引用本文： 付維力, 李棋, 李箭. 富血小板血漿制備技術及其組分的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(12): 1560-1564. doi: 10.7507/1002-1892.20140337 復制
富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）含有超過生理濃度數倍的血小板，作為一種自體血來源的產品，因獲取過程創傷較小、制備簡便及具有生物學治療潛能等方面的優點，被廣泛用于組織再生、創面修復、感染治療和功能重建等領域[1-2]。PRP不僅能釋放大量生長因子和細胞因子發揮重要的生物學修復功能，還參與了血小板凝固和纖維蛋白產生的止血和免疫應答進程。PRP發揮生物學治療作用有賴于血小板分泌的蛋白分子和血漿信號蛋白等組分。目前，對于用于臨床的PRP制備技術尚無統一標準，不同制備技術獲得的PRP所含的血小板濃度和組分也不同，導致生物學治療效果各異[3-8]。現就PRP的作用機制、制備、組分等相關研究熱點作一總結。
1 PRP的作用機制
PRP生物學作用的發揮依賴于一系列序貫發生的級聯細胞分子事件，通過多層次旁分泌/自分泌的蛋白因子介導損傷修復和組織再生過程。具體作用機制為：PRP激活后，血小板釋放大量的活性因子促進組織形成，活性因子首先錨定相關細胞的增殖和遷移，再介導炎性反應和血管發生，然后調控細胞外基質蛋白合成和組織重塑[9]。PRP能用于組織修復，與其能釋放大量信號分子構建有利于組織重建的微環境有關[10]。此外，PRP包含的生長因子和細胞因子在創傷愈合和組織重塑過程中也發揮了重要作用[11-12]。這些因子通過激活細胞表面受體來調控基因表達，介導細胞增殖、分化，以及參與基質降解和組織重建過程[13]。PRP提供的生長因子還能刺激新生血管形成，并為受損組織的再生增加血供和營養物質，尤其是血供有限和細胞更新較緩慢的肌肉骨骼組織，如軟骨、肌腱、韌帶等[14]。新生的血管將帶來新的細胞并清除受損組織的碎片。PRP促進組織愈合的生物學機制及臨床相關性見表 1。
表1
PRP的生物學機制及其臨床相關性
Table1.
The biological mechanism of PRP and their clinical correlations
2 PRP的組分
PRP中含有高濃度血小板，血小板激活后能釋放大量活性分子，以及少量的白細胞和紅細胞[25]。血小板是PRP中最主要成分，其在止血、凝血及炎性反應等生理及病理過程中發揮重要作用。PRP中血小板濃度過高或過低都不利于組織愈合，有學者提出最有利于組織愈合的血小板濃度為（1.5～3.0）×106/μL，約為全血血小板生理濃度的3～8倍 [26]。在損傷炎癥期后立即使用血小板對組織愈合可發揮最大作用，因此一些學者認為PRP給藥時機選擇的重要性甚至高于所含血小板的數量[27]。
PRP還含有對組織愈合存在潛在促進作用的其他細胞類型。CD34++細胞是來源于循環血單核細胞的一類干細胞，能為組織愈合創造最佳微環境[28]。由于白細胞對健康組織存在潛在的損傷，PRP制備時是否保留白細胞仍存在爭議。一方面，白細胞在組織重建和免疫應答過程中發揮重要功能；另一方面，白細胞可能加劇炎性反應，例如在損傷炎癥期，白細胞中的中性粒細胞產生過量的基質金屬蛋白酶和IL，可能引起肌肉損傷。中性粒細胞是對抗病原微生物和局部炎性反應主要的防御系統，它還釋放大量的蛋白酶和活性氧來對抗微生物[29]。另一類白細胞即單核-巨噬細胞，來源于循環血單核細胞，有助于組織損傷至修復過程中壞死物質的清除。白細胞如單核和多核粒細胞可錨定局部炎性反應，適當的炎性反應有利于組織修復進程；再者適當濃度的中性粒細胞還能控制感染[30]。含有一定濃度白細胞的PRP常用于預防關節置換和其他外科手術操作中可能發生的感染[31]。PRP中通常含有少量的紅細胞，紅細胞的主要功能是攜帶氧氣，有利于組織修復。
