引用本文： 曹玉凈, 呂翠田. WNT6在BMSCs增殖、遷移和成骨分化中的作用. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(1): 92-96. doi: 10.7507/1002-1892.20150019 復制
BMSCs是具有自我更新、復制及多向分化潛能的成體干細胞[1]，可向成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞和網狀細胞等方向分化。BMSCs增殖、分化和遷移是骨折愈合的基礎，但其調控機制仍不清楚。WNTs是一種分泌糖蛋白家族，目前至少發現19種，在所有動物中幾乎都有表達[2]。WNT信號能夠調節細胞周期、生長和增殖[3]，還參與器官發育，是骨發育中的關鍵調節因子[4]。其中WNT6被視為經典WNT信號傳導分子，大量研究表明其參與胚胎早期發育[5]、器官形成[6]以及基質細胞增殖[7]等過程。目前，有關WNT6對小鼠BMSCs作用的研究較少，為此我們以小鼠BMSCs為研究對象，探討WNT6在BMSCs增殖、成骨分化和遷移中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
小鼠BMSCs（ATCC公司，美國）；20% FBS、DMEM培養基、抗壞血酸-2-磷酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、Trizol試劑盒（Sigma公司，美國）；WNT6特異性shRNA、對照shRNA、轉染增強劑聚凝胺、嘌呤酶素、G418、抗WNT6抗體、抗Ki67抗體、抗β-actin抗體（Santa Cruz公司，美國）；pcDNA3.1載體（Invitrogen公司，美國）；FuGENE HD 轉染試劑盒（Roche公司，美國）；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit（大連寶生物工程有限公司）；ECL標記二抗、ECL試劑盒、DMSO、MTT（江蘇碧云天生物技術研究所）；鈣測定試劑盒（Thermo公司，美國）。Spectra Max Paradigm多功能酶標儀（Molecular Devices公司，澳大利亞）；ROTOR 6000熒光定量PCR儀（Corbett公司，澳大利亞）；Transwell（8 μm；Becton Dickinson公司，美國）；Quantity one軟件（Bio-Rad Laboratories公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 WNT6沉默觀察
實驗分為3組，分別為細胞轉染WNT6特異性shRNA組（A1組）、細胞轉染對照shRNA組（B1組）、未轉染的正常細胞組（C1組）。取小鼠BMSCs置于含20% FBS的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2培養箱內培養，每3天換液1次[8]。待細胞融合達30%～50%，參照說明書將適當稀釋的含WNT6特異性shRNA、對照shRNA和聚凝胺分別轉入A1、B1組BMSCs。轉染后12 h倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞形態無改變后，將細胞轉至含2 μg/mL嘌呤酶素的選擇培養基中，以篩選穩定轉染細胞進行以下觀測。C1組細胞不作處理。
1.2.2 WNT6過表達觀察
實驗分為3組，分別為細胞轉染WNT6重組表達質粒組（A2組）、細胞轉染空載體組（B2組）、未轉染的正常細胞組（C2組）。細胞培養同1.2.1。采用Trizol試劑盒提取BMSCs總RNA，并逆轉錄為cDNA。克隆小鼠WNT6 cDNA，將目的cDNA插入pcDNA3.1載體中，獲取pcDNA3.1-WNT6重組表達質粒。使用FuGENE HD 轉染試劑盒將WNT6重組表達質粒轉入A2組BM SCs，將空載體（pcDNA3.1載體）轉入B2組BM SCs。轉染后48 h倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞形態無明顯變化后，將其轉移至含600 μg/ mL G418的選擇培養基中篩選，取穩定轉染的細胞進行以下觀測。C2組細胞不作處理。
1.3 觀測指標
取A1、B1、A2、B2組經篩選獲得的穩定轉染細胞以及C1、C2組細胞分為兩部分，一部分在含20% FBS的DMEM培養基中繼續培養48 h，行實時熒光定量PCR、Western blot、細胞遷移檢測以及MTT檢測；剩余部分更換為成骨誘導培養基（含20% FBS、50 μg/ mL抗壞血酸-2-磷酸、5 mmol/L β-甘油磷酸鈉和100 nmol/L地塞米松的DMEM），每3天換液1次，繼續培養12 d行ALP活性和鈣沉積檢測。
