引用本文： 徐練, 孔清泉. 調控成骨細胞分化及骨形成關鍵信號通路的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(12): 1484-1489. doi: 10.7507/1002-1892.20140321 復制
成骨細胞是人體骨組織的重要組成成分，也是參與骨形成的主要功能細胞，在骨骼生長發育及骨量維持方面扮演著關鍵角色。它來源于具有多向分化潛能的MSCs，經細胞增殖、細胞外基質合成、成熟及礦化后最終發展成為骨細胞，從而促進骨形成及維持骨量。從分子生物學水平上看，目前已知多條信號通路參與了成骨細胞分化過程的調節，其中最重要的信號通路包括BMP-Smads、Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）、Notch、Hedgehog、FGF等。這些信號通路在調控成骨細胞分化及骨生成方面起著重要作用，一旦其中一條或數條信號通路調節受阻，都會引起成骨細胞分化異常或骨形成障礙，進而導致相應骨代謝疾病的發生，如骨質疏松癥、骨硬化癥等。因此，為了更好地認識和治療這類疾患，闡明這些信號通路在調節成骨細胞分化及骨形成方面的作用機制及規律具有重要意義。現對成骨細胞分化及骨形成過程中起關鍵調節作用的信號通路的相關研究進展作一綜述，為下一步研究奠定基礎。
1 概述
成骨細胞作為骨形成的主要功能細胞，在分化成熟過程中會逐步表達如ALP、骨鈣素、血清Ⅰ型前膠原C端肽等特異性標志物。同時，在此過程中也會受到一系列轉錄因子的調控，如Runt相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、Osterix/Sp7、β-catenin、轉錄激活因子4、核轉錄因子激活蛋白1、Smads等，它們彼此協同作用，共同參與調節成骨細胞分化及骨形成。其中，核心結合因子α1/Runx2（core binding factorα1/ Runx2，Cbfα1/Runx2）及Osterix/Sp7作為成骨特異性轉錄因子，在成骨細胞分化及骨形成過程中起關鍵調控作用[1]。因而，Runx2及Osterix也被認為是成骨分化調控網絡的關鍵節點，參與組成該網絡的各條信號通路都直接或間接作用于該節點，并最終調控其下游靶基因的表達，從而調節成骨細胞分化及骨形成[2]
2 成骨細胞分化及骨形成關鍵信號通路
2.1 BMP-Smads信號通路
表達或激活成骨細胞分化及骨形成的關鍵轉錄因子（如Runx2）需多條信號通路共同參與調控。其中，BMP-Smads信號通路是最重要、也是最早發現和確認的一條通路。20世紀80年代有學者首次從牛骨中分離提取了BMPs類物質，將其植入小鼠體內后成功誘導出異位成骨模型[3]。隨后，BMPs被證實是TGF-β超家族中的重要成員，該家族成員還包括TGF-β、細胞活素等，其受體均為絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。TGF-β超家族通過作用于下游的信號分子（如Smads）發揮生物學功能。目前，已發現超過20種BMPs，其在胚胎發育、器官形成及細胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程中具有廣泛且重要的生物學作用[4-6]。有關BMPs，尤其是BMP-2、4、5、6、7、 9等，在MSCs成骨及成脂分化中的調節作用是目前研究熱點之一[7-9]。
研究表明，在成骨分化及骨形成方面，BMPs扮演著重要角色[10]。多數學者認為BMPs是骨形態發生最早期的信號分子，對成骨細胞分化及骨形成具有特異性誘導作用[11]。分子遺傳學研究表明，內源性或外源性BMPs通過結合細胞膜上特異性受體——BMP受體Ⅰ（BMP receptorⅠ，BMPR-Ⅰ）及BMPR-Ⅱ，使BMPR-Ⅰ磷酸化，再與BMPs特異作用的Smads蛋白（如Smad1、5、8）結合并使其也發生磷酸化，然后進入細胞核，繼而啟動并激活成骨細胞特異性轉錄因子（如Cbfα1/Runx2、Osterix/Sp7等），從而誘導MSCs向成骨細胞分化及骨形成[12-14]。在此過程中，BMP-Smads信號通路受多種細胞因子調控，其中Smurf蛋白最重要。該蛋白是E3連接酶中的重要成員，包括Smurf1和Smurf2，其中Smurf1是BMP-Smads信號通路負性調節因子，可介導BMPR-Ⅰ的調節，還能特異性識別和結合Runx2及Smad1，促使它們泛素化并被26S蛋白酶體識別和降解，進而負向調節BMP-Smads信號通路，從而抑制成骨細胞分化及骨形成[15]。