此外，PRP中的PDGF、VEGF、bFGF等蛋白濃度較高[32]，因此有學者提出含有特定濃度生長因子的PRP有利于組織修復[33]。PDGF是組織愈合初期最關鍵的生長因子，能促進相關組織細胞，尤其是干細胞、成纖維細胞和軟骨細胞的趨化和有絲分裂，還能趨化炎性細胞產生級聯生長因子釋放；TGF-β能促進細胞增殖和分化，基質合成；VEGF與內皮細胞表面受體結合后促進內皮細胞遷移和有絲分裂，刺激血管生成；HGF能協同VEGF促進血管化，但其促進骨分化作用尚不明確；bFGF和IGF在組織修復、成熟和重塑階段都發揮重要作用[34-35]。PRP中還包括促遷移、黏附、增殖和分化的細胞因子和黏附分子等，如基質細胞衍生因子1α激活介導細胞遷移和歸巢到修復區。PRP中各種生長因子在組織愈合的不同階段和不同部位發揮不同的作用，形成錯綜復雜的信號分子調控網絡。此外，PRP還能釋放一些表現抑制作用的蛋白，如TGF-β1。PRP中凝血酶的準確作用尚不明確，凝血酶是纖維蛋白原向纖維蛋白轉化的前提條件，還包括血小板分泌生長因子，有研究表明外源性凝血酶激活PRP可能降低脫鈣骨基質誘導成骨的能力[36]。纖維蛋白也是PRP重要成分，它能產生一個合適的三維結構，為修復細胞提供良好支架，有利于生長因子的分泌和組織修復，還可收縮創面，促進凝血，刺激組織再生，促進創面閉合[37]。
3 PRP的制備
3.1 PRP的分離及采集方法
PRP的制備是基于血小板濃縮過程，根據全血不同成分的密度經梯度離心分離獲得。首先無菌條件下采集自體靜脈血于抗凝管中。PRP制備中最常用的抗凝劑是枸櫞酸鈉，它是一種較弱的鈣螯合劑，可通過抑制凝血和血小板功能達到抗凝效果，用于PRP制備副作用較小[38-39]。將采集的自體靜脈血采用2次離心血漿提取法獲得PRP：第1階段為相對低速離心（100×g，離心10 min），使血漿和血小板與紅細胞和白細胞分開；第2階段為相對高速離心（400×g，離心10 min），進一步濃縮PRP和分離貧血小板血漿組分，獲得最佳的血小板濃度[40]。離心后，各成分根據比重不同分為3層：下層為紅細胞，中間層為白細胞和血小板，上層為淡黃色血漿層，吸取中間層混勻即為PRP。PRP在抗凝狀態下一般可保存8 h。但目前對是否需要進行第2階段離心仍存在爭議，部分商業化產品均無這一步驟[41]。
3.2 血小板激活載體的選擇
PRP必須通過激活血小板來釋放生長因子，因此血小板激活載體的選擇非常重要。既往研究采用牛凝血酶作為血小板激活載體，但近年研究表明其所含的抗牛凝血因子V抗體可與人凝血因子V交叉反應，引起凝血功能障礙，因此已不再使用[42]。目前較常用的血小板激活載體為氯化鈣，其優點是安全、無朊蛋白或病毒暴露風險，但激活速度較慢，活化血小板至少需要20 min[43]。近年來，自體凝血酶試劑盒被認為是安全、快速、高效的血小板激活載體，它是通過將10%氯化鈣和制備的少量PRP或血液混合裝于帶有負電荷粒子（例如玻璃纖維）的注射器中，室溫條件下孵育10～15 min，然后過濾去除細胞和纖維蛋白成分，即可作為血小板激活載體用于激活血小板。采用該方法制備的自體凝血酶，常通過雙針筒注射器與PRP同時注射[36]，經自體凝血酶活化血小板后，TGF-β1和PDGF-AB等生長因子會立即釋放[44]。
3.3 不同制備方法對PRP組分的影響
目前，對于用于臨床的PRP產品的制備技術尚無統一標準，主要涉及3個基本技術：①重力血小板封存（gravitationalplatelet sequestration，GPS）技術；②標準的細胞分離技術；③自體選擇性細胞過濾技術（血小板過濾）。不同方法制備的PRP，其組分有一定差異[45-47]。目前已有多種商業化PRP制備裝置，獲得的血小板濃度、復蘇率和組分均不相同（表 2）。任何PRP產品最終的血小板濃度取決于采集全血的體積、制備系統、離心力與溫度和時間、血小板復蘇率、懸浮一定濃度血小板的血漿體積、白細胞和/或紅細胞的相對濃度、凝血酶的沾染、保存方法與時間，此外還與患者個體因素有關，如外周靜脈血的參數、有無并發癥、年齡和循環血中生長因子和細胞組分等，如血脂高將增加血小板濃度[48-49]。
表2
PRP的制備裝置、血小板濃度、復蘇率和組分
Table2.