1.3.1 實時熒光定量PCR
采用Trizol法提取各組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用PCR擴增WNT6，以GAPDH為內參。WNT6和GAPDH引物參照文獻[9-10]設計，由Life Technologies公司合成。引物序列：WNT6上游5’-GGAGATATCCGTGCATTGGT-3’，下游5’-GTCCTGTAGATGGCCCAGAG-3’，產物長度351 bp；GAPDH上游5’-TGACGTGCCGCCTGGAGAAA-3’，下游5’-AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG-3’，產物長度386 bp。反應體系10 μL：含正、反向引物0.6 μL，5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit，1.8 μL DEPC水以及2 μg cDNA。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60℃ 35 s，40個循環；72℃ 5 min。實時熒光定量PCR分析，采用2－△△Ct法計算目的基因相對表達量[11]。實驗重復3次。
1.3.2 Western
blot檢測采用RIPA裂解液裂解各組細胞，提取細胞總蛋白并行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，置于含脫脂奶粉的封閉液室溫封閉l～2 h。TBST洗膜，依次加入一抗（抗WNT6抗體，抗Ki67抗體、抗β-actin抗體）孵育1 h，以β-actin為內參，TBST清洗之后加入ECL標記二抗孵育1 h，TBST洗膜，最后用ECL試劑盒進行顯色反應。采用Quantity one軟件量化蛋白條帶灰度值，以各目的蛋白與β-actin的灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。
1.3.3 MTT法檢測細胞增殖
取各組細胞以0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔約2×103個細胞。每孔加入濃度為5 g/L MTT，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育6 h，棄上清，加入DMSO繼續孵育至紫色結晶全部溶解，采用酶標儀于560 nm波長處測定吸光度（A）值。
1.3.4 細胞遷移檢測
取各組細胞接種于100 mm培養板中，繼續培養至細胞融合達80%～90%。在Transwell上室植入含1×105個BMSCs的細胞懸液100 μL，將上室插入含血清培養基的下室。于37℃、5% CO2及飽和濕度培養箱中培養12 h后取出，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min，PBS洗滌1次，于結晶紫染料中染色15 min，洗滌后于鏡下隨機選取5個200倍視野計數。同時檢測Transwell上室和下室中的細胞增殖數，遷移至小室中的細胞數與細胞增殖數之差即為細胞遷移數。實驗重復3次，取均值。
1.3.5 ALP活性檢測
參照文獻[12]方法測定ALP活性。取各組成骨誘導培養12 d的細胞，PBS洗滌2次，以0.04 g/L蛋白酶E（含1.25×10-3 mol /L EDTA）消化并收集細胞。細胞內ALP活性測定底物為9×10-2 mol/L對硝基苯磷酸二鈉，反應液pH值10.3，37℃反應30 min，加0.1 mol/L NaOH終止反應，采用酶標儀測定400 nm波長處A值。同時采用考馬斯亮藍測定培養細胞蛋白質含量。以單位蛋白樣品在單位時間內對對硝基苯磷酸二鈉毫摩爾消光系數計算ALP活性，表示為mmol/（L·min·g·Protein）。實驗重復3次，取均值。
1.3.6 鈣沉積量檢測
參照文獻[12]方法測定細胞鈣沉積量。取各組成骨誘導培養12 d的細胞，PBS洗滌2次，加入0.6 mol/L HCl 200 μL脫鈣24 h，用鈣測定試劑盒檢測樣本HCl上清液中鈣濃度。細胞脫鈣后，加入裂解液（0.1 mol/L NaOH、0.1 % SDS）200 μL裂解細胞，考馬斯亮藍法測定細胞裂解液中蛋白含量，以單位蛋白樣品中鈣含量計算鈣沉積量，表示為mg/（g·Protein）。實驗重復3次，取均值。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
倒置顯微鏡下，A1、B1、C1組及A2、B2、C2組細胞形態基本一致。見圖 1。
圖1
轉染后48 h各組細胞形態學觀察（倒置顯微鏡×200） ? A1組 ? B1組 ? C1組 ? A2組 ? B2組 ? C2組 ? ?2.2 實時熒光定量PCR檢測
