引用本文： 張振輝, 李東, 孫凱, 李瑞欣, 朱祥, 陳旭義, 徐云強. 與雪旺細胞共培養誘導脂肪來源干細胞向神經元樣細胞分化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(1): 97-102. doi: 10.7507/1002-1892.20150020 復制
神經損傷修復是醫學領域難題，組織工程技術為其提供了新思路，如何大量獲取神經元成為組織工程技術治療神經系統疾病的關鍵[1]。Woodbury等[2]首先利用β-巰基乙醇、DMSO和丁基羥基苯甲醚作為神經誘導培養基誘導BMSCs分化為神經元樣細胞，但分化后的細胞不夠穩定，約6 d后開始死亡。Zurita等[3]進行了SCs和BMSCs共培養實驗，結果顯示BMSCs能夠向神經元樣細胞分化。但BMSCs獲取有創且量有限、培養分化所需時間較長。
脂肪組織與骨髓一樣，來源于胚胎中胚層，但取材簡便、來源廣泛且可在體外穩定增殖傳代，同時也避免了胚胎干細胞所涉及的倫理學問題，受到廣泛關注[4-5]。有學者提出脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的概念，并在之后的研究中證明其具有多向分化潛能，可向肌肉、骨、軟骨和脂肪細胞分化[6-7]。ADSCs在一些生長因子（如EGF、bFGF、BDNF、GDNF等）作用下能誘導分化為神經元樣細胞[8]，而SCs可分泌多種神經營養因子，如FGF、BDNF、GDNF、神經營養因子3[9]等，將兩者共培養，一方面SCs可為ADSCs向神經元樣細胞分化提供誘導微環境，同時也避免了外源性生長因子的使用[10-11]。本研究將SCs與ADSCs非接觸共培養，旨在驗證SCs對ADSCs向神經元樣細胞分化的誘導效應。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生1～2 d SD大鼠5只，體質量5～10 g，雌雄不拘；成年雄性SD大鼠5只，體質量250～300 g；均由軍事醫學科學院動物中心提供。DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；0.1%Ⅰ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）及抗CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105抗體（BD公司，美國）；兔抗牛S-100蛋白抗體、微管相關蛋白（microtubule-associated protein 2，MAP2）、神經元核蛋白（neur onal nuclei protein，NeuN）抗體（Abcam公司，沙特）。Transwell培養板（Corning公司，美國）；倒置相差顯微鏡（深圳市博視達光學儀器有限公司）；DWI4000B熒光顯微鏡（Leica公司，德國）。
1.2 大鼠SCs及ADSCs分離培養及鑒定
1.2.1 SCs分離培養及鑒定
取新生SD大鼠5只，乙醚吸入麻醉，75%乙醇浸泡消毒10 min，無菌條件下取雙側坐骨神經，置于D-Hanks液，于解剖顯微鏡下剝除其神經外膜，剪碎呈糊狀后移至離心管，加入體積比（V/V）為1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶混合液2 mL，置入37℃恒溫水浴搖床約40 min；加入1 mL含10%FBS的DMEM終止消化；以離心半徑6 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加入含10%FBS的DMEM反復吹打至細胞懸液；兩次差速貼壁30 min，去除成纖維細胞。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。取原代SCs，調整細胞密度為5×105個/mL，接種至預先涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，置于37℃、5%CO2培養箱內培養72 h，行S-100免疫熒光染色鑒定。
1.2.2 ADSCs分離培養及鑒定
取成年SD大鼠5 只，乙醚吸入麻醉后，在超凈臺內取腹股溝和腹膜后脂肪組織，剔除血管及軟組織，DMEM沖洗3遍，剪碎，加等體積0.1%Ⅰ型膠原酶，置入37℃恒溫水浴搖床下30 min。加少量含10%FBS的DMEM終止消化，以離心半徑6 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清及懸浮油性脂肪組織。用含10%FBS的DMEM培養基重懸細胞，接種于培養瓶，于37℃、5%CO2培養箱內培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化，待細胞生長鋪滿瓶底約80%時傳代。取第3 代ADSCs行流式細胞儀分析，觀察其表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105表達情況。
