐骨神經損傷的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(2): 213-220. doi: 10.7507/1002-1892.20150046 復制
隨著工業及交通運輸業的發展，工傷及交通事故傷所致周圍神經損傷成為創傷骨科常見疾病。當神經缺損長度超過2 cm或達到缺損神經直徑4倍以上時，需行神經移植修復 [1]。自體神經移植仍是目前修復周圍神經缺損的“金標準”[2]，但存在供體來源有限、殘留供區感覺功能障礙和增加供區創傷的缺點[3]。組織工程神經的發展為長節段神經缺損修復帶來了新希望。雪旺細胞（Schwann cells，SCs）具有促進和引導軸突再生功能，是組織工程神經構建常用種子細胞。但自體SCs為終末期細胞，存在體外培養困難等缺陷；同種異體SCs移植后又會引起強烈排斥反應。人臍血間充質干細胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）是一種具有多向分化潛能的干細胞，本實驗采用hUCBMSCs作為種子細胞構建組織工程神經，修復大鼠15 mm坐骨神經缺損，了解其對神經損傷修復的作用，為hUCBMSCs修復周圍神經缺損提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級3月齡雄性SD大鼠45只，體重200～ 250 g，由蚌埠醫學院動物中心提供。
臍帶血來源：無菌條件下收集蚌埠醫學院第一附屬醫院產科足月剖腹產或自然分娩新生兒臍帶血，均征得產婦及家屬同意。產婦體健，無傳染性疾病及妊娠并發癥，胎兒無先天性疾病。
人MSCs擴增試劑盒Mesencult? （Stem Cell公司，加拿大）；人淋巴細胞分離液（密度1.077 g/ mL，天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；高分子量羥乙基淀粉（6%；Hespan公司，美國）；DMEM/F12培養基、FBS（HyClone公司，美國）；β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME；Amresco公司，美國）；Forskolin（上海碧云天生物技術有限公司）；維A酸（Vitamin A acid，RA；Sigma公司，美國）；重組人Heregulin（HRG）、重組人PDGF-BB、重組人bFGF、重組人NGF（Pepro Tech公司，美國）；兔抗人S100b即用型、小鼠抗人膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）即用型（福州邁新生物技術有限公司）；兔抗人S100b、兔抗人P75（北京博奧森生物技術有限公司）；小鼠抗人GFAP（上海碧云天生物技術有限公司）；水合氯醛（上海國藥集團化學試劑有限公司）。顯微手術器械及顯微縫合線（寧波市成和顯微器械廠）；CO2培養箱（Thermo Scientific公司，美國）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；BL-410生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；IPP6.0圖像分析系統（Media Cybernetics公司，美國）。
人MSCs擴增試劑盒Mesencult?、β-ME、Forskolin、RA、重組人PDGF-BB、重組人bFGF、重組人NGF、重組人HRG均參照文獻[4]進行配制。
1.2 hUCBMSCs分離培養及鑒定
無菌條件下，取臍帶血50～80 mL，人淋巴細胞分離液復合高分子量羥乙基淀粉分離hUCBMSCs，以（1.0～5.0）×107個/mL接種于含Mesencult?完全培養基（基礎培養基450 mL、MSCs生長添加劑50 mL）的T-25塑料培養瓶中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，隔天添加少許完全培養基，5～7 d首次換液，以后每3天換液1次，光鏡下觀察細胞形態變化。取第3代細胞重懸后流式細胞儀檢測鑒定。
1.3 hUCBMSCs定向誘導分化為類SCs及鑒定
取第3代hUCBMSCs，按照文獻[4]改良化學誘導聯合細胞因子方法誘導培養。首先用含0.25 mmol/L β-ME+10 ng/mL bFGF的DMEM/F12培養液誘導24 h，后更換為含10%FBS的完全培養基培養24 h，后更換為含35 ng/mL RA的DMEM/F12培養液培養24 h，后更換為含10%FBS的完全培養基培養24 h，最后換用含5 ng/mL PDGF-BB、10 ng/ mL bFGF、100 ng/mL NGF、200 ng/mL HRG及5 μmol/ L Forskolin的DMEM/F12培養液培養4 d，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。誘導結束后，取細胞爬片，分別添加目的蛋白一抗（抗S100b、GFAP、P75；1∶200），免疫細胞化學染色檢測神經膠質細胞標志物S100b、GFAP、P75表達。陽性細胞染色為棕色，鏡下取10個非重疊視野計數（×100），計算細胞陽性 率。