PRP preparation devices,platelet concentration,recovery ratio,and components
4 展望
目前，不同的制備方法和技術參數可獲得不同組分和不同濃度的PRP，為臨床醫生根據不同患者需要選擇最適合的PRP產品奠定了基礎。除了制備方法外，PRP的有效性還取決于使用方法、患者個體差異及適應證的選擇等因素。相信隨著這些問題的解決，PRP將更好地向臨床轉化。
富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）含有超過生理濃度數倍的血小板，作為一種自體血來源的產品，因獲取過程創傷較小、制備簡便及具有生物學治療潛能等方面的優點，被廣泛用于組織再生、創面修復、感染治療和功能重建等領域[1-2]。PRP不僅能釋放大量生長因子和細胞因子發揮重要的生物學修復功能，還參與了血小板凝固和纖維蛋白產生的止血和免疫應答進程。PRP發揮生物學治療作用有賴于血小板分泌的蛋白分子和血漿信號蛋白等組分。目前，對于用于臨床的PRP制備技術尚無統一標準，不同制備技術獲得的PRP所含的血小板濃度和組分也不同，導致生物學治療效果各異[3-8]。現就PRP的作用機制、制備、組分等相關研究熱點作一總結。
1 PRP的作用機制
PRP生物學作用的發揮依賴于一系列序貫發生的級聯細胞分子事件，通過多層次旁分泌/自分泌的蛋白因子介導損傷修復和組織再生過程。具體作用機制為：PRP激活后，血小板釋放大量的活性因子促進組織形成，活性因子首先錨定相關細胞的增殖和遷移，再介導炎性反應和血管發生，然后調控細胞外基質蛋白合成和組織重塑[9]。PRP能用于組織修復，與其能釋放大量信號分子構建有利于組織重建的微環境有關[10]。此外，PRP包含的生長因子和細胞因子在創傷愈合和組織重塑過程中也發揮了重要作用[11-12]。這些因子通過激活細胞表面受體來調控基因表達，介導細胞增殖、分化，以及參與基質降解和組織重建過程[13]。PRP提供的生長因子還能刺激新生血管形成，并為受損組織的再生增加血供和營養物質，尤其是血供有限和細胞更新較緩慢的肌肉骨骼組織，如軟骨、肌腱、韌帶等[14]。新生的血管將帶來新的細胞并清除受損組織的碎片。PRP促進組織愈合的生物學機制及臨床相關性見表 1。
表1
PRP的生物學機制及其臨床相關性
Table1.
The biological mechanism of PRP and their clinical correlations
2 PRP的組分
PRP中含有高濃度血小板，血小板激活后能釋放大量活性分子，以及少量的白細胞和紅細胞[25]。血小板是PRP中最主要成分，其在止血、凝血及炎性反應等生理及病理過程中發揮重要作用。PRP中血小板濃度過高或過低都不利于組織愈合，有學者提出最有利于組織愈合的血小板濃度為（1.5～3.0）×106/μL，約為全血血小板生理濃度的3～8倍 [26]。在損傷炎癥期后立即使用血小板對組織愈合可發揮最大作用，因此一些學者認為PRP給藥時機選擇的重要性甚至高于所含血小板的數量[27]。
PRP還含有對組織愈合存在潛在促進作用的其他細胞類型。CD34++細胞是來源于循環血單核細胞的一類干細胞，能為組織愈合創造最佳微環境[28]。由于白細胞對健康組織存在潛在的損傷，PRP制備時是否保留白細胞仍存在爭議。一方面，白細胞在組織重建和免疫應答過程中發揮重要功能；另一方面，白細胞可能加劇炎性反應，例如在損傷炎癥期，白細胞中的中性粒細胞產生過量的基質金屬蛋白酶和IL，可能引起肌肉損傷。中性粒細胞是對抗病原微生物和局部炎性反應主要的防御系統，它還釋放大量的蛋白酶和活性氧來對抗微生物[29]。另一類白細胞即單核-巨噬細胞，來源于循環血單核細胞，有助于組織損傷至修復過程中壞死物質的清除。白細胞如單核和多核粒細胞可錨定局部炎性反應，適當的炎性反應有利于組織修復進程；再者適當濃度的中性粒細胞還能控制感染[30]。含有一定濃度白細胞的PRP常用于預防關節置換和其他外科手術操作中可能發生的感染[31]。PRP中通常含有少量的紅細胞，紅細胞的主要功能是攜帶氧氣，有利于組織修復。