總之，BMP-Smads信號通路是參與調控MSCs向成骨細胞分化及骨形成的關鍵信號通路之一，同時其自身也受到多種細胞因子的調節，從而在生物體內形成了復雜調控網絡。明確其作用機制有助于對成骨細胞分化異常或骨形成障礙性疾患有更深刻認識，為臨床上治療該類疾病提供新的治療策略。
2.2 Wnt/β-catenin信號通路
Wnt/β-catenin信號通路在調節MSCs向成骨細胞分化及骨形成方面同樣具有重要作用[16]。Wnt基因最初是由Nusse等[17]在小鼠乳腺癌病毒誘導的小鼠乳腺癌組織中分離并克隆出的一種原癌基因。迄今為止，已發現人類19種Wnt基因。其編碼的Wnt蛋白家族由信號肽及23～24個位置保守的半胱氨酸殘基組成，在多種組織中廣泛表達，并且在進化上高度保守[18]。研究發現，Wnt信號通路參與調控許多生物學活動，有抑制脂肪形成而促進骨形成的作用，并與腫瘤發生密切相關[19]。Wnt信號通路根據是否有β-catenin參與分為經典和非經典信號通路。其中，在骨生長發育及骨代謝方面，經典Wnt信號通路（即Wnt/β-catenin通路）對成骨細胞的作用是研究熱點。經典Wnt信號通路由Wnt配體及其對應受體以及細胞內信號分子等組成，其成員主要包括膜外Wnt蛋白（配體）、卷曲蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白（low density lipoprotein receptor related protein，LRP）5/6（細胞膜共受體）、胞質內散亂蛋白、β-catenin、肌酸激酶1、糖原合酶激酶3β、軸蛋白2、大腸腺瘤樣蛋白、T細胞因子/淋巴增強因子、下游靶基因（如cylinD1、c-myc、Runx2、Osterix等），以及與Wnt/β-catenin信號通路相關的因子，如Dkks（Dickkopfs）、分泌型卷曲相關蛋白、TGF-β等。它們分別對成骨細胞的分化增殖及骨生成起著重要調節作用[20]。分子遺傳學研究表明，當細胞外缺乏Wnt蛋白時，軸蛋白2、糖原合酶激酶3β、大腸腺瘤樣蛋白、肌酸激酶1等組成復合體，該復合體可降解β-catenin，進而阻斷Wnt/β-catenin信號通路，使成骨細胞增殖、分化受阻；當細胞外有Wnt蛋白時，Wnt/β-catenin信號通路則被激活，此時糖原合酶激酶3β活性受到抑制，促使β-catenin在細胞內大量聚集并進入細胞核內，繼而啟動下游靶基因的表達，從而促進成骨細胞分化及成熟[21-23]。
此外，大量體內外研究表明，經典Wnt信號通路在骨代謝調節過程中也扮演著重要角色[24-25]。例如，LRP5作為Wnt/β-catenin信號通路重要成員，其基因突變時可導致骨代謝失調，從而嚴重影響骨量平衡[26]。當LRP5功能獲得性突變時，可致人體出現高骨量表型，活組織檢查表現為骨小梁體積增加及髓內脂肪組織減少；相反，當LRP5功能缺失性突變時，會致人體出現低骨量表型，活組織檢查表現為骨量丟失及髓內脂肪增加。分子遺傳學研究表明，LRP5功能缺失性突變是導致臨床上一種罕見疾病骨質疏松-假性神經膠質瘤綜合征發生的根本原因[27]，相關體外實驗以及動物模型研究也得出了相同結論[28-29]。體外研究表明，轉導活化的LRP5進入經Wnt3a預先處理過的hMSCs（hMSC-LRP5 T253）后，細胞內ALP表達明顯增多，而脂滴形成減少；將該細胞復合于羥基磷灰石/磷酸三鈣并植于小鼠皮下后，發現細胞-支架復合物下有礦化骨形成；而轉導失活的LRP5（hMSCs-LRP5 T244）則可觀察到相反結果[30]。