1.4 組織工程神經構建
按照文獻[5]方法，采用液氮反復凍融振蕩洗滌法制備去細胞神經基膜管。取15只SD大鼠，銳性切取雙側坐骨神經約2.0 cm，置于含無菌超純水的50 mL塑料離心管內，快速浸入-196℃液氮20 min，然后于37℃恒溫水浴震蕩箱內反復震蕩1 h；反復液氮凍融及水浴震蕩5次，制備去細胞神經基膜管，修剪至1.5 cm。取部分去細胞神經基膜管行HE染色及Laminin免疫組織化學染色觀察。
將誘導成功的類SCs調整為密度1×107個/mL的細胞懸液，玻璃筒不銹鋼針頭微量注射器吸取100 μL細胞懸液，多點注入去細胞神經基膜管支架內，支架隆起后，將支架置入含10%FBS的DMEM/F12培養基內，37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養7 d，構建組織工程神經。光鏡下觀察種子細胞分布情況。
1.5 周圍神經缺損修復動物實驗
另取30只SD大鼠，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，游離坐骨神經，銳性切取同側長約20 mm坐骨神經，待余下坐骨神經自然回縮后，形成長約15 mm坐骨神經缺損動物模型。根據修復方法不同，實驗分為A、B、C 3組（n=10）：A組神經缺損采用9-0縫合線將預先構建好的組織工程神經與坐骨神經斷端外膜牢固縫合；B組采用未復合類SCs的去細胞神經基膜管縫合；C組采用自體坐骨神經原位縫合。
1.5.1 大體觀察
術后觀察并記錄各組大鼠步態、切口愈合、患肢是否出現潰瘍及自噬等情況，并于坐骨神經功能指數（sciatic function index，SFI）測定后取材觀察修復神經質地、形態、光澤以及與周圍組織粘連情況。
1.5.2 SFI測定
參照沈江寧等[5]方法自制大鼠足印行走箱，根據Bain公式 [6]計算各組大鼠術后SFI。 SFI=0 為正常，-100 為神經完全損傷。所得數據繪制 SFI 曲線，并行統計學分析。
1.5.3 坐骨神經電生理檢測
術后8周，3組各取10只大鼠以水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，采用BL-410生物機能實驗系統，設置為刺激單脈沖，波寬0.05 ms，刺激強度Ⅳ，增益200倍，交流濾波50 Hz，行坐骨神經電生理檢測，記錄復合動作電位波幅及傳導速度。
1.5.4 腓腸肌濕重及恢復率檢測
術后8周，3組各取10只大鼠，電生理檢測完成后，分別切取大鼠實驗側與健側整塊腓腸肌，電子天平稱重，按以下公式計算大鼠腓腸肌濕重恢復率：（實驗側腓腸肌濕重 /健側腓腸肌濕重）×100%。
1.5.5 再生神經纖維組織學觀察
術后8周，3組各取10只大鼠，取修復神經中段，置于 10%中性甲醛固定，常規石蠟切片，行Masson染色，光鏡下觀察。每張切片取5個視野，采用IPP6.0圖像分析系統測定再生神經中段有髓神經纖維密度、直徑及髓鞘厚度和軸突直徑，對再生神經行形態學分析。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hUCBMSCs形態學觀察及表面標志鑒定
培養后2周，橢圓形細胞大量增殖，細胞形態向長梭形轉變。隨著培養時間延長，細胞生長至80%～90%融合，細胞胞體呈長梭形，排列較均一，形態類似成纖維樣細胞，與BMSCs相似，但體積較小。原代細胞仍混雜部分破骨樣細胞，第3代細胞幾乎無混雜細胞，為形態均一的成纖維樣細胞（圖 1）。流式細胞儀檢測結果示，hUCBMSCs高表達干細胞表面抗原CD73及黏附分子CD44，低表達或不表達造血干/祖細胞表面標志CD34，與BMSCs表面抗原標記一致（圖 2）。
圖1
hUCBMSCs形態學觀察（×40） ? 原代培養3 d ? 原代培養5 d ? 原代培養21 d ? 第3代細胞? ?圖 2 hUCBMSCs表面標志物鑒定 ? 低表達CD34及高表達CD44 ? 低表達CD34及高表達CD73? ?圖 3 誘導后細胞形態學觀察（×100） ? β-ME+bFGF誘導后（誘導后1 d） ? RA誘導后 （誘導后3 d） ? 誘導結束后（誘導后7 d）? ?圖 4 hUCBMSCs誘導結束后免疫細胞化學染色檢測神經膠質細胞標志物表達(×200) ? S100b ? GFAP ? P75
Figure1.
