引用本文： 張紫機, 康焱, 張志奇, 楊子波, 方淑鶯, 盛璞義, 何愛珊, 傅明, 廖威明. 人脂肪來源干細胞成軟骨分化過程中成軟骨相關微小RNA表達的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(1): 74-80. doi: 10.7507/1002-1892.20150017 復制
軟骨組織工程研究中，種子細胞的選擇是關鍵。自體軟骨細胞具有供區有限、體外培養傳代去分化，以及隨年齡增長細胞數量和質量下降等缺陷。而脂肪組織具有來源廣泛、取材簡便、易培養、生物學性質穩定等優點，故人脂肪來源干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）成軟骨誘導已成為研究熱點[1-2]。微小RNA（micro RNA，miRNA）是在轉錄后水平參與基因調控的一類非編碼單鏈小分子RNA，通過堿基互補配對原則與靶基因mRNA的3’-非編碼區相結合而沉默基因，導致其降解或翻譯抑制，從而于轉錄后水平調控基因表達[3]。miRNA在多個調控通路中扮演重要角色，如胚胎發育及器官形成、細胞增殖與凋亡、脂肪代謝、細胞生長與分化[4-6]等。研究發現miRNA在維持軟骨及軟骨細胞內環境穩定中起重要作用[7]，能調節MSCs成軟骨分化[8]。本實驗通過miRNA基因芯片技術篩選hAD SCs成軟骨分化中特異性表達miRNA，并預測其軟骨代謝相關靶基因。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑、儀器
人脂肪組織由中山大學附屬第一醫院行抽脂術或其他腹部手術的3例患者自愿捐贈，其中女1例，男2例；年齡19、28、45歲；均排除惡性腫瘤和代謝性疾病。本實驗獲中山大學倫理委員會審核批準。
DMEM培養液、FBS、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素雙抗溶液（GIBCO公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國）；PBS（HyClone公司，美國）；成人MSCs成軟骨誘導分化基礎培養液及添加物（Cyagen公司，美國），添加物含脯氨酸、ITS + Supplement、TGF-β3等，與成軟骨誘導分化基礎培養液混勻后形成完全培養液；人Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅱ，Col2a1）、人蛋白聚糖（Aggrecan）、人Col10a1、人硫酸軟骨素 ELISA定量檢測試劑盒（Rapidbio公司，美國）；細胞總RNA提取試劑Trizol Reagent（Invit rogen公司，美國）；miRNeasy mini kit試劑盒（Qiagen公司，德國）；miRCURYTM LNA Array V13.0芯片、miRCURYTM Hy3TM /Hy5TM Power labeling kit試劑盒（Exiqon公司，丹麥）；SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO公司，日本）；miRNA 實時定量PCR檢測試劑盒（GeneCopoeia公司，美國）；FITC單克隆抗體、PC5單克隆抗體、鼠抗人IgG1、鼠抗人CD14、鼠抗人CD34、鼠抗人CD73、人HLA-DR單克隆抗體（BD公司，美國）；PE單克隆抗體、鼠抗人CD90、鼠抗人CD105單克隆抗體（eBioscience公司，美國）。
CO2細胞培養箱（Thermo Forma公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；層流超凈工作臺（ESCO公司，美國）；低溫離心機、分光光度計（Eppendorf公司，德國）；紫外分光光度計ND1000（Nanodrop公司，美國）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；凝膠成像分析系統（Vilber公司，美國）；臺式分子雜交箱（Shellab公司，美國）；LuxScanTM 10K/A雙通道激光共聚焦芯片掃描儀、Bio MixerⅡ芯片雜交儀、芯片洗干儀、LuxScan V3.0圖像分析軟件、微陣列數據分析系統V2.0（北京博奧生物技術有限公司）；SAM（Significance analysis of microarrays）軟件（Stanford大學，美國）；ABI PRISM? 7500 序列檢測系統（ABI公司，美國）；iQ5 實時定量 PCR分析儀、電泳儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 hADSCs分離培養及鑒定