實時熒光定量PCR檢測示，A1、B1、C1組細胞WNT6 mRNA相對表達量分別為0.32±0.03、0.98±0.09、1.00±0.04。A1組WNT6 mRNA表達顯著低于B1、C1組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B1、C1組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
A2、B2、C2組細胞WNT6 mRNA相對表達量分別為2.32±0.14、0.90±0.06、1.00±0.02。A2組WNT6 mRNA表達顯著高于B2、C2組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B2、C2組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.3 Western blot檢測
Western blot檢測示，A1、B1、C1組WNT6和Ki67蛋白相對表達量分別為0.07±0.02、0.95±0.05、1.00±0.04以及0.38±0.03、1.06±0.03、1.00±0.08。A1組WNT6 和Ki67蛋白表達量均顯著低于B1、C1組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B1、C1組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
A2、B2、C2組WNT6和Ki67蛋白相對表達量分別為1.95±0.14、1.07±0.10、1.00±0.08以及2.13±0.18、1.05±0.08、1.00±0.07。A2組WNT6和Ki67蛋白相對表達量均顯著高于B2、C2組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B2、C2組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
2.4 MTT檢測細胞增殖
MTT檢測示，48 h時A1組A值為0.15±0.04顯著低于B1組0.23±0.01及C1組0.23±0.03，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；而B1、C1組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A2組A值為0.38±0.03，顯著高于B2組0.23±0.04及C2組0.22±0.03，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B2、C2組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.5 細胞遷移測定
A1組細胞遷移數為（1 114.33±81.59）個，較B1組的（1 632.67±282.50）個和 C1組的（1 677.00±125.18）個均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但B1、C1組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
A2組細胞遷移數為（2 172.33±111.59）個，較B2組的（1 675.00±111.30）個和 C2組的（1 627.33±165.05）個顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；但B2、C2組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.6 ALP 活性及鈣沉積量測定
A1組ALP活性以及鈣沉積量分別為（1.78±0.50）mmol/ （L·min·g·Protein）、（138.33±32.75）mg/ （g·Protein），顯著低于B1組的（3.06±0.18）mmol/ （L·min·g·Protein）、（258.00±30.12）mg/ （g·Protein）及C1組的（3.13±0.06）mmol/ （L·min·g·Protein）、（267.00±30.35）mg/ （g·Protein），差異均有統計學意義（P＜0.05）。而B1、C1組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。
A2組細胞ALP活性以及鈣沉積量分別為（3.82±0.05）mmol/（L·min·g·Protein）、（336.33±22.68）mg/（g·Protein），顯著高于B2組的（3.10±0.08）mmol/（L·min·g·Protein）、（241.00±28.05）mg/ （g·Protein）及C1組的（3.08±0.08）mmol/ （L·min·g·Protein）、（275.33±14.01）mg/ （g·Protein），差異均有統計學意義（P＜0.05）。而B1、C1組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