Morphological observation of hUCBMSCs (×40) ? Primary cells cultured for 3 days ? Primary cells cultured for 5 days ? Primary cells cultured for 21 days ? Cells in the 3rd generation? ? Fig. 2 Surface markers identification of hUCBMSCs ? Low expression of CD34 and high expression of CD44 ? Low expression of CD34 and high expression of CD73? ? Fig. 3 Morphological observation of the induced hUCBMSCs (×100) ? After inducted by β-mercaptoethanol+basic fibroblast growth factor (at 1 day after induction) ? After inducted by Vitamin A acid (at 3 days after induction) ? The end of induction (at 7 days after induction)? ? Fig. 4 Expression of glia cell specific markers after induction by immunohistochemistry staining (×200) ? S100b ? Glial fibrillary acidic protein ? P75
2.2 hUCBMSCs定向誘導分化為類SCs及鑒定
誘導結束后細胞呈細長梭形、三角形或出現突起，形態與SCs類似（圖 3）。誘導結束后細胞免疫細胞化學染色示神經膠質細胞標志物S100b、GFAP及P75表達呈陽性（圖 4）。S100b、GFAP及P75的細胞陽性率分別為 97.00%±1.63%、94.33%±2.05%和91.67%±1.70%。
2.3 組織工程神經構建
去細胞神經基膜管大體觀察呈乳白色，半透明狀，較正常神經質韌，且橫紋消失。HE染色可見神經支架殘留基底膜呈波浪狀縱形排列，形成管柱狀間隙。Laminin免疫組織化學染色觀察可見神經支架殘留基底膜之間較為空虛，呈棕灰色、管狀，細胞結構基本消失。去細胞神經基膜管與種子細胞共培養7 d，可見種子細胞在支架內均勻分布。見圖 5。
圖5
組織工程神經構建 去細胞神經基膜管大體觀察 ? 去細胞神經基膜管HE染色(×100) ? 去細胞神經基膜管Laminin免疫組織化學染色(×100） ? 去細胞神經基膜管與細胞共培養7 d，細胞分布較均勻(×100)? ?圖 6 術后8周大體觀察 從左至右依次示大鼠患肢不能站立、紅腫、潰瘍及自噬現象? ?圖 7 術后8周大鼠足趾張開程度 ? A組 ? B組 ? C組? ?圖 8 術后8周各組大鼠修復神經大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組? ?圖 10 術后8周各組大鼠再生神經纖維Masson染色 (×100) ? A組 ? B組 ? C組
Figure5.
Reconstruction of tissue engineered nerve ? The appearance of the acellular nerve basal membrane conduit HE staining of the acellular nerve basal membrane conduit (×100) ? Laminin immunohistochemical staining of the acellular nerve basal membrane conduit (×100) ? The cells co-cultured with acellular nerve basal membrane conduit for 7 days,showing well-distributed cells (×100)? ? Fig. 6 General observation at 8 weeks after operation Astasia,red swelling,ulcer,and autophagy were shown from left to right? ? Fig. 7 Opening degrees of the toe at 8 weeks after operation ? Group A ? Group B ? Group C? ? Fig. 8 General observation of the nerve in 3 groups at 8 weeks after operation ? Group A ? Group B ? Group C? ? Fig. 10 Masson staining observation of nerve fibers at 8 weeks after operation (×100) ? Group A ? Group B ? Group C
2.4 動物實驗相關檢測
2.4.1 大體觀察
實驗動物術后均存活，無感染及死亡發生。各組大鼠術后患肢均出現失神經表現，如患肢癱瘓、不能站立、拖行、各趾并攏不能張開。術后l～2周，大鼠患肢負重區出現不能支撐、不同程度紅腫、自噬及潰瘍（圖 6），其中A組3只、B組5 只、C組2只。A、C組大鼠患肢足部潰瘍術后3 周開始愈合，4～5周基本痊愈；B組大鼠術后4 周潰瘍開始愈合，5～6周基本痊愈。各組大鼠患肢踝關節均出現不同程度關節僵硬以及坐骨神經支配區肌肉萎縮。術后8周，各組大鼠患肢拖行及足趾張開程度均改善，A、C組較B組改善明顯。見圖 7。
術后8周，大體觀察示A組組織工程神經管管壁無壞死及液化現象，周圍輕度粘連，質地較軟，基膜管周圍布滿血管網，神經吻合處連續性較好，但輕度膨大；B組去細胞神經基膜管在外觀上與A組相似；C組自體神經周圍粘連較A、B組輕，吻合口光滑，無明顯膨大，顏色與正常神經相似。見圖 8。
2.4.2 SFI
檢測 各組大鼠術后1周因手術切口未愈合，且步態不穩，足跡不清，無法準確測量SFI；術后2周，切口已基本愈合，步態稍好轉，故分別于術后2、4、6、8周計算各組大鼠術后SFI，并繪制SFI曲線（圖 9）。各組大鼠術后SFI隨時間延長呈逐漸降低趨勢，其中C組SFI 恢復優于A、B組，A組優于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
圖9
各組術后SFI曲線
Figure9.
SFI curve at each time point after operation in 3 groups
表1
各組大鼠術后各時間點SFI檢測（n=10，x±s）
Table1.