1.3 實驗方法
1.3.1 實驗分組
實驗分為實驗組和對照組，實驗組：取原代SCs與第3代ADSCs置于含20%FBS的DMEM中，兩種細胞按2∶1比例植于Transwell共培養系統，其中SCs以6×104個/cm2密度接種于Transwell上室，ADSCs以3×104個/cm2接種于下室，上、下室培養液相通，建立SCs與ADSCs非接觸共培養體系。于37℃、5%CO2培養箱內培養，每隔72 h換液，共培養14 d。對照組：單純培養第3代ADSCs，培養14 d。
1.3.2 觀測指標
① 培養后每天倒置相差顯微鏡下觀察兩組細胞形態變化。② 培養14 d，取兩組細胞采用流式細胞儀檢測NSE表達；行免疫熒光染色，檢測MAP2、GFAP、NeuN神經特異標志物。取兩組細胞懸液滴加于放有多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔板中，4 h后取出蓋玻片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100處理30 min，PBS洗3次，正常山羊血清封閉30 min，加入MAP2、GFAP、NeuN、NSE一抗，4℃冰箱過夜；PBS洗3次，加入二抗，37℃孵育30 min。水溶性封片劑封片，免疫熒光顯微鏡下觀察。鏡下每張切片取5個非重疊高倍（×200）視野計數總細胞和陽性細胞，計算陽性細胞率。特異熒光染色與DAPI染色擬合后重合的細胞即為陽性細胞。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.01。
2 結果
2.1 大鼠SCs及ADSCs培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，原代SCs培養3 d后呈長梭形，胞體狹窄，胞核略透光且邊緣有明亮光暈。胞體伸出細長突起，多為單極或雙極，三極少見，呈“端對端”、“極對極”排列（圖 1 a）。細胞S-100免疫熒光染色為陽性（圖 1 b～d）。
倒置相差顯微鏡下觀察，ADSCs原代接種4 h后即貼壁，細胞形態以梭形及橢圓形多見，分布不均，部分呈集落式增殖，5～8 d即可鋪滿瓶底。隨著傳代次數增多，細胞形態趨于一致，呈長梭型，漩渦狀排列（圖 2）；每代細胞之間無明顯形態學差異。流式細胞儀分析示，第3代細胞高表達CD29（91.81%）、CD90（88.22%）、CD73（99.78%）和CD105（98.32%），低表達CD34（0.20%）和CD45（0.72%）。見圖 3。
圖1
原代SCs培養3 d后觀察 ? 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ?～? S-100免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400）? ?2.2 共培養細胞觀察
2.2.1 形態學觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，實驗組共培養1 d原呈梭形的ADSCs以胞核為中心收縮，胞體呈錐形、三角形或不規則形，體積變小并伸出許多短而細的指狀突起；3 d后大部分細胞胞體呈球形改變，胞體折光性增強，胞體伸出多個長而粗的突起；7 d時多數細胞顯示出神經細胞的形態學特征；7～14 d 誘導生成的神經元樣細胞穩定增殖且能保持其形態，同時SCs細胞體積增大、周圍突起增多且變粗大。對照組ADSCs培養期間細胞形態無顯著變化。見圖 4。
2.2.2 流式細胞儀檢測
實驗組共培養14 d可見神經細胞特異標志物NSE表達；對照組僅見少量表達。見圖 5。
2.2.3 免疫熒光染色觀察
培養14 d，免疫熒光染色示實驗組有大量MAP2、NeuN、GFAP陽性細胞，其陽性細胞率均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表 1、圖 6。
表1
培養后14 d，兩組MAP2、NSE、NeuN以及GFAP陽性細胞率比較（n=5，%，
圖6
共培養14 d兩組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200） ? 實驗組MAP2 ? 對照組MAP2 ? 實驗組NeuN ? 對照組NeuN ? 實驗組GFAP ? 對照組GFAP
Figure6.