無菌條件剪取5～10 g脂肪組織，PBS沖洗3次，剔除殘留纖維組織和血管，剪碎至乳糜狀。按照1∶1（V/V）比例加入Ⅰ型膠原酶，置于恒溫搖床37℃消化60 min，100 μm尼龍濾網過濾，加入含10%FBS的DMEM中止消化，棄上層漂浮的脂肪和培養基，加入DMEM吹打沖洗，重懸細胞；以離心半徑10 cm，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入完全培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 g/ L鏈霉素的DMEM培養基），按1.5×105個/cm2濃度接種于細胞培養瓶，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化；細胞達80%融合后傳代培養，取第3代細胞采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD13、CD34、CD73、CD90、CD105，鑒定細胞。
1.3 hADSCs成軟骨誘導分化及相關檢測
取第3代hADSCs，用成人MSCs成軟骨誘導分化基礎培養液調整細胞密度為2×107個/mL，接種至24孔板中，每孔12.5 μL。于37℃、5% CO2及飽和濕度培養箱培養90 min，待細胞聚集成團后加入成軟骨誘導分化完全培養液，每孔500 μL。細胞團于24 h內進一步聚合并緊密黏附，形成直徑1～2 mm微球。每3天換液1次，期間肉眼觀察軟骨球形成情況，至21 d收集軟骨球。① 組織學觀察：將軟骨球置于10%甲醛室溫下固定3 d，無水乙醇脫水，二甲苯沖洗后石蠟包埋切片，片厚5 μm，阿爾新藍染色，鏡下觀察軟骨形成情況。以未行成軟骨誘導的細胞作為對照。② 成軟骨相關蛋白檢測：取培養后7、14、21 d上清，按ELISA定量檢測試劑盒說明書，檢測hADSCs成軟骨誘導分化相關蛋白表達情況，包括Col2a1、Aggrecan、Col10a1及硫酸軟骨素。以hADSCs未行成軟骨誘導的普通培養上清作為對照。
1.4 篩選成軟骨相關差異表達miRNA
取成軟骨誘導21 d軟骨球及誘導前hADSCs，采用Trizol細胞裂解液提取總RNA。按照miRCURYTM Hy3TM /Hy5TM Power labeling kit試劑盒說明書進行miRNA標記、雜交及脫水處理，通過LuxScan 10K/A雙通道激光共聚焦芯片掃描儀掃描，LuxScan V3.0圖像分析軟件分析芯片圖像，將圖像信號轉化成數字信號。每個樣品重復2次芯片雜交。最終輸出結果包括誘導前后表達有變化和沒有變化的所有miRNAs信號，Ratio值為Lowess法歸一化后的結果。整合Ratio值，采用SAM軟件分析，根據以下標準篩選差異表達miRNA，包括表達上調及下調的miRNA。篩選標準：q值＜1%且Ratio值≥2或Ratio值≤0.5（即差異倍數在2倍以上）。本實驗結果取自3個樣本，篩選前選出每個hADSCs樣品成軟骨誘導分化前后表達差異顯著的miRNA，然后取其交集。
對于篩選的成軟骨誘導分化差異表達miR NAs，通過miRNA靶基因預測站點Target Scan（http://www.targetscan.org/）、miRanda（http://www.microrna.org/）、PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/）和miRBase（http://www.mirbase.org/）進行靶基因預測，同時被3種預測軟件認定的靶基因納入結果。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hADSCs鑒定
流式細胞儀檢測示第3代細胞CD73、CD90和CD105陽性表達，其中CD73表達陽性細胞占99.02%，CD90表達陽性細胞占95.28%，CD105表達陽性細胞占97.65%，而造血干細胞相關標記抗原CD14和CD34表達均為陰性（圖 1）。提示培養的細胞為hADSCs[9]。