研究表明[31]，LRP5能通過上調Cbfα1/Runx2及ALP的表達促進MSCs向成骨細胞分化，同時下調CCAAT增強子結合蛋白α及過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達來抑制脂肪形成。其次，β-catenin作為Wnt信號通路的關鍵信號蛋白，對小鼠出生后骨骼發育及骨量維持也具有十分重要作用。β-catenin基因突變可引起小鼠骨量減少及破骨細胞數量增加[19, 32]。通過選擇性敲除向成骨細胞系分化的MSCs內β-catenin基因可致異位軟骨細胞形成，并且抑制正常成骨[33]。此外，Wnt/β-catenin信號通路的相關拮抗劑，如Dkks、 分泌型卷曲相關蛋白、Wnt抑制因子1、骨硬化蛋白等也可通過作用于Wnts、Fzd及LRP5/6等受體或配體，間接調節骨量及成骨分化[22]。
與BMP-Smads信號通路類似，經典Wnt信號通路在調節成骨細胞分化及骨形成方面最終也是通過作用于Runx2起作用。Hill等[34]的研究表明，Runx2基因啟動子序列包含一個TCF作用元件，它能將β-catenin及TCF1募集到該位點，繼而啟動Runx2及下游靶基因的表達，從而調節成骨細胞分化及骨形成。此外，Kang等[35]的研究表明，在MSCs中短暫激活Wnt/β-catenin信號通路可抑制成脂特異性轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達，并誘導成骨相關轉錄因子Dlx5、Osx的表達以促進成骨。
2.3 Notch信號通路
研究發現，在調節細胞增殖、分化及凋亡等一系列生理病理過程中，除上述通路外，Notch信號通路也具有重要作用，尤其表現在MSCs向成骨細胞分化及骨形成過程中[36-38]。Notch信號通路主要成員包括Notch受體、配體、CSL蛋白以及Notch信號的效應分子。其中，Notch本身是一類在進化上高度保守的受體蛋白，在哺乳動物中Notch受體的同源分子有4種，分別為Notch1、2、3、4。配體同源分子目前已知有5 種，分別為Delta1、3、4以及Jagged1、2。Notch信號效應分子主要為HES，該家族包含6個成員，其中HES1與HES5在Notch信號通路中發揮主要作用[39-40]。分子遺傳學研究表明，當Notch受體與相鄰細胞表面的配體結合后，Notch信號通路即被激活，此時Notch受體分別在TACE及γ-分泌酶的作用下相繼發生兩次蛋白水解，釋放出Notch受體胞內活性片段（Notch intracellular domain，NICD），并轉移至細胞核內與CSL蛋白（一種DNA結合蛋白）及其共活化因子MAML結合，從而激活并啟動其下游靶基因（如HES、HEY等）的表達[41-42]。
目前，Notch信號通路在調節MSCs向成骨細胞分化過程中的重要作用，已在多種體內外模型中得到印證。Ugarte等[43]的研究表明，Notch信號通路在體外具有誘導和抑制成骨細胞分化的雙向調節作用。Zanotti等[44]研究發現，Notch信號通路具有抑制成骨細胞分化以及降低骨量的作用。Engin等[45]通過轉基因小鼠實驗證實，當成骨細胞中過表達NICD信號可致骨質密集或硬化骨形成，而當γ-分泌酶（Notch通路關鍵酶）基因發生突變時，可引起遲發型年齡相關性骨質疏松癥。其中，導致硬化骨形成的原因不是由于降低了破骨細胞活性，而是提高了未成熟成骨細胞的增殖、分化能力；同樣，Notch功能缺失型小鼠發生骨質疏松的原因也不是因提高了破骨細胞的活性，而是成骨細胞增殖分化能力下降所致。Watanabe等[46]認為，Notch信號通路能提高成骨細胞增殖能力，可能是通過轉錄激活Osterix/Sp7啟動子，以及上調細胞周期蛋白D和周期蛋白E來實現的，還可通過結合Runx2來抑制成骨細胞成熟。Hilton等[47]通過免疫共沉淀實驗表明，瞬時轉染NICD、HES及HEY的MSCs均可通過降低Runx2生物活性而抑制成骨。