此外，PRP中的PDGF、VEGF、bFGF等蛋白濃度較高[32]，因此有學者提出含有特定濃度生長因子的PRP有利于組織修復[33]。PDGF是組織愈合初期最關鍵的生長因子，能促進相關組織細胞，尤其是干細胞、成纖維細胞和軟骨細胞的趨化和有絲分裂，還能趨化炎性細胞產生級聯生長因子釋放；TGF-β能促進細胞增殖和分化，基質合成；VEGF與內皮細胞表面受體結合后促進內皮細胞遷移和有絲分裂，刺激血管生成；HGF能協同VEGF促進血管化，但其促進骨分化作用尚不明確；bFGF和IGF在組織修復、成熟和重塑階段都發揮重要作用[34-35]。PRP中還包括促遷移、黏附、增殖和分化的細胞因子和黏附分子等，如基質細胞衍生因子1α激活介導細胞遷移和歸巢到修復區。PRP中各種生長因子在組織愈合的不同階段和不同部位發揮不同的作用，形成錯綜復雜的信號分子調控網絡。此外，PRP還能釋放一些表現抑制作用的蛋白，如TGF-β1。PRP中凝血酶的準確作用尚不明確，凝血酶是纖維蛋白原向纖維蛋白轉化的前提條件，還包括血小板分泌生長因子，有研究表明外源性凝血酶激活PRP可能降低脫鈣骨基質誘導成骨的能力[36]。纖維蛋白也是PRP重要成分，它能產生一個合適的三維結構，為修復細胞提供良好支架，有利于生長因子的分泌和組織修復，還可收縮創面，促進凝血，刺激組織再生，促進創面閉合[37]。
3 PRP的制備
3.1 PRP的分離及采集方法
PRP的制備是基于血小板濃縮過程，根據全血不同成分的密度經梯度離心分離獲得。首先無菌條件下采集自體靜脈血于抗凝管中。PRP制備中最常用的抗凝劑是枸櫞酸鈉，它是一種較弱的鈣螯合劑，可通過抑制凝血和血小板功能達到抗凝效果，用于PRP制備副作用較小[38-39]。將采集的自體靜脈血采用2次離心血漿提取法獲得PRP：第1階段為相對低速離心（100×g，離心10 min），使血漿和血小板與紅細胞和白細胞分開；第2階段為相對高速離心（400×g，離心10 min），進一步濃縮PRP和分離貧血小板血漿組分，獲得最佳的血小板濃度[40]。離心后，各成分根據比重不同分為3層：下層為紅細胞，中間層為白細胞和血小板，上層為淡黃色血漿層，吸取中間層混勻即為PRP。PRP在抗凝狀態下一般可保存8 h。但目前對是否需要進行第2階段離心仍存在爭議，部分商業化產品均無這一步驟[41]。
3.2 血小板激活載體的選擇
PRP必須通過激活血小板來釋放生長因子，因此血小板激活載體的選擇非常重要。既往研究采用牛凝血酶作為血小板激活載體，但近年研究表明其所含的抗牛凝血因子V抗體可與人凝血因子V交叉反應，引起凝血功能障礙，因此已不再使用[42]。目前較常用的血小板激活載體為氯化鈣，其優點是安全、無朊蛋白或病毒暴露風險，但激活速度較慢，活化血小板至少需要20 min[43]。近年來，自體凝血酶試劑盒被認為是安全、快速、高效的血小板激活載體，它是通過將10%氯化鈣和制備的少量PRP或血液混合裝于帶有負電荷粒子（例如玻璃纖維）的注射器中，室溫條件下孵育10～15 min，然后過濾去除細胞和纖維蛋白成分，即可作為血小板激活載體用于激活血小板。采用該方法制備的自體凝血酶，常通過雙針筒注射器與PRP同時注射[36]，經自體凝血酶活化血小板后，TGF-β1和PDGF-AB等生長因子會立即釋放[44]。
3.3 不同制備方法對PRP組分的影響
目前，對于用于臨床的PRP產品的制備技術尚無統一標準，主要涉及3個基本技術：①重力血小板封存（gravitationalplatelet sequestration，GPS）技術；②標準的細胞分離技術；③自體選擇性細胞過濾技術（血小板過濾）。不同方法制備的PRP，其組分有一定差異[45-47]。目前已有多種商業化PRP制備裝置，獲得的血小板濃度、復蘇率和組分均不相同（表 2）。任何PRP產品最終的血小板濃度取決于采集全血的體積、制備系統、離心力與溫度和時間、血小板復蘇率、懸浮一定濃度血小板的血漿體積、白細胞和/或紅細胞的相對濃度、凝血酶的沾染、保存方法與時間，此外還與患者個體因素有關，如外周靜脈血的參數、有無并發癥、年齡和循環血中生長因子和細胞組分等，如血脂高將增加血小板濃度[48-49]。
表2
PRP的制備裝置、血小板濃度、復蘇率和組分
Table2.
PRP preparation devices,platelet concentration,recovery ratio,and components
4 展望
目前，不同的制備方法和技術參數可獲得不同組分和不同濃度的PRP，為臨床醫生根據不同患者需要選擇最適合的PRP產品奠定了基礎。除了制備方法外，PRP的有效性還取決于使用方法、患者個體差異及適應證的選擇等因素。相信隨著這些問題的解決，PRP將更好地向臨床轉化。