圖1
流式細胞儀檢測第3代細胞表面抗原 ?CD73 ?CD90 ?CD105 ?CD34 ?CD14 ? ?2.2 成軟骨誘導分化相關檢測
第3代hADSCs成軟骨誘導1 d后可見軟骨球形成，5～7 d軟骨球表面逐漸光滑，具軟骨光澤；隨培養時間延長，軟骨球逐漸增大，至21 d直徑可達1.5～2.0 mm（圖 2）。誘導21 d，阿爾新藍染色呈陽性，形成大量軟骨基質Aggrecan；而未誘導的hADSCs染色呈陰性（圖 3）。
ELISA檢測示，成軟骨誘導后7、14、21 d，Co l2a1、Aggrecan、Col10a1及硫酸軟骨素表達水平均顯著高于未誘導的hADSCs，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
2.3 成軟骨誘導前后差異性表達miRNA芯片篩查
在樣本1中，篩選出255個差異性表達miR NA，其中141個上調miRNA及114個下調miRNA。樣本2中，篩選出78個差異性表達miR NA，其中27個上調miRNA，51個下調miRNA。樣本3中，篩選出231個差異性表達miRNA，其中144個上調miRNA，87個下調miRNA。
綜合3個樣本共篩選出11個差異性表達miRNA。與未誘導hADSCs相比，成軟骨誘導培養后hADSCs中7個miRNA表達上調，分別為hsa-miR-193b、hsa-miR-199a-3p/hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-210、hsa-miR-381、hsa-miR-92a和hsa-miR-320c，4個miRNA表達下調，分別為hsa-miR-490-5p、hsa-miR-4287、evb-miR-BART8*和hcmv-miR-US25-1*。見表 1。
表1
成軟骨誘導前后差異性表達miRNAs
Table1.
miRNAs expression in chondrogenic differentiated hADSCs by microarray
對7個已有大量研究的miRNA進行靶基因預測，結果顯示大量與細胞增殖、分化、周期調控以及轉錄因子和信號傳導相關的基因都可能成為上述miRNA的潛在靶基因。在hADSCs成軟骨分化中表達上調的miRNAs靶向基因可能為CAAT/增強子結合蛋白β（CAAT/enhancer binding protein β,CAAT/EBPβ）、B細胞κ輕鏈增強核因子的抑制物α（nuclear factor of kappa light chain enhancer of activated B cells inhibitor alpha，NFKBIA或IKBA）、Sox4、絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated kinase-like protein 1，MAPK-1）、Runx2和骨形成蛋白受體2（bone morphogenic protein receptor 2，BMPR2）等。而在hADSCs成軟骨分化過程中表達下調的miR NAs靶基因可能為Sox4、Smad4、Smad5、MAPK-1和BMPR2。見表 2。
表2
部分成軟骨相關miRNAs的靶基因在線預測結果
Table2.
Predicted target genes of chondrogenic miRNAs that are related to cartilage formation and chondrogenic differentiation
3 討論
miRNA是一類短鏈的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于各種組織和器官，并在骨及軟骨發育中扮演重要角色[8, 10-15]。為了進一步研究miRNA在hADSCs成軟骨分化中的作用，我們應用miRNA微陣列芯片技術篩選成軟骨分化前后差異性表達超過2倍的miRNA。結果顯示，miR-193b、miR-199a-3p/miR-199b-3p、miR-455-3p、miR-210、miR-381、miR-92a以及miR-320c表達均明顯上調超過2倍。Han等 [16]報道miR-193b在MSCs成軟骨分化過程中表達升高。Swingler等[14]也在軟骨形成過程中和成人關節軟骨中發現miR-455-3p表達。鑒于miRNA在MSCs成軟骨分化中的重要作用，我們認為這些表達異常的miRNA可能具備改變hADSCs成軟骨分化進程的能力。