Changes of SFI in each group after operation（n=10，x±s）
2.4.3 坐骨神經電生理檢測
術后8周，刺激坐骨神經近端吻合口，各組大鼠遠端吻合口處均可檢測到神經復合動作電位，波幅及傳導速度C組均優于A、B組，A組優于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
術后8周各組大鼠坐骨神經電生理檢測（n=10，x±s）
Table2.
Detection of electrophysiology in each group at 8 weeks after operation（n=10，x±s）
2.4.4 腓腸肌濕重及恢復率檢測
術后8周各組大鼠實驗側小腿腓腸肌與健側相比均發生不同程度萎縮。實驗側腓腸肌濕重及濕重恢復率C組優于A、B組，A組優于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
術后8周各組大鼠腓腸肌濕重及恢復率比較（n=10，x±s）
Table3.
Wet weight and recovery rate of gastrocnemius in 3 groups at 8 weeks after operation（n=10，x±s）
2.4.5 再生神經纖維組織學觀察
Masson染色后髓鞘被染成淡紅色輪狀，中間深染點狀為軸突，神經外膜及周圍結締組織被染成藍綠色。A組可見大量再生神經纖維，有髓神經纖維排列較為整齊、致密，纖維直徑相似。A組再生神經纖維數量明顯多于B組，但髓鞘厚度以及排列規律性不及C組，見圖 10。C組有髓神經纖維密度、直徑及髓鞘厚度和軸突直徑均明顯多于A、B組，A組多于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 4。
表4
術后8周各組神經有髓神經纖維密度、直徑及髓鞘厚度、軸突直徑檢測（n=10，x±s）
Table4.
The density and diameter of medullated fibers,thickness of myelinated axon,and axon diameter of each group（n=10，x±s）
3 討論
3.1 組織工程神經種子細胞
周圍神經缺損修復已成為國內外學者亟待解決的難題之一，組織工程的發展為周圍神經缺損修復帶來了新希望。SCs作為神經損傷修復的主要功能細胞，在組織工程神經構建中處于核心地位。然而，自體SCs為終末期細胞，存在增殖及活性差、體外分離培養困難，來源缺乏需額外增加損傷等缺點，限制了其臨床廣泛使用[7]。而同種異體SCs移植后會被受體機體強烈排斥，在體內難以存活[8]。因此，尋找一種合適的種子細胞來源成為組織工程神經的主要研究方向。hUCBMSCs具有自我更新和多向分化潛能[9]，與其他來源MSCs相比，具有來源豐富、易于采集和運輸、移植后無明顯排斥反應、無倫理問題等諸多優點[10]，且不存在BMSCs含量和多向分化潛能隨骨髓捐贈者年齡增加而遞減的缺陷[11]。
本實驗中，我們采用hUCBMSCs作為種子細胞，應用改良化學誘導法并聯合細胞因子，成功誘導為類SCs，經過免疫細胞化學染色檢測，其表達膠質細胞表面標記物S100b、GFAP、P75，具有一定的SCs生理學功能。
3.2 神經支架材料
支架材料是組織工程神經的重要組成部分。同種異體神經仍是支架材料的主要來源，但細胞介導的免疫排斥反應是同種異體神經移植面臨的主要問題[12]，多數學者認為活性SCs是同種異體神經移植的主要抗原成分[13]，而同種異體神經中膠原及基底膜所引起的排斥反應小[14]，且脫細胞神經基質不會產生全身及局部排斥反應，也無過敏、深部感染或肝腎毒性等副作用[15-16]。脫細胞處理后的神經支架具備促進神經再生的天然三維結構及細胞外基質[17]，具有良好的應用前景。因此，我們選擇脫細胞神經作為支架材料。支架制備的關鍵在于如何去除細胞成分并保持神經基膜管的完整性[18]。考慮到化學萃取法可能殘留部分化學試劑，對種子細胞及機體存在毒副作用，我們采用寧仁德等[19]的液氮反復凍融振蕩洗滌法制備去細胞神經基膜管作為神經支架。經HE染色和Laminin染色顯示，該支架基膜完整、管道通暢，基本無殘留細胞結構，且無化學試劑殘留，符合組織工程神經支架材料要求。
3.3 實驗結果分析
動物實驗中，hUCBMSCs來源的類SCs接種至去細胞神經基膜管后表現出較好的神經損傷修復效果。相對于單純去細胞神經基膜管組，接種了hUCBMSCs的去細胞神經基膜管的神經纖維密度及直徑、髓鞘厚度和軸突直徑均有所增加，提示其能夠在細胞水平促進神經損傷修復；同時神經移植物傳導速度及動作電位波幅增大，說明其能改善神經電生理功能；小腿腓腸肌濕重及濕重恢復率均有所提高，一定程度反映神經損傷后hUCBMSCs能夠促進支配肌肉功能改善。