BMSCs是存在于骨髓的重要祖細胞和支持細胞，具有自我更新能力，并能分化為多種功能細胞，是組織修復的理想種子細胞[13]。BMSCs作為成骨細胞的主要來源，對骨重塑和修復具有重要作用[14]。因此，BMSCs增殖、分化和遷移在骨損傷修復中至關重要。但影響BMSCs增殖、成骨分化及其成骨能力的因素眾多，近年來學者們針對這些方面進行了廣泛研究，但具體機制尚未明確。
研究顯示WNT6參與調節小鼠子宮間充質干細胞增殖[7]，提示WNT6可能參與小鼠BMSCs增殖。本研究MTT檢測發現，通過轉染WNT6特異性shRNA對小鼠BMSCs中WNT6基因進行沉默后，BMSCs增殖顯著降低；而采用過表達載體上調WNT6表達后，顯著促進BMSCs增殖。Western blot進一步檢測細胞增殖標記分子Ki67，發現下調BMSCs WNT6基因后顯著抑制Ki67表達，而上調WNT6基因后則顯著上調Ki67表達。表明WNT6能夠促進小鼠BMSCs增殖。
BMSCs的成骨能力在骨修復過程中具有重要作用[15]，研究發現WNT信號通路在調控BMSCs分化方向中起重要作用[1]。研究顯示WNT6、WNT10a和WNT10b可抑制BMSCs向脂肪細胞分化，并促進其向成骨細胞分化[16]。本研究結果顯示WNT6 shRNA處理的BMSCs，ALP活性和鈣沉積量均顯著降低，而上調BMSCs WNT6基因后則顯著增加ALP活性及鈣沉積量。表明WNT6是BMSCs向成骨細胞分化的必要分子。
BMSCs向損傷骨組織遷移是骨修復的重要環節[17-18]。研究顯示，WNT6在牙釉質上皮細胞中高表達，參與牙齒形態構建和發育，進一步研究發現WNT6參與了牙髓細胞的遷移和分布[19-21]。我們認為WNT6可能參與BMSCs向損傷骨組織遷移。本研究結果顯示通過下調BMSCs WNT6基因后，其遷移能力大幅度降低；而上調WNT6基因后其遷移能力則顯著增強。表明WNT6在BMSCs遷移過程中發揮重要作用。
綜上述，下調BMSCs中WNT6基因，細胞增殖、成骨分化和遷移能力均受顯著抑制，而上調BMSCs中WNT6基因，則顯著促進了BMSCs增殖、成骨分化和遷移。表明WNT6是BMSCs增殖、成骨分化和遷移過程中的正向調控因子，可能是BMSCs參與骨損傷修復的靶向因子。
BMSCs是具有自我更新、復制及多向分化潛能的成體干細胞[1]，可向成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞和網狀細胞等方向分化。BMSCs增殖、分化和遷移是骨折愈合的基礎，但其調控機制仍不清楚。WNTs是一種分泌糖蛋白家族，目前至少發現19種，在所有動物中幾乎都有表達[2]。WNT信號能夠調節細胞周期、生長和增殖[3]，還參與器官發育，是骨發育中的關鍵調節因子[4]。其中WNT6被視為經典WNT信號傳導分子，大量研究表明其參與胚胎早期發育[5]、器官形成[6]以及基質細胞增殖[7]等過程。目前，有關WNT6對小鼠BMSCs作用的研究較少，為此我們以小鼠BMSCs為研究對象，探討WNT6在BMSCs增殖、成骨分化和遷移中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
小鼠BMSCs（ATCC公司，美國）；20% FBS、DMEM培養基、抗壞血酸-2-磷酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、Trizol試劑盒（Sigma公司，美國）；WNT6特異性shRNA、對照shRNA、轉染增強劑聚凝胺、嘌呤酶素、G418、抗WNT6抗體、抗Ki67抗體、抗β-actin抗體（Santa Cruz公司，美國）；pcDNA3.1載體（Invitrogen公司，美國）；FuGENE HD 轉染試劑盒（Roche公司，美國）；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit（大連寶生物工程有限公司）；ECL標記二抗、ECL試劑盒、DMSO、MTT（江蘇碧云天生物技術研究所）；鈣測定試劑盒（Thermo公司，美國）。Spectra Max Paradigm多功能酶標儀（Molecular Devices公司，澳大利亞）；ROTOR 6000熒光定量PCR儀（Corbett公司，澳大利亞）；Transwell（8 μm；Becton Dickinson公司，美國）；Quantity one軟件（Bio-Rad Laboratories公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 WNT6沉默觀察