研究發現miR-140在斑馬及老鼠的軟骨發育[17-18]以及人關節軟骨發育中均有表達[19]。近期有研究發現骨關節炎患者軟骨中miR-140-5p表達明顯升高[14]。這些結果均提示miR-140在關節軟骨發育過程中具有重要作用，但在本研究中miR-140-5p僅在兩個樣本中表現出超過2倍的差異性表達。我們前期研究也未發現這些miRNAs在hADSCs成骨分化過程中明顯過表達[10]，因而我們認為這些特異miRNA在關節軟骨發育進程中可能起一定作用。
軟骨細胞的代謝受轉錄和轉錄后水平調控，miRNA作為成軟骨分化轉錄后重要的調節中介，通過結合靶基因，即轉錄因子發揮作用[8, 13, 20]。miR-199a*是miR-199a家族中的一員，是BMP-2反應性miRNA，在鼠MSCs中它可以直接靶向結合Smad1進而調節軟骨形成[19]；miR-455-3p則通過調節TGF-β信號通路抑制成軟骨分化相關的Smad2/3通路[14]。為探索特異性表達的miRNAs靶基因，我們通過miRNA靶基因預測軟件發現靶基因中包括了多種轉錄因子，如Sox5、Sox9、C/EBPβ、MAPK-1、Smad3、NF-κB、Runx2和Osterix等，功能涉及成軟骨分化、增殖、凋亡、細胞周期控制、細胞內級聯反應和自我更新等。
Xu等[20]研究發現Sox5可與miR-194聯合調控hADSCs成軟骨分化，但本研究僅1個樣本成軟骨誘導后miR-194下調2.95倍。Xu等研究認為，miR-194下調可增加Sox5表達，從而增強hADSCs成軟骨分化能力；miR-194上調則減弱其成軟骨分化能力。亦有報道Sox5和Sox9對hADSCs成軟骨分化過程中Ⅱ型膠原表達起調控作用[21]。C/EBP是亮氨酸拉鏈轉錄因子家族，其中C/EBPβ與軟骨細胞特異性基因表達有重要相關性，介導軟骨細胞對IL-1β和抵抗素作用的生物反應[22]。也有研究認為C/EBPβ能夠促進軟骨細胞從增殖期至肥大軟骨細胞轉化，敲除C/EBPβ后能延緩骨關節炎的發展[23]。因此，C/EBPβ是軟骨細胞生長分化調控和細胞退變中的重要轉錄因子。NF-κB是另一個與成軟骨分化密切相關的預測靶基因。在轉錄調控中，C/EBPβ與NF-κB能有序聯合調控軟骨細胞炎性因子的表達。NF-κB參與早期起始性的反應性正向調節，但不參與炎性因子的基礎狀態下啟動子的活性；C/EBPβ持續穩定參與炎性因子的反應性正向調節和細胞穩定期內炎性因子的表達[22-23]。這一研究理論也在上皮細胞中得到證實[24]。另外，Wehling等 [24]發現在軟骨修復中IL-1β和TNF-α通過NF-κB依賴性信號通路抑制干細胞成軟骨分化。結合以上研究結果我們認為，C/EBPβ及NF-κB在調節干細胞成軟骨分化和抑制退變中的作用不容忽視，并需深入研究。
本研究篩選出4個成軟骨誘導分化前后表達下調超過2倍的miRNA，包括miR-4287、miR-BART8*、miR-US25-1*和miR-490-5p。因目前對miR-4287、miR-BART8*和miR-US25-1*的研究有限，未能查閱到相關文獻，且反復多次對其引物的設計亦因同樣理由失敗，未對其進行靶基因預測。miR-490-5p目前多見于膀胱癌組織[25]，尚未在成軟骨分化中發現。其預測靶基因中與軟骨分化相關的有Sox2、Sox4、Smad4、Smad5、MAPK-1/7/9/12和BMPR2/7/9等。功能亦同樣涉及成軟骨細胞分化、增殖、凋亡、細胞周期控制、介導細胞內級聯反應和自我更新等。在hADSCs成軟骨分化中表達上調的miRNAs潛在靶基因和下調的miRNAs潛在靶基因有部分重合，如Sox2/4、Smad4/5、MAPK-1/9和BMP-2/7等，提示它們可能同時參與某些轉錄因子的調控。
miRNAs在成軟骨分化中的調控作用已逐漸被認識。本研究發現了一組在hADSCs成軟骨分化過程中差異性表達的miRNA，它們可能參與hADSCs成軟骨分化調控。靶基因預測發現，1個miRNA有多個靶基因，提示1個miRNA可能參與多個信號通路調節。為進一步闡明miRNAs在轉錄后水平對成軟骨分化的調控機制，后續將對miRNA預測靶基因功能進行研究，從而為定向調控hADSCs成軟骨分化及篩選組織工程改良種子細胞提供理論依據。