此外，Notch信號通路還參與調節BMP及Wnt信號誘導的成骨細胞分化及骨形成。例如，Deregowski等[48]報道，在MSCs中NICD過度表達可導致BMP-2及Wnt3α對ALP活性起抑制作用。Zamurovic等[49]報道，Notch的目的基因HEYl在成骨細胞前體MC3B細胞株中可以被BMP-2誘導。總之，Notch信號通路可通過多種途徑直接或間接地參與調控成骨細胞分化及骨形成。
2.4 Hedgehog信號通路
Hedgehog基因最早由Lee等于1980年從果蠅胚胎體內分離得到，目前已被證實是一種高度保守基因，該基因突變時可致果蠅胚胎發育成毛團狀，酷似刺猬，故又被稱為刺猬基因。其編碼的Hedgehog蛋白是一類分泌型信號蛋白，在哺乳動物體內Hedgehog蛋白家族主要包括3種同源蛋白，即Indian hedgehog（Ihh）、Sonic hedgehog（Shh）及Desert hedgehog（Dhh）[50]。分子遺傳學研究表明，Hedgehog信號通路與其他信號通路類似，也是由Hedgehog相應配體（Ihh、Shh、Dhh）、受體（Patched/Ptc、Smoothened/Smo）及細胞內信號分子（Cos2/Kif7、Fu、Ci/Gli）等組成[51]。當Hedgehog蛋白與細胞膜上特殊受體Ptc結合時，Smo得以活化，活化的Smo與Cos2、Fu結合形成復合物，該復合物可激活鋅指蛋白家族Ci/Gli，促使它們進入核內聚集并激活轉錄，從而啟動下游靶基因（如Cyclin D/E、HIP、Myc等）的表達。
既往研究顯示[52-53]，Hedgehog信號通路在胚胎發育及腫瘤發生過程中扮演著重要角色，它在調節各種組織器官的生長發育及形態功能上具有獨特的生物學功能。近期研究發現[54-55]，Hedgehog信號通路在調節細胞增殖、分化過程中亦具有十分重要作用；其中以研究Hedgehog通路在MSCs增殖、分化過程中的調控作用較多。該信號通路主要參與促進MSCs向成骨細胞及軟骨細胞分化，而阻止其向脂肪細胞分化[56]。在成骨細胞分化方面，Ihh及Shh是調控肢體發育及成骨細胞分化的重要信號分子。其中，Shh是成骨細胞分化早期的關鍵信號之一，而Ihh主要在后期參與分化的調控[57-58]。也有研究表明，Shh能促進間充質細胞系C3H10T1/2及前成骨細胞系MC3T3-E1合成及表達ALP；而Ihh參與了軟骨內成骨的調節[59-60]。此外，Shimoyama等[61]報道，Hedgehog信號通路中的Gli2蛋白也與MSCs成骨分化密切相關。Gli2過度表達能誘導ALP、骨鈣素的表達，使MSCs鈣化；經Ihh處理或使Gli2過度表達后能使MSCs的Runx2的表達上調，而經同樣處理的Runx2缺陷MSCs則不能增加ALP活性；在未敲除Runx2的MSCs中，顯型陰性的Gli2可明顯抑制Ihh誘導的成骨分化。由此表明Ihh是通過Gli2上調Runx2的表達來調控成骨細胞分化。
總之，Hedgehog信號通路不僅在胚胎發育及腫瘤發生過程中扮演著重要角色，同時也可通過間接調控Runx2的表達來調節成骨細胞分化及骨形成等，因而也被視作調控成骨細胞分化及骨形成關鍵信號通路之一，但其具體調節機制目前還未完全闡明，仍需進一步研究。
2.5 FGF信號通路
FGFs家族是一類由23種基因編碼的結構相關的分泌性蛋白。目前研究顯示，FGF通過與細胞表面的特異性受體FGFR（FGFR1～5）結合，使FGFR發生二聚化，并促使FGFR胞內酪氨酸殘基磷酸化，再通過相應機制活化并啟動其下游信號轉導路徑，如Ras、絲裂原活化蛋白激酶、3-磷脂酰肌醇激酶/蘇氨酸激酶、蛋白激酶C等，將細胞外信號傳遞至細胞內，從而激活下游靶基因的表達[62]。研究表明，FGF信號通路參與了胚胎發育及多種細胞生物學活動的調節，對細胞的增殖、分化、凋亡起著重要的調控作用[63]。其中，關于骨骼系統，Marie等[64]報道FGF信號通路對出生前后骨骼系統的發育具有重要的調節作用。因此，探明FGF信號通路在成骨細胞分化及骨代謝中的調節機制已逐漸成為一個新的研究熱點，特別是在細胞及分子學水平上揭示其作用機制，對深入研究相關骨代謝疾病的發病機制具有重要意義。