綜上述，hUCBMSCs來源的類SCs對周圍神經損傷修復作用明確，采用hUCBMSCs構建組織工程神經可行。
隨著工業及交通運輸業的發展，工傷及交通事故傷所致周圍神經損傷成為創傷骨科常見疾病。當神經缺損長度超過2 cm或達到缺損神經直徑4倍以上時，需行神經移植修復 [1]。自體神經移植仍是目前修復周圍神經缺損的“金標準”[2]，但存在供體來源有限、殘留供區感覺功能障礙和增加供區創傷的缺點[3]。組織工程神經的發展為長節段神經缺損修復帶來了新希望。雪旺細胞（Schwann cells，SCs）具有促進和引導軸突再生功能，是組織工程神經構建常用種子細胞。但自體SCs為終末期細胞，存在體外培養困難等缺陷；同種異體SCs移植后又會引起強烈排斥反應。人臍血間充質干細胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCBMSCs）是一種具有多向分化潛能的干細胞，本實驗采用hUCBMSCs作為種子細胞構建組織工程神經，修復大鼠15 mm坐骨神經缺損，了解其對神經損傷修復的作用，為hUCBMSCs修復周圍神經缺損提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級3月齡雄性SD大鼠45只，體重200～ 250 g，由蚌埠醫學院動物中心提供。
臍帶血來源：無菌條件下收集蚌埠醫學院第一附屬醫院產科足月剖腹產或自然分娩新生兒臍帶血，均征得產婦及家屬同意。產婦體健，無傳染性疾病及妊娠并發癥，胎兒無先天性疾病。
人MSCs擴增試劑盒Mesencult? （Stem Cell公司，加拿大）；人淋巴細胞分離液（密度1.077 g/ mL，天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；高分子量羥乙基淀粉（6%；Hespan公司，美國）；DMEM/F12培養基、FBS（HyClone公司，美國）；β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME；Amresco公司，美國）；Forskolin（上海碧云天生物技術有限公司）；維A酸（Vitamin A acid，RA；Sigma公司，美國）；重組人Heregulin（HRG）、重組人PDGF-BB、重組人bFGF、重組人NGF（Pepro Tech公司，美國）；兔抗人S100b即用型、小鼠抗人膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）即用型（福州邁新生物技術有限公司）；兔抗人S100b、兔抗人P75（北京博奧森生物技術有限公司）；小鼠抗人GFAP（上海碧云天生物技術有限公司）；水合氯醛（上海國藥集團化學試劑有限公司）。顯微手術器械及顯微縫合線（寧波市成和顯微器械廠）；CO2培養箱（Thermo Scientific公司，美國）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；BL-410生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；IPP6.0圖像分析系統（Media Cybernetics公司，美國）。
人MSCs擴增試劑盒Mesencult?、β-ME、Forskolin、RA、重組人PDGF-BB、重組人bFGF、重組人NGF、重組人HRG均參照文獻[4]進行配制。
1.2 hUCBMSCs分離培養及鑒定
無菌條件下，取臍帶血50～80 mL，人淋巴細胞分離液復合高分子量羥乙基淀粉分離hUCBMSCs，以（1.0～5.0）×107個/mL接種于含Mesencult?完全培養基（基礎培養基450 mL、MSCs生長添加劑50 mL）的T-25塑料培養瓶中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，隔天添加少許完全培養基，5～7 d首次換液，以后每3天換液1次，光鏡下觀察細胞形態變化。取第3代細胞重懸后流式細胞儀檢測鑒定。
1.3 hUCBMSCs定向誘導分化為類SCs及鑒定
取第3代hUCBMSCs，按照文獻[4]改良化學誘導聯合細胞因子方法誘導培養。首先用含0.25 mmol/L β-ME+10 ng/mL bFGF的DMEM/F12培養液誘導24 h，后更換為含10%FBS的完全培養基培養24 h，后更換為含35 ng/mL RA的DMEM/F12培養液培養24 h，后更換為含10%FBS的完全培養基培養24 h，最后換用含5 ng/mL PDGF-BB、10 ng/ mL bFGF、100 ng/mL NGF、200 ng/mL HRG及5 μmol/ L Forskolin的DMEM/F12培養液培養4 d，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。誘導結束后，取細胞爬片，分別添加目的蛋白一抗（抗S100b、GFAP、P75；1∶200），免疫細胞化學染色檢測神經膠質細胞標志物S100b、GFAP、P75表達。陽性細胞染色為棕色，鏡下取10個非重疊視野計數（×100），計算細胞陽性 率。