軟骨組織工程研究中，種子細胞的選擇是關鍵。自體軟骨細胞具有供區有限、體外培養傳代去分化，以及隨年齡增長細胞數量和質量下降等缺陷。而脂肪組織具有來源廣泛、取材簡便、易培養、生物學性質穩定等優點，故人脂肪來源干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）成軟骨誘導已成為研究熱點[1-2]。微小RNA（micro RNA，miRNA）是在轉錄后水平參與基因調控的一類非編碼單鏈小分子RNA，通過堿基互補配對原則與靶基因mRNA的3’-非編碼區相結合而沉默基因，導致其降解或翻譯抑制，從而于轉錄后水平調控基因表達[3]。miRNA在多個調控通路中扮演重要角色，如胚胎發育及器官形成、細胞增殖與凋亡、脂肪代謝、細胞生長與分化[4-6]等。研究發現miRNA在維持軟骨及軟骨細胞內環境穩定中起重要作用[7]，能調節MSCs成軟骨分化[8]。本實驗通過miRNA基因芯片技術篩選hAD SCs成軟骨分化中特異性表達miRNA，并預測其軟骨代謝相關靶基因。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑、儀器
人脂肪組織由中山大學附屬第一醫院行抽脂術或其他腹部手術的3例患者自愿捐贈，其中女1例，男2例；年齡19、28、45歲；均排除惡性腫瘤和代謝性疾病。本實驗獲中山大學倫理委員會審核批準。
DMEM培養液、FBS、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素雙抗溶液（GIBCO公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國）；PBS（HyClone公司，美國）；成人MSCs成軟骨誘導分化基礎培養液及添加物（Cyagen公司，美國），添加物含脯氨酸、ITS + Supplement、TGF-β3等，與成軟骨誘導分化基礎培養液混勻后形成完全培養液；人Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅱ，Col2a1）、人蛋白聚糖（Aggrecan）、人Col10a1、人硫酸軟骨素 ELISA定量檢測試劑盒（Rapidbio公司，美國）；細胞總RNA提取試劑Trizol Reagent（Invit rogen公司，美國）；miRNeasy mini kit試劑盒（Qiagen公司，德國）；miRCURYTM LNA Array V13.0芯片、miRCURYTM Hy3TM /Hy5TM Power labeling kit試劑盒（Exiqon公司，丹麥）；SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO公司，日本）；miRNA 實時定量PCR檢測試劑盒（GeneCopoeia公司，美國）；FITC單克隆抗體、PC5單克隆抗體、鼠抗人IgG1、鼠抗人CD14、鼠抗人CD34、鼠抗人CD73、人HLA-DR單克隆抗體（BD公司，美國）；PE單克隆抗體、鼠抗人CD90、鼠抗人CD105單克隆抗體（eBioscience公司，美國）。
CO2細胞培養箱（Thermo Forma公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；層流超凈工作臺（ESCO公司，美國）；低溫離心機、分光光度計（Eppendorf公司，德國）；紫外分光光度計ND1000（Nanodrop公司，美國）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；凝膠成像分析系統（Vilber公司，美國）；臺式分子雜交箱（Shellab公司，美國）；LuxScanTM 10K/A雙通道激光共聚焦芯片掃描儀、Bio MixerⅡ芯片雜交儀、芯片洗干儀、LuxScan V3.0圖像分析軟件、微陣列數據分析系統V2.0（北京博奧生物技術有限公司）；SAM（Significance analysis of microarrays）軟件（Stanford大學，美國）；ABI PRISM? 7500 序列檢測系統（ABI公司，美國）；iQ5 實時定量 PCR分析儀、電泳儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 hADSCs分離培養及鑒定