實驗分為3組，分別為細胞轉染WNT6特異性shRNA組（A1組）、細胞轉染對照shRNA組（B1組）、未轉染的正常細胞組（C1組）。取小鼠BMSCs置于含20% FBS的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2培養箱內培養，每3天換液1次[8]。待細胞融合達30%～50%，參照說明書將適當稀釋的含WNT6特異性shRNA、對照shRNA和聚凝胺分別轉入A1、B1組BMSCs。轉染后12 h倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞形態無改變后，將細胞轉至含2 μg/mL嘌呤酶素的選擇培養基中，以篩選穩定轉染細胞進行以下觀測。C1組細胞不作處理。
1.2.2 WNT6過表達觀察
實驗分為3組，分別為細胞轉染WNT6重組表達質粒組（A2組）、細胞轉染空載體組（B2組）、未轉染的正常細胞組（C2組）。細胞培養同1.2.1。采用Trizol試劑盒提取BMSCs總RNA，并逆轉錄為cDNA。克隆小鼠WNT6 cDNA，將目的cDNA插入pcDNA3.1載體中，獲取pcDNA3.1-WNT6重組表達質粒。使用FuGENE HD 轉染試劑盒將WNT6重組表達質粒轉入A2組BM SCs，將空載體（pcDNA3.1載體）轉入B2組BM SCs。轉染后48 h倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞形態無明顯變化后，將其轉移至含600 μg/ mL G418的選擇培養基中篩選，取穩定轉染的細胞進行以下觀測。C2組細胞不作處理。
1.3 觀測指標
取A1、B1、A2、B2組經篩選獲得的穩定轉染細胞以及C1、C2組細胞分為兩部分，一部分在含20% FBS的DMEM培養基中繼續培養48 h，行實時熒光定量PCR、Western blot、細胞遷移檢測以及MTT檢測；剩余部分更換為成骨誘導培養基（含20% FBS、50 μg/ mL抗壞血酸-2-磷酸、5 mmol/L β-甘油磷酸鈉和100 nmol/L地塞米松的DMEM），每3天換液1次，繼續培養12 d行ALP活性和鈣沉積檢測。
1.3.1 實時熒光定量PCR
采用Trizol法提取各組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用PCR擴增WNT6，以GAPDH為內參。WNT6和GAPDH引物參照文獻[9-10]設計，由Life Technologies公司合成。引物序列：WNT6上游5’-GGAGATATCCGTGCATTGGT-3’，下游5’-GTCCTGTAGATGGCCCAGAG-3’，產物長度351 bp；GAPDH上游5’-TGACGTGCCGCCTGGAGAAA-3’，下游5’-AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG-3’，產物長度386 bp。反應體系10 μL：含正、反向引物0.6 μL，5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit，1.8 μL DEPC水以及2 μg cDNA。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60℃ 35 s，40個循環；72℃ 5 min。實時熒光定量PCR分析，采用2－△△Ct法計算目的基因相對表達量[11]。實驗重復3次。
1.3.2 Western
blot檢測采用RIPA裂解液裂解各組細胞，提取細胞總蛋白并行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，置于含脫脂奶粉的封閉液室溫封閉l～2 h。TBST洗膜，依次加入一抗（抗WNT6抗體，抗Ki67抗體、抗β-actin抗體）孵育1 h，以β-actin為內參，TBST清洗之后加入ECL標記二抗孵育1 h，TBST洗膜，最后用ECL試劑盒進行顯色反應。采用Quantity one軟件量化蛋白條帶灰度值，以各目的蛋白與β-actin的灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。
1.3.3 MTT法檢測細胞增殖
取各組細胞以0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔約2×103個細胞。每孔加入濃度為5 g/L MTT，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育6 h，棄上清，加入DMSO繼續孵育至紫色結晶全部溶解，采用酶標儀于560 nm波長處測定吸光度（A）值。
1.3.4 細胞遷移檢測