1.4 組織工程神經構建
按照文獻[5]方法，采用液氮反復凍融振蕩洗滌法制備去細胞神經基膜管。取15只SD大鼠，銳性切取雙側坐骨神經約2.0 cm，置于含無菌超純水的50 mL塑料離心管內，快速浸入-196℃液氮20 min，然后于37℃恒溫水浴震蕩箱內反復震蕩1 h；反復液氮凍融及水浴震蕩5次，制備去細胞神經基膜管，修剪至1.5 cm。取部分去細胞神經基膜管行HE染色及Laminin免疫組織化學染色觀察。
將誘導成功的類SCs調整為密度1×107個/mL的細胞懸液，玻璃筒不銹鋼針頭微量注射器吸取100 μL細胞懸液，多點注入去細胞神經基膜管支架內，支架隆起后，將支架置入含10%FBS的DMEM/F12培養基內，37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養7 d，構建組織工程神經。光鏡下觀察種子細胞分布情況。
1.5 周圍神經缺損修復動物實驗
另取30只SD大鼠，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，游離坐骨神經，銳性切取同側長約20 mm坐骨神經，待余下坐骨神經自然回縮后，形成長約15 mm坐骨神經缺損動物模型。根據修復方法不同，實驗分為A、B、C 3組（n=10）：A組神經缺損采用9-0縫合線將預先構建好的組織工程神經與坐骨神經斷端外膜牢固縫合；B組采用未復合類SCs的去細胞神經基膜管縫合；C組采用自體坐骨神經原位縫合。
1.5.1 大體觀察
術后觀察并記錄各組大鼠步態、切口愈合、患肢是否出現潰瘍及自噬等情況，并于坐骨神經功能指數（sciatic function index，SFI）測定后取材觀察修復神經質地、形態、光澤以及與周圍組織粘連情況。
1.5.2 SFI測定
參照沈江寧等[5]方法自制大鼠足印行走箱，根據Bain公式 [6]計算各組大鼠術后SFI。 SFI=0 為正常，-100 為神經完全損傷。所得數據繪制 SFI 曲線，并行統計學分析。
1.5.3 坐骨神經電生理檢測
術后8周，3組各取10只大鼠以水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，采用BL-410生物機能實驗系統，設置為刺激單脈沖，波寬0.05 ms，刺激強度Ⅳ，增益200倍，交流濾波50 Hz，行坐骨神經電生理檢測，記錄復合動作電位波幅及傳導速度。
1.5.4 腓腸肌濕重及恢復率檢測
術后8周，3組各取10只大鼠，電生理檢測完成后，分別切取大鼠實驗側與健側整塊腓腸肌，電子天平稱重，按以下公式計算大鼠腓腸肌濕重恢復率：（實驗側腓腸肌濕重 /健側腓腸肌濕重）×100%。
1.5.5 再生神經纖維組織學觀察
術后8周，3組各取10只大鼠，取修復神經中段，置于 10%中性甲醛固定，常規石蠟切片，行Masson染色，光鏡下觀察。每張切片取5個視野，采用IPP6.0圖像分析系統測定再生神經中段有髓神經纖維密度、直徑及髓鞘厚度和軸突直徑，對再生神經行形態學分析。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hUCBMSCs形態學觀察及表面標志鑒定
培養后2周，橢圓形細胞大量增殖，細胞形態向長梭形轉變。隨著培養時間延長，細胞生長至80%～90%融合，細胞胞體呈長梭形，排列較均一，形態類似成纖維樣細胞，與BMSCs相似，但體積較小。原代細胞仍混雜部分破骨樣細胞，第3代細胞幾乎無混雜細胞，為形態均一的成纖維樣細胞（圖 1）。流式細胞儀檢測結果示，hUCBMSCs高表達干細胞表面抗原CD73及黏附分子CD44，低表達或不表達造血干/祖細胞表面標志CD34，與BMSCs表面抗原標記一致（圖 2）。
圖1
hUCBMSCs形態學觀察（×40） ? 原代培養3 d ? 原代培養5 d ? 原代培養21 d ? 第3代細胞? ?圖 2 hUCBMSCs表面標志物鑒定 ? 低表達CD34及高表達CD44 ? 低表達CD34及高表達CD73? ?圖 3 誘導后細胞形態學觀察（×100） ? β-ME+bFGF誘導后（誘導后1 d） ? RA誘導后 （誘導后3 d） ? 誘導結束后（誘導后7 d）? ?圖 4 hUCBMSCs誘導結束后免疫細胞化學染色檢測神經膠質細胞標志物表達(×200) ? S100b ? GFAP ? P75
Figure1.