無菌條件剪取5～10 g脂肪組織，PBS沖洗3次，剔除殘留纖維組織和血管，剪碎至乳糜狀。按照1∶1（V/V）比例加入Ⅰ型膠原酶，置于恒溫搖床37℃消化60 min，100 μm尼龍濾網過濾，加入含10%FBS的DMEM中止消化，棄上層漂浮的脂肪和培養基，加入DMEM吹打沖洗，重懸細胞；以離心半徑10 cm，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入完全培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 g/ L鏈霉素的DMEM培養基），按1.5×105個/cm2濃度接種于細胞培養瓶，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化；細胞達80%融合后傳代培養，取第3代細胞采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD13、CD34、CD73、CD90、CD105，鑒定細胞。
1.3 hADSCs成軟骨誘導分化及相關檢測
取第3代hADSCs，用成人MSCs成軟骨誘導分化基礎培養液調整細胞密度為2×107個/mL，接種至24孔板中，每孔12.5 μL。于37℃、5% CO2及飽和濕度培養箱培養90 min，待細胞聚集成團后加入成軟骨誘導分化完全培養液，每孔500 μL。細胞團于24 h內進一步聚合并緊密黏附，形成直徑1～2 mm微球。每3天換液1次，期間肉眼觀察軟骨球形成情況，至21 d收集軟骨球。① 組織學觀察：將軟骨球置于10%甲醛室溫下固定3 d，無水乙醇脫水，二甲苯沖洗后石蠟包埋切片，片厚5 μm，阿爾新藍染色，鏡下觀察軟骨形成情況。以未行成軟骨誘導的細胞作為對照。② 成軟骨相關蛋白檢測：取培養后7、14、21 d上清，按ELISA定量檢測試劑盒說明書，檢測hADSCs成軟骨誘導分化相關蛋白表達情況，包括Col2a1、Aggrecan、Col10a1及硫酸軟骨素。以hADSCs未行成軟骨誘導的普通培養上清作為對照。
1.4 篩選成軟骨相關差異表達miRNA
取成軟骨誘導21 d軟骨球及誘導前hADSCs，采用Trizol細胞裂解液提取總RNA。按照miRCURYTM Hy3TM /Hy5TM Power labeling kit試劑盒說明書進行miRNA標記、雜交及脫水處理，通過LuxScan 10K/A雙通道激光共聚焦芯片掃描儀掃描，LuxScan V3.0圖像分析軟件分析芯片圖像，將圖像信號轉化成數字信號。每個樣品重復2次芯片雜交。最終輸出結果包括誘導前后表達有變化和沒有變化的所有miRNAs信號，Ratio值為Lowess法歸一化后的結果。整合Ratio值，采用SAM軟件分析，根據以下標準篩選差異表達miRNA，包括表達上調及下調的miRNA。篩選標準：q值＜1%且Ratio值≥2或Ratio值≤0.5（即差異倍數在2倍以上）。本實驗結果取自3個樣本，篩選前選出每個hADSCs樣品成軟骨誘導分化前后表達差異顯著的miRNA，然后取其交集。
對于篩選的成軟骨誘導分化差異表達miR NAs，通過miRNA靶基因預測站點Target Scan（http://www.targetscan.org/）、miRanda（http://www.microrna.org/）、PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/）和miRBase（http://www.mirbase.org/）進行靶基因預測，同時被3種預測軟件認定的靶基因納入結果。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hADSCs鑒定
流式細胞儀檢測示第3代細胞CD73、CD90和CD105陽性表達，其中CD73表達陽性細胞占99.02%，CD90表達陽性細胞占95.28%，CD105表達陽性細胞占97.65%，而造血干細胞相關標記抗原CD14和CD34表達均為陰性（圖 1）。提示培養的細胞為hADSCs[9]。
圖1