Immunohistochemical staining observation of 2 groups after co-cultured for14 days (Fluorescence microscope×200) ? MAP2 of experimental group ? MAP2 of control group ? NeuN of experimental group ? NeuN of control group ? GFAP of experimental group ? GFAP of control group
3 討論
神經損傷修復的難點在于神經元再生，隨著對干細胞研究的深入，以多能干細胞構建組織工程神經成為研究熱點[12]。MAP2和GFAP在未分化ADSCs中呈低水平表達，表明ADSCs有神經分化潛能[13]。研究表明ADSCs可在化學或生長因子誘導下分化為神經元樣細胞，Qian等[14]用β-巰基乙醇誘導ADSCs 24 h，然后加入丁羥茴醚、DMSO誘導7 d，結果顯示細胞MAP2表達率為2.3%，神經元特異性標志物β-tubulin表達率為47.3%。但此種方法誘導率低且DMSO細胞毒性較大，不利于細胞生長。Wrage等[15]通過加入VEGF和bFGF誘導AD SCs 2～3 d，然后加入吲哚美辛和異丁基-甲基黃嘌呤誘導48 h，免疫熒光染色結果顯示細胞表達神經元特異性標志物Nestin、β-tubulin和GFAP。但與BMSCs一樣，ADSCs經化學誘導雖然能在短時間內高效誘導分化為神經元樣細胞，但其誘導后的神經細胞形態不夠穩定且很快出現細胞死亡。因此有學者提出質疑，認為化學誘導的細胞形態變化是由應激所致細胞物理收縮形成，并非真正意義上的細胞分化[16-17]。同時，化學誘導本身存在細胞毒性，也不能滿足組織工程種子細胞來源條件。為此，陳盼盼等[18]利用生長因子分步誘導法誘導ADSCs向神經元樣細胞分化，第1步加入EGF、bFGF和B27誘導7 d，第2步加入NGF、BDNF和全反式維A酸誘導7 d，結果顯示大部分細胞均表達Nestin、MAP2和NeuN。這種方法誘導效率較高，且生長因子有助于刺激干細胞向神經元樣細胞分化，但是誘導方法復雜且花費大、耗時長。
本研究將SCs與ADSCs在Transwell共培養系統中共培養，探討SCs為ADSCs向神經元樣細胞分化提供誘導微環境的可行性。共培養系統通過中間的一張通透性聚碳酸酯膜，既實現了SCs與ADSCs非直接接觸，同時兩種細胞的分泌物能相互滲透。一方面，SCs分泌的EGF、bFGF、GDNF和BDNF等生長因子可為ADSCs誘導分化提供微環境，同時其分泌的細胞外基質也可構成類軸突髓鞘樣管狀結構，為分化的神經元樣細胞軸突延伸和生長提供隧道。另一方面，共培養也可模擬體內生長微環境，以觀察不同細胞相容性[10]。本研究中，共培養組與單純ADSCs培養相比，細胞生長情況相似[10]，無化學誘導時出現的細胞死亡現象。共培養1 d即可觀察到ADSCs向神經元樣細胞形態改變，胞體變小且有多個神經細胞樣突起；同時SCs也發生形態變化，細胞體積增大、周圍突起增多且變粗大。表明SCs分泌物能夠支持ADSCs生長，并誘導大多數ADSCs向神經元分化；ADSCs的增殖分化產物也能促進SCs生長[19]。
MAP2是一種熱穩定磷蛋白，屬于結構性微管相關蛋白家族，主要在中樞神經系統胞體和樹突表達[20]。NeuN是一種神經元核蛋白，被認為是脊椎動物神經元特異性標志物，神經元成熟的重要標志，廣泛應用于成熟神經元鑒定。GFAP是一種中間絲蛋白，主要存在于星形細胞內。免疫熒光染色結果顯示，實驗組共培養14 d后MAP2、NeuN染色均呈陽性，陽性細胞率顯著高于對照組，流式細胞儀檢測結果亦顯示NSE陽性細胞率顯著增高，提示共培養后細胞具有神經元特性。GFAP也呈陽性表達，說明SCs與ADSCs共培養后，在ADSCs分化為神經元樣細胞的同時，也有星形膠質細胞生成。
綜上述，與化學或生長因子誘導方法相比，SCs與ADSCs共培養更簡便、經濟、高效，有望為組織工程神經構建提供潛在種子細胞來源。但目前關于ADSCs誘導分化研究報道已較多，不同誘導方法的分化效率也不盡相同，且均未能證實分化后的神經元樣細胞是否具有電生理功能[21]。本研究也缺少電生理相關檢測，有待進一步深入研究。