Morphological observation of hUCBMSCs (×40) ? Primary cells cultured for 3 days ? Primary cells cultured for 5 days ? Primary cells cultured for 21 days ? Cells in the 3rd generation? ? Fig. 2 Surface markers identification of hUCBMSCs ? Low expression of CD34 and high expression of CD44 ? Low expression of CD34 and high expression of CD73? ? Fig. 3 Morphological observation of the induced hUCBMSCs (×100) ? After inducted by β-mercaptoethanol+basic fibroblast growth factor (at 1 day after induction) ? After inducted by Vitamin A acid (at 3 days after induction) ? The end of induction (at 7 days after induction)? ? Fig. 4 Expression of glia cell specific markers after induction by immunohistochemistry staining (×200) ? S100b ? Glial fibrillary acidic protein ? P75
2.2 hUCBMSCs定向誘導分化為類SCs及鑒定
誘導結束后細胞呈細長梭形、三角形或出現突起，形態與SCs類似（圖 3）。誘導結束后細胞免疫細胞化學染色示神經膠質細胞標志物S100b、GFAP及P75表達呈陽性（圖 4）。S100b、GFAP及P75的細胞陽性率分別為 97.00%±1.63%、94.33%±2.05%和91.67%±1.70%。
2.3 組織工程神經構建
去細胞神經基膜管大體觀察呈乳白色，半透明狀，較正常神經質韌，且橫紋消失。HE染色可見神經支架殘留基底膜呈波浪狀縱形排列，形成管柱狀間隙。Laminin免疫組織化學染色觀察可見神經支架殘留基底膜之間較為空虛，呈棕灰色、管狀，細胞結構基本消失。去細胞神經基膜管與種子細胞共培養7 d，可見種子細胞在支架內均勻分布。見圖 5。
圖5
組織工程神經構建 去細胞神經基膜管大體觀察 ? 去細胞神經基膜管HE染色(×100) ? 去細胞神經基膜管Laminin免疫組織化學染色(×100） ? 去細胞神經基膜管與細胞共培養7 d，細胞分布較均勻(×100)? ?圖 6 術后8周大體觀察 從左至右依次示大鼠患肢不能站立、紅腫、潰瘍及自噬現象? ?圖 7 術后8周大鼠足趾張開程度 ? A組 ? B組 ? C組? ?圖 8 術后8周各組大鼠修復神經大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組? ?圖 10 術后8周各組大鼠再生神經纖維Masson染色 (×100) ? A組 ? B組 ? C組
Figure5.
Reconstruction of tissue engineered nerve ? The appearance of the acellular nerve basal membrane conduit HE staining of the acellular nerve basal membrane conduit (×100) ? Laminin immunohistochemical staining of the acellular nerve basal membrane conduit (×100) ? The cells co-cultured with acellular nerve basal membrane conduit for 7 days,showing well-distributed cells (×100)? ? Fig. 6 General observation at 8 weeks after operation Astasia,red swelling,ulcer,and autophagy were shown from left to right? ? Fig. 7 Opening degrees of the toe at 8 weeks after operation ? Group A ? Group B ? Group C? ? Fig. 8 General observation of the nerve in 3 groups at 8 weeks after operation ? Group A ? Group B ? Group C? ? Fig. 10 Masson staining observation of nerve fibers at 8 weeks after operation (×100) ? Group A ? Group B ? Group C
2.4 動物實驗相關檢測
2.4.1 大體觀察
實驗動物術后均存活，無感染及死亡發生。各組大鼠術后患肢均出現失神經表現，如患肢癱瘓、不能站立、拖行、各趾并攏不能張開。術后l～2周，大鼠患肢負重區出現不能支撐、不同程度紅腫、自噬及潰瘍（圖 6），其中A組3只、B組5 只、C組2只。A、C組大鼠患肢足部潰瘍術后3 周開始愈合，4～5周基本痊愈；B組大鼠術后4 周潰瘍開始愈合，5～6周基本痊愈。各組大鼠患肢踝關節均出現不同程度關節僵硬以及坐骨神經支配區肌肉萎縮。術后8周，各組大鼠患肢拖行及足趾張開程度均改善，A、C組較B組改善明顯。見圖 7。
術后8周，大體觀察示A組組織工程神經管管壁無壞死及液化現象，周圍輕度粘連，質地較軟，基膜管周圍布滿血管網，神經吻合處連續性較好，但輕度膨大；B組去細胞神經基膜管在外觀上與A組相似；C組自體神經周圍粘連較A、B組輕，吻合口光滑，無明顯膨大，顏色與正常神經相似。見圖 8。
2.4.2 SFI
檢測 各組大鼠術后1周因手術切口未愈合，且步態不穩，足跡不清，無法準確測量SFI；術后2周，切口已基本愈合，步態稍好轉，故分別于術后2、4、6、8周計算各組大鼠術后SFI，并繪制SFI曲線（圖 9）。各組大鼠術后SFI隨時間延長呈逐漸降低趨勢，其中C組SFI 恢復優于A、B組，A組優于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
圖9
各組術后SFI曲線
Figure9.
SFI curve at each time point after operation in 3 groups
表1
各組大鼠術后各時間點SFI檢測（n=10，x±s）
Table1.