取各組細胞接種于100 mm培養板中，繼續培養至細胞融合達80%～90%。在Transwell上室植入含1×105個BMSCs的細胞懸液100 μL，將上室插入含血清培養基的下室。于37℃、5% CO2及飽和濕度培養箱中培養12 h后取出，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min，PBS洗滌1次，于結晶紫染料中染色15 min，洗滌后于鏡下隨機選取5個200倍視野計數。同時檢測Transwell上室和下室中的細胞增殖數，遷移至小室中的細胞數與細胞增殖數之差即為細胞遷移數。實驗重復3次，取均值。
1.3.5 ALP活性檢測
參照文獻[12]方法測定ALP活性。取各組成骨誘導培養12 d的細胞，PBS洗滌2次，以0.04 g/L蛋白酶E（含1.25×10-3 mol /L EDTA）消化并收集細胞。細胞內ALP活性測定底物為9×10-2 mol/L對硝基苯磷酸二鈉，反應液pH值10.3，37℃反應30 min，加0.1 mol/L NaOH終止反應，采用酶標儀測定400 nm波長處A值。同時采用考馬斯亮藍測定培養細胞蛋白質含量。以單位蛋白樣品在單位時間內對對硝基苯磷酸二鈉毫摩爾消光系數計算ALP活性，表示為mmol/（L·min·g·Protein）。實驗重復3次，取均值。
1.3.6 鈣沉積量檢測
參照文獻[12]方法測定細胞鈣沉積量。取各組成骨誘導培養12 d的細胞，PBS洗滌2次，加入0.6 mol/L HCl 200 μL脫鈣24 h，用鈣測定試劑盒檢測樣本HCl上清液中鈣濃度。細胞脫鈣后，加入裂解液（0.1 mol/L NaOH、0.1 % SDS）200 μL裂解細胞，考馬斯亮藍法測定細胞裂解液中蛋白含量，以單位蛋白樣品中鈣含量計算鈣沉積量，表示為mg/（g·Protein）。實驗重復3次，取均值。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
倒置顯微鏡下，A1、B1、C1組及A2、B2、C2組細胞形態基本一致。見圖 1。
圖1
轉染后48 h各組細胞形態學觀察（倒置顯微鏡×200） ? A1組 ? B1組 ? C1組 ? A2組 ? B2組 ? C2組 ? ?2.2 實時熒光定量PCR檢測
實時熒光定量PCR檢測示，A1、B1、C1組細胞WNT6 mRNA相對表達量分別為0.32±0.03、0.98±0.09、1.00±0.04。A1組WNT6 mRNA表達顯著低于B1、C1組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B1、C1組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
A2、B2、C2組細胞WNT6 mRNA相對表達量分別為2.32±0.14、0.90±0.06、1.00±0.02。A2組WNT6 mRNA表達顯著高于B2、C2組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B2、C2組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.3 Western blot檢測
Western blot檢測示，A1、B1、C1組WNT6和Ki67蛋白相對表達量分別為0.07±0.02、0.95±0.05、1.00±0.04以及0.38±0.03、1.06±0.03、1.00±0.08。A1組WNT6 和Ki67蛋白表達量均顯著低于B1、C1組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B1、C1組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
A2、B2、C2組WNT6和Ki67蛋白相對表達量分別為1.95±0.14、1.07±0.10、1.00±0.08以及2.13±0.18、1.05±0.08、1.00±0.07。A2組WNT6和Ki67蛋白相對表達量均顯著高于B2、C2組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B2、C2組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
2.4 MTT檢測細胞增殖
MTT檢測示，48 h時A1組A值為0.15±0.04顯著低于B1組0.23±0.01及C1組0.23±0.03，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；而B1、C1組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A2組A值為0.38±0.03，顯著高于B2組0.23±0.04及C2組0.22±0.03，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而B2、C2組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.5 細胞遷移測定