神經損傷修復是醫學領域難題，組織工程技術為其提供了新思路，如何大量獲取神經元成為組織工程技術治療神經系統疾病的關鍵[1]。Woodbury等[2]首先利用β-巰基乙醇、DMSO和丁基羥基苯甲醚作為神經誘導培養基誘導BMSCs分化為神經元樣細胞，但分化后的細胞不夠穩定，約6 d后開始死亡。Zurita等[3]進行了SCs和BMSCs共培養實驗，結果顯示BMSCs能夠向神經元樣細胞分化。但BMSCs獲取有創且量有限、培養分化所需時間較長。
脂肪組織與骨髓一樣，來源于胚胎中胚層，但取材簡便、來源廣泛且可在體外穩定增殖傳代，同時也避免了胚胎干細胞所涉及的倫理學問題，受到廣泛關注[4-5]。有學者提出脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的概念，并在之后的研究中證明其具有多向分化潛能，可向肌肉、骨、軟骨和脂肪細胞分化[6-7]。ADSCs在一些生長因子（如EGF、bFGF、BDNF、GDNF等）作用下能誘導分化為神經元樣細胞[8]，而SCs可分泌多種神經營養因子，如FGF、BDNF、GDNF、神經營養因子3[9]等，將兩者共培養，一方面SCs可為ADSCs向神經元樣細胞分化提供誘導微環境，同時也避免了外源性生長因子的使用[10-11]。本研究將SCs與ADSCs非接觸共培養，旨在驗證SCs對ADSCs向神經元樣細胞分化的誘導效應。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生1～2 d SD大鼠5只，體質量5～10 g，雌雄不拘；成年雄性SD大鼠5只，體質量250～300 g；均由軍事醫學科學院動物中心提供。DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；0.1%Ⅰ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）及抗CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105抗體（BD公司，美國）；兔抗牛S-100蛋白抗體、微管相關蛋白（microtubule-associated protein 2，MAP2）、神經元核蛋白（neur onal nuclei protein，NeuN）抗體（Abcam公司，沙特）。Transwell培養板（Corning公司，美國）；倒置相差顯微鏡（深圳市博視達光學儀器有限公司）；DWI4000B熒光顯微鏡（Leica公司，德國）。
1.2 大鼠SCs及ADSCs分離培養及鑒定
1.2.1 SCs分離培養及鑒定
取新生SD大鼠5只，乙醚吸入麻醉，75%乙醇浸泡消毒10 min，無菌條件下取雙側坐骨神經，置于D-Hanks液，于解剖顯微鏡下剝除其神經外膜，剪碎呈糊狀后移至離心管，加入體積比（V/V）為1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶混合液2 mL，置入37℃恒溫水浴搖床約40 min；加入1 mL含10%FBS的DMEM終止消化；以離心半徑6 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加入含10%FBS的DMEM反復吹打至細胞懸液；兩次差速貼壁30 min，去除成纖維細胞。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。取原代SCs，調整細胞密度為5×105個/mL，接種至預先涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，置于37℃、5%CO2培養箱內培養72 h，行S-100免疫熒光染色鑒定。
1.2.2 ADSCs分離培養及鑒定
取成年SD大鼠5 只，乙醚吸入麻醉后，在超凈臺內取腹股溝和腹膜后脂肪組織，剔除血管及軟組織，DMEM沖洗3遍，剪碎，加等體積0.1%Ⅰ型膠原酶，置入37℃恒溫水浴搖床下30 min。加少量含10%FBS的DMEM終止消化，以離心半徑6 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清及懸浮油性脂肪組織。用含10%FBS的DMEM培養基重懸細胞，接種于培養瓶，于37℃、5%CO2培養箱內培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化，待細胞生長鋪滿瓶底約80%時傳代。取第3 代ADSCs行流式細胞儀分析，觀察其表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105表達情況。