流式細胞儀檢測第3代細胞表面抗原 ?CD73 ?CD90 ?CD105 ?CD34 ?CD14 ? ?2.2 成軟骨誘導分化相關檢測
第3代hADSCs成軟骨誘導1 d后可見軟骨球形成，5～7 d軟骨球表面逐漸光滑，具軟骨光澤；隨培養時間延長，軟骨球逐漸增大，至21 d直徑可達1.5～2.0 mm（圖 2）。誘導21 d，阿爾新藍染色呈陽性，形成大量軟骨基質Aggrecan；而未誘導的hADSCs染色呈陰性（圖 3）。
ELISA檢測示，成軟骨誘導后7、14、21 d，Co l2a1、Aggrecan、Col10a1及硫酸軟骨素表達水平均顯著高于未誘導的hADSCs，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
2.3 成軟骨誘導前后差異性表達miRNA芯片篩查
在樣本1中，篩選出255個差異性表達miR NA，其中141個上調miRNA及114個下調miRNA。樣本2中，篩選出78個差異性表達miR NA，其中27個上調miRNA，51個下調miRNA。樣本3中，篩選出231個差異性表達miRNA，其中144個上調miRNA，87個下調miRNA。
綜合3個樣本共篩選出11個差異性表達miRNA。與未誘導hADSCs相比，成軟骨誘導培養后hADSCs中7個miRNA表達上調，分別為hsa-miR-193b、hsa-miR-199a-3p/hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-210、hsa-miR-381、hsa-miR-92a和hsa-miR-320c，4個miRNA表達下調，分別為hsa-miR-490-5p、hsa-miR-4287、evb-miR-BART8*和hcmv-miR-US25-1*。見表 1。
表1
成軟骨誘導前后差異性表達miRNAs
Table1.
miRNAs expression in chondrogenic differentiated hADSCs by microarray
對7個已有大量研究的miRNA進行靶基因預測，結果顯示大量與細胞增殖、分化、周期調控以及轉錄因子和信號傳導相關的基因都可能成為上述miRNA的潛在靶基因。在hADSCs成軟骨分化中表達上調的miRNAs靶向基因可能為CAAT/增強子結合蛋白β（CAAT/enhancer binding protein β,CAAT/EBPβ）、B細胞κ輕鏈增強核因子的抑制物α（nuclear factor of kappa light chain enhancer of activated B cells inhibitor alpha，NFKBIA或IKBA）、Sox4、絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated kinase-like protein 1，MAPK-1）、Runx2和骨形成蛋白受體2（bone morphogenic protein receptor 2，BMPR2）等。而在hADSCs成軟骨分化過程中表達下調的miR NAs靶基因可能為Sox4、Smad4、Smad5、MAPK-1和BMPR2。見表 2。
表2
部分成軟骨相關miRNAs的靶基因在線預測結果
Table2.
Predicted target genes of chondrogenic miRNAs that are related to cartilage formation and chondrogenic differentiation
3 討論
miRNA是一類短鏈的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于各種組織和器官，并在骨及軟骨發育中扮演重要角色[8, 10-15]。為了進一步研究miRNA在hADSCs成軟骨分化中的作用，我們應用miRNA微陣列芯片技術篩選成軟骨分化前后差異性表達超過2倍的miRNA。結果顯示，miR-193b、miR-199a-3p/miR-199b-3p、miR-455-3p、miR-210、miR-381、miR-92a以及miR-320c表達均明顯上調超過2倍。Han等 [16]報道miR-193b在MSCs成軟骨分化過程中表達升高。Swingler等[14]也在軟骨形成過程中和成人關節軟骨中發現miR-455-3p表達。鑒于miRNA在MSCs成軟骨分化中的重要作用，我們認為這些表達異常的miRNA可能具備改變hADSCs成軟骨分化進程的能力。