A1組細胞遷移數為（1 114.33±81.59）個，較B1組的（1 632.67±282.50）個和 C1組的（1 677.00±125.18）個均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但B1、C1組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
A2組細胞遷移數為（2 172.33±111.59）個，較B2組的（1 675.00±111.30）個和 C2組的（1 627.33±165.05）個顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；但B2、C2組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.6 ALP 活性及鈣沉積量測定
A1組ALP活性以及鈣沉積量分別為（1.78±0.50）mmol/ （L·min·g·Protein）、（138.33±32.75）mg/ （g·Protein），顯著低于B1組的（3.06±0.18）mmol/ （L·min·g·Protein）、（258.00±30.12）mg/ （g·Protein）及C1組的（3.13±0.06）mmol/ （L·min·g·Protein）、（267.00±30.35）mg/ （g·Protein），差異均有統計學意義（P＜0.05）。而B1、C1組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。
A2組細胞ALP活性以及鈣沉積量分別為（3.82±0.05）mmol/（L·min·g·Protein）、（336.33±22.68）mg/（g·Protein），顯著高于B2組的（3.10±0.08）mmol/（L·min·g·Protein）、（241.00±28.05）mg/ （g·Protein）及C1組的（3.08±0.08）mmol/ （L·min·g·Protein）、（275.33±14.01）mg/ （g·Protein），差異均有統計學意義（P＜0.05）。而B1、C1組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
BMSCs是存在于骨髓的重要祖細胞和支持細胞，具有自我更新能力，并能分化為多種功能細胞，是組織修復的理想種子細胞[13]。BMSCs作為成骨細胞的主要來源，對骨重塑和修復具有重要作用[14]。因此，BMSCs增殖、分化和遷移在骨損傷修復中至關重要。但影響BMSCs增殖、成骨分化及其成骨能力的因素眾多，近年來學者們針對這些方面進行了廣泛研究，但具體機制尚未明確。
研究顯示WNT6參與調節小鼠子宮間充質干細胞增殖[7]，提示WNT6可能參與小鼠BMSCs增殖。本研究MTT檢測發現，通過轉染WNT6特異性shRNA對小鼠BMSCs中WNT6基因進行沉默后，BMSCs增殖顯著降低；而采用過表達載體上調WNT6表達后，顯著促進BMSCs增殖。Western blot進一步檢測細胞增殖標記分子Ki67，發現下調BMSCs WNT6基因后顯著抑制Ki67表達，而上調WNT6基因后則顯著上調Ki67表達。表明WNT6能夠促進小鼠BMSCs增殖。
BMSCs的成骨能力在骨修復過程中具有重要作用[15]，研究發現WNT信號通路在調控BMSCs分化方向中起重要作用[1]。研究顯示WNT6、WNT10a和WNT10b可抑制BMSCs向脂肪細胞分化，并促進其向成骨細胞分化[16]。本研究結果顯示WNT6 shRNA處理的BMSCs，ALP活性和鈣沉積量均顯著降低，而上調BMSCs WNT6基因后則顯著增加ALP活性及鈣沉積量。表明WNT6是BMSCs向成骨細胞分化的必要分子。
BMSCs向損傷骨組織遷移是骨修復的重要環節[17-18]。研究顯示，WNT6在牙釉質上皮細胞中高表達，參與牙齒形態構建和發育，進一步研究發現WNT6參與了牙髓細胞的遷移和分布[19-21]。我們認為WNT6可能參與BMSCs向損傷骨組織遷移。本研究結果顯示通過下調BMSCs WNT6基因后，其遷移能力大幅度降低；而上調WNT6基因后其遷移能力則顯著增強。表明WNT6在BMSCs遷移過程中發揮重要作用。
綜上述，下調BMSCs中WNT6基因，細胞增殖、成骨分化和遷移能力均受顯著抑制，而上調BMSCs中WNT6基因，則顯著促進了BMSCs增殖、成骨分化和遷移。表明WNT6是BMSCs增殖、成骨分化和遷移過程中的正向調控因子，可能是BMSCs參與骨損傷修復的靶向因子。