Changes of SFI in each group after operation（n=10，x±s）
2.4.3 坐骨神經電生理檢測
術后8周，刺激坐骨神經近端吻合口，各組大鼠遠端吻合口處均可檢測到神經復合動作電位，波幅及傳導速度C組均優于A、B組，A組優于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
術后8周各組大鼠坐骨神經電生理檢測（n=10，x±s）
Table2.
Detection of electrophysiology in each group at 8 weeks after operation（n=10，x±s）
2.4.4 腓腸肌濕重及恢復率檢測
術后8周各組大鼠實驗側小腿腓腸肌與健側相比均發生不同程度萎縮。實驗側腓腸肌濕重及濕重恢復率C組優于A、B組，A組優于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
術后8周各組大鼠腓腸肌濕重及恢復率比較（n=10，x±s）
Table3.
Wet weight and recovery rate of gastrocnemius in 3 groups at 8 weeks after operation（n=10，x±s）
2.4.5 再生神經纖維組織學觀察
Masson染色后髓鞘被染成淡紅色輪狀，中間深染點狀為軸突，神經外膜及周圍結締組織被染成藍綠色。A組可見大量再生神經纖維，有髓神經纖維排列較為整齊、致密，纖維直徑相似。A組再生神經纖維數量明顯多于B組，但髓鞘厚度以及排列規律性不及C組，見圖 10。C組有髓神經纖維密度、直徑及髓鞘厚度和軸突直徑均明顯多于A、B組，A組多于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 4。
表4
術后8周各組神經有髓神經纖維密度、直徑及髓鞘厚度、軸突直徑檢測（n=10，x±s）
Table4.
The density and diameter of medullated fibers,thickness of myelinated axon,and axon diameter of each group（n=10，x±s）
3 討論
3.1 組織工程神經種子細胞
周圍神經缺損修復已成為國內外學者亟待解決的難題之一，組織工程的發展為周圍神經缺損修復帶來了新希望。SCs作為神經損傷修復的主要功能細胞，在組織工程神經構建中處于核心地位。然而，自體SCs為終末期細胞，存在增殖及活性差、體外分離培養困難，來源缺乏需額外增加損傷等缺點，限制了其臨床廣泛使用[7]。而同種異體SCs移植后會被受體機體強烈排斥，在體內難以存活[8]。因此，尋找一種合適的種子細胞來源成為組織工程神經的主要研究方向。hUCBMSCs具有自我更新和多向分化潛能[9]，與其他來源MSCs相比，具有來源豐富、易于采集和運輸、移植后無明顯排斥反應、無倫理問題等諸多優點[10]，且不存在BMSCs含量和多向分化潛能隨骨髓捐贈者年齡增加而遞減的缺陷[11]。
本實驗中，我們采用hUCBMSCs作為種子細胞，應用改良化學誘導法并聯合細胞因子，成功誘導為類SCs，經過免疫細胞化學染色檢測，其表達膠質細胞表面標記物S100b、GFAP、P75，具有一定的SCs生理學功能。
3.2 神經支架材料
支架材料是組織工程神經的重要組成部分。同種異體神經仍是支架材料的主要來源，但細胞介導的免疫排斥反應是同種異體神經移植面臨的主要問題[12]，多數學者認為活性SCs是同種異體神經移植的主要抗原成分[13]，而同種異體神經中膠原及基底膜所引起的排斥反應小[14]，且脫細胞神經基質不會產生全身及局部排斥反應，也無過敏、深部感染或肝腎毒性等副作用[15-16]。脫細胞處理后的神經支架具備促進神經再生的天然三維結構及細胞外基質[17]，具有良好的應用前景。因此，我們選擇脫細胞神經作為支架材料。支架制備的關鍵在于如何去除細胞成分并保持神經基膜管的完整性[18]。考慮到化學萃取法可能殘留部分化學試劑，對種子細胞及機體存在毒副作用，我們采用寧仁德等[19]的液氮反復凍融振蕩洗滌法制備去細胞神經基膜管作為神經支架。經HE染色和Laminin染色顯示，該支架基膜完整、管道通暢，基本無殘留細胞結構，且無化學試劑殘留，符合組織工程神經支架材料要求。
3.3 實驗結果分析
動物實驗中，hUCBMSCs來源的類SCs接種至去細胞神經基膜管后表現出較好的神經損傷修復效果。相對于單純去細胞神經基膜管組，接種了hUCBMSCs的去細胞神經基膜管的神經纖維密度及直徑、髓鞘厚度和軸突直徑均有所增加，提示其能夠在細胞水平促進神經損傷修復；同時神經移植物傳導速度及動作電位波幅增大，說明其能改善神經電生理功能；小腿腓腸肌濕重及濕重恢復率均有所提高，一定程度反映神經損傷后hUCBMSCs能夠促進支配肌肉功能改善。
綜上述，hUCBMSCs來源的類SCs對周圍神經損傷修復作用明確，采用hUCBMSCs構建組織工程神經可行。