1.3 實驗方法
1.3.1 實驗分組
實驗分為實驗組和對照組，實驗組：取原代SCs與第3代ADSCs置于含20%FBS的DMEM中，兩種細胞按2∶1比例植于Transwell共培養系統，其中SCs以6×104個/cm2密度接種于Transwell上室，ADSCs以3×104個/cm2接種于下室，上、下室培養液相通，建立SCs與ADSCs非接觸共培養體系。于37℃、5%CO2培養箱內培養，每隔72 h換液，共培養14 d。對照組：單純培養第3代ADSCs，培養14 d。
1.3.2 觀測指標
① 培養后每天倒置相差顯微鏡下觀察兩組細胞形態變化。② 培養14 d，取兩組細胞采用流式細胞儀檢測NSE表達；行免疫熒光染色，檢測MAP2、GFAP、NeuN神經特異標志物。取兩組細胞懸液滴加于放有多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔板中，4 h后取出蓋玻片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100處理30 min，PBS洗3次，正常山羊血清封閉30 min，加入MAP2、GFAP、NeuN、NSE一抗，4℃冰箱過夜；PBS洗3次，加入二抗，37℃孵育30 min。水溶性封片劑封片，免疫熒光顯微鏡下觀察。鏡下每張切片取5個非重疊高倍（×200）視野計數總細胞和陽性細胞，計算陽性細胞率。特異熒光染色與DAPI染色擬合后重合的細胞即為陽性細胞。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.01。
2 結果
2.1 大鼠SCs及ADSCs培養觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，原代SCs培養3 d后呈長梭形，胞體狹窄，胞核略透光且邊緣有明亮光暈。胞體伸出細長突起，多為單極或雙極，三極少見，呈“端對端”、“極對極”排列（圖 1 a）。細胞S-100免疫熒光染色為陽性（圖 1 b～d）。
倒置相差顯微鏡下觀察，ADSCs原代接種4 h后即貼壁，細胞形態以梭形及橢圓形多見，分布不均，部分呈集落式增殖，5～8 d即可鋪滿瓶底。隨著傳代次數增多，細胞形態趨于一致，呈長梭型，漩渦狀排列（圖 2）；每代細胞之間無明顯形態學差異。流式細胞儀分析示，第3代細胞高表達CD29（91.81%）、CD90（88.22%）、CD73（99.78%）和CD105（98.32%），低表達CD34（0.20%）和CD45（0.72%）。見圖 3。
圖1
原代SCs培養3 d后觀察 ? 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ?～? S-100免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×400）? ?2.2 共培養細胞觀察
2.2.1 形態學觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，實驗組共培養1 d原呈梭形的ADSCs以胞核為中心收縮，胞體呈錐形、三角形或不規則形，體積變小并伸出許多短而細的指狀突起；3 d后大部分細胞胞體呈球形改變，胞體折光性增強，胞體伸出多個長而粗的突起；7 d時多數細胞顯示出神經細胞的形態學特征；7～14 d 誘導生成的神經元樣細胞穩定增殖且能保持其形態，同時SCs細胞體積增大、周圍突起增多且變粗大。對照組ADSCs培養期間細胞形態無顯著變化。見圖 4。
2.2.2 流式細胞儀檢測
實驗組共培養14 d可見神經細胞特異標志物NSE表達；對照組僅見少量表達。見圖 5。
2.2.3 免疫熒光染色觀察
培養14 d，免疫熒光染色示實驗組有大量MAP2、NeuN、GFAP陽性細胞，其陽性細胞率均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表 1、圖 6。
表1
培養后14 d，兩組MAP2、NSE、NeuN以及GFAP陽性細胞率比較（n=5，%，
圖6
共培養14 d兩組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200） ? 實驗組MAP2 ? 對照組MAP2 ? 實驗組NeuN ? 對照組NeuN ? 實驗組GFAP ? 對照組GFAP
Figure6.