研究發現miR-140在斑馬及老鼠的軟骨發育[17-18]以及人關節軟骨發育中均有表達[19]。近期有研究發現骨關節炎患者軟骨中miR-140-5p表達明顯升高[14]。這些結果均提示miR-140在關節軟骨發育過程中具有重要作用，但在本研究中miR-140-5p僅在兩個樣本中表現出超過2倍的差異性表達。我們前期研究也未發現這些miRNAs在hADSCs成骨分化過程中明顯過表達[10]，因而我們認為這些特異miRNA在關節軟骨發育進程中可能起一定作用。
軟骨細胞的代謝受轉錄和轉錄后水平調控，miRNA作為成軟骨分化轉錄后重要的調節中介，通過結合靶基因，即轉錄因子發揮作用[8, 13, 20]。miR-199a*是miR-199a家族中的一員，是BMP-2反應性miRNA，在鼠MSCs中它可以直接靶向結合Smad1進而調節軟骨形成[19]；miR-455-3p則通過調節TGF-β信號通路抑制成軟骨分化相關的Smad2/3通路[14]。為探索特異性表達的miRNAs靶基因，我們通過miRNA靶基因預測軟件發現靶基因中包括了多種轉錄因子，如Sox5、Sox9、C/EBPβ、MAPK-1、Smad3、NF-κB、Runx2和Osterix等，功能涉及成軟骨分化、增殖、凋亡、細胞周期控制、細胞內級聯反應和自我更新等。
Xu等[20]研究發現Sox5可與miR-194聯合調控hADSCs成軟骨分化，但本研究僅1個樣本成軟骨誘導后miR-194下調2.95倍。Xu等研究認為，miR-194下調可增加Sox5表達，從而增強hADSCs成軟骨分化能力；miR-194上調則減弱其成軟骨分化能力。亦有報道Sox5和Sox9對hADSCs成軟骨分化過程中Ⅱ型膠原表達起調控作用[21]。C/EBP是亮氨酸拉鏈轉錄因子家族，其中C/EBPβ與軟骨細胞特異性基因表達有重要相關性，介導軟骨細胞對IL-1β和抵抗素作用的生物反應[22]。也有研究認為C/EBPβ能夠促進軟骨細胞從增殖期至肥大軟骨細胞轉化，敲除C/EBPβ后能延緩骨關節炎的發展[23]。因此，C/EBPβ是軟骨細胞生長分化調控和細胞退變中的重要轉錄因子。NF-κB是另一個與成軟骨分化密切相關的預測靶基因。在轉錄調控中，C/EBPβ與NF-κB能有序聯合調控軟骨細胞炎性因子的表達。NF-κB參與早期起始性的反應性正向調節，但不參與炎性因子的基礎狀態下啟動子的活性；C/EBPβ持續穩定參與炎性因子的反應性正向調節和細胞穩定期內炎性因子的表達[22-23]。這一研究理論也在上皮細胞中得到證實[24]。另外，Wehling等 [24]發現在軟骨修復中IL-1β和TNF-α通過NF-κB依賴性信號通路抑制干細胞成軟骨分化。結合以上研究結果我們認為，C/EBPβ及NF-κB在調節干細胞成軟骨分化和抑制退變中的作用不容忽視，并需深入研究。
本研究篩選出4個成軟骨誘導分化前后表達下調超過2倍的miRNA，包括miR-4287、miR-BART8*、miR-US25-1*和miR-490-5p。因目前對miR-4287、miR-BART8*和miR-US25-1*的研究有限，未能查閱到相關文獻，且反復多次對其引物的設計亦因同樣理由失敗，未對其進行靶基因預測。miR-490-5p目前多見于膀胱癌組織[25]，尚未在成軟骨分化中發現。其預測靶基因中與軟骨分化相關的有Sox2、Sox4、Smad4、Smad5、MAPK-1/7/9/12和BMPR2/7/9等。功能亦同樣涉及成軟骨細胞分化、增殖、凋亡、細胞周期控制、介導細胞內級聯反應和自我更新等。在hADSCs成軟骨分化中表達上調的miRNAs潛在靶基因和下調的miRNAs潛在靶基因有部分重合，如Sox2/4、Smad4/5、MAPK-1/9和BMP-2/7等，提示它們可能同時參與某些轉錄因子的調控。
miRNAs在成軟骨分化中的調控作用已逐漸被認識。本研究發現了一組在hADSCs成軟骨分化過程中差異性表達的miRNA，它們可能參與hADSCs成軟骨分化調控。靶基因預測發現，1個miRNA有多個靶基因，提示1個miRNA可能參與多個信號通路調節。為進一步闡明miRNAs在轉錄后水平對成軟骨分化的調控機制，后續將對miRNA預測靶基因功能進行研究，從而為定向調控hADSCs成軟骨分化及篩選組織工程改良種子細胞提供理論依據。