Immunohistochemical staining observation of 2 groups after co-cultured for14 days (Fluorescence microscope×200) ? MAP2 of experimental group ? MAP2 of control group ? NeuN of experimental group ? NeuN of control group ? GFAP of experimental group ? GFAP of control group
3 討論
神經損傷修復的難點在于神經元再生，隨著對干細胞研究的深入，以多能干細胞構建組織工程神經成為研究熱點[12]。MAP2和GFAP在未分化ADSCs中呈低水平表達，表明ADSCs有神經分化潛能[13]。研究表明ADSCs可在化學或生長因子誘導下分化為神經元樣細胞，Qian等[14]用β-巰基乙醇誘導ADSCs 24 h，然后加入丁羥茴醚、DMSO誘導7 d，結果顯示細胞MAP2表達率為2.3%，神經元特異性標志物β-tubulin表達率為47.3%。但此種方法誘導率低且DMSO細胞毒性較大，不利于細胞生長。Wrage等[15]通過加入VEGF和bFGF誘導AD SCs 2～3 d，然后加入吲哚美辛和異丁基-甲基黃嘌呤誘導48 h，免疫熒光染色結果顯示細胞表達神經元特異性標志物Nestin、β-tubulin和GFAP。但與BMSCs一樣，ADSCs經化學誘導雖然能在短時間內高效誘導分化為神經元樣細胞，但其誘導后的神經細胞形態不夠穩定且很快出現細胞死亡。因此有學者提出質疑，認為化學誘導的細胞形態變化是由應激所致細胞物理收縮形成，并非真正意義上的細胞分化[16-17]。同時，化學誘導本身存在細胞毒性，也不能滿足組織工程種子細胞來源條件。為此，陳盼盼等[18]利用生長因子分步誘導法誘導ADSCs向神經元樣細胞分化，第1步加入EGF、bFGF和B27誘導7 d，第2步加入NGF、BDNF和全反式維A酸誘導7 d，結果顯示大部分細胞均表達Nestin、MAP2和NeuN。這種方法誘導效率較高，且生長因子有助于刺激干細胞向神經元樣細胞分化，但是誘導方法復雜且花費大、耗時長。
本研究將SCs與ADSCs在Transwell共培養系統中共培養，探討SCs為ADSCs向神經元樣細胞分化提供誘導微環境的可行性。共培養系統通過中間的一張通透性聚碳酸酯膜，既實現了SCs與ADSCs非直接接觸，同時兩種細胞的分泌物能相互滲透。一方面，SCs分泌的EGF、bFGF、GDNF和BDNF等生長因子可為ADSCs誘導分化提供微環境，同時其分泌的細胞外基質也可構成類軸突髓鞘樣管狀結構，為分化的神經元樣細胞軸突延伸和生長提供隧道。另一方面，共培養也可模擬體內生長微環境，以觀察不同細胞相容性[10]。本研究中，共培養組與單純ADSCs培養相比，細胞生長情況相似[10]，無化學誘導時出現的細胞死亡現象。共培養1 d即可觀察到ADSCs向神經元樣細胞形態改變，胞體變小且有多個神經細胞樣突起；同時SCs也發生形態變化，細胞體積增大、周圍突起增多且變粗大。表明SCs分泌物能夠支持ADSCs生長，并誘導大多數ADSCs向神經元分化；ADSCs的增殖分化產物也能促進SCs生長[19]。
MAP2是一種熱穩定磷蛋白，屬于結構性微管相關蛋白家族，主要在中樞神經系統胞體和樹突表達[20]。NeuN是一種神經元核蛋白，被認為是脊椎動物神經元特異性標志物，神經元成熟的重要標志，廣泛應用于成熟神經元鑒定。GFAP是一種中間絲蛋白，主要存在于星形細胞內。免疫熒光染色結果顯示，實驗組共培養14 d后MAP2、NeuN染色均呈陽性，陽性細胞率顯著高于對照組，流式細胞儀檢測結果亦顯示NSE陽性細胞率顯著增高，提示共培養后細胞具有神經元特性。GFAP也呈陽性表達，說明SCs與ADSCs共培養后，在ADSCs分化為神經元樣細胞的同時，也有星形膠質細胞生成。
綜上述，與化學或生長因子誘導方法相比，SCs與ADSCs共培養更簡便、經濟、高效，有望為組織工程神經構建提供潛在種子細胞來源。但目前關于ADSCs誘導分化研究報道已較多，不同誘導方法的分化效率也不盡相同，且均未能證實分化后的神經元樣細胞是否具有電生理功能[21]。本研究也缺少電生理相關檢測，有待進一步深入研究。