Su等[65]報道，FGF可刺激多種細胞系的增殖及分化，其中包括成骨前體細胞及MSCs等。Fei等[66]報道，FGF-2作為FGFs家族的重要成員之一，可由成骨細胞合成并表達，然后存儲于細胞外基質，其對成骨細胞分化及骨形成具有正向調節作用。也有研究顯示[67]，FGF-2可誘導人MSCs中ALP的表達，但并不改變骨鈣素mRNA的表達水平，表明FGF-2可能參與了成骨細胞分化早期的調節。此外，針對小鼠及人類的細胞及遺傳學研究證實，FGF信號通路可通過募集與活化成軟骨細胞及成骨細胞系來調控軟骨生成、成骨細胞分化及骨形成等[68-69]。最新研究發現，FGF信號通路也可通過激活Runx2及BMP-2的表達來調控成骨分化及骨形成。例如，Kodama等[70]通過凝膠系統持續向小鼠體內釋放人重組FGF-2，結果顯示實驗組小鼠的下頜骨體積較對照組大1.5倍，且分化的成骨細胞數目較對照組增多，Runx2及BMP-2的表達也明顯提高。Agas等[71]通過培養敲除FGF-2基因的小鼠MSCs，發現細胞中Runx2 mRNA表達明顯下調，而加入FGF-2后Runx2 mRNA表達則明顯提高。此外，Kim等[72]通過研究證實，FGF-2可誘導Runx2發生磷酸化并活化，從而調節成骨細胞分化。
以上研究結果表明，FGF信號通路不但對胚胎發育及細胞增殖、分化、凋亡起著重要調控作用；而且對成骨細胞分化及骨形成也具有關鍵作用，并且也可間接調節Runx2及BMP-2的表達，從而與上述其他信號通路組成復雜的調控網絡，共同參與成骨細胞分化及骨形成的調節。
3 小結
綜上述，成骨細胞分化及骨形成受諸如BMP、Wnt、Notch、Hedgehog、FGF等多條關鍵信號通路的調節，它們通過直接或間接作用于Runx2或Osterix等關鍵轉錄因子而彼此相互聯系，相互影響，從而組成了錯綜復雜的調控網絡，協同參與成骨細胞分化及骨形成的調節。盡管目前對相關信號通路的研究較多，并且也取得了一些重大研究成果，但有關各信號通路在調控成骨細胞分化及骨形成方面的確切分子機制及相互作用方式仍不十分明了。相信隨著有關研究的進一步深入，有望徹底揭開成骨細胞分化及骨形成過程的完整分子機制，從而為臨床有效防治與成骨分化及骨形成異常相關的疾病（如骨質疏松癥、異位骨化等）提供新的理論依據與治療靶點。
成骨細胞是人體骨組織的重要組成成分，也是參與骨形成的主要功能細胞，在骨骼生長發育及骨量維持方面扮演著關鍵角色。它來源于具有多向分化潛能的MSCs，經細胞增殖、細胞外基質合成、成熟及礦化后最終發展成為骨細胞，從而促進骨形成及維持骨量。從分子生物學水平上看，目前已知多條信號通路參與了成骨細胞分化過程的調節，其中最重要的信號通路包括BMP-Smads、Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）、Notch、Hedgehog、FGF等。這些信號通路在調控成骨細胞分化及骨生成方面起著重要作用，一旦其中一條或數條信號通路調節受阻，都會引起成骨細胞分化異常或骨形成障礙，進而導致相應骨代謝疾病的發生，如骨質疏松癥、骨硬化癥等。因此，為了更好地認識和治療這類疾患，闡明這些信號通路在調節成骨細胞分化及骨形成方面的作用機制及規律具有重要意義。現對成骨細胞分化及骨形成過程中起關鍵調節作用的信號通路的相關研究進展作一綜述，為下一步研究奠定基礎。
1 概述
成骨細胞作為骨形成的主要功能細胞，在分化成熟過程中會逐步表達如ALP、骨鈣素、血清Ⅰ型前膠原C端肽等特異性標志物。同時，在此過程中也會受到一系列轉錄因子的調控，如Runt相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、Osterix/Sp7、β-catenin、轉錄激活因子4、核轉錄因子激活蛋白1、Smads等，它們彼此協同作用，共同參與調節成骨細胞分化及骨形成。其中，核心結合因子α1/Runx2（core binding factorα1/ Runx2，Cbfα1/Runx2）及Osterix/Sp7作為成骨特異性轉錄因子，在成骨細胞分化及骨形成過程中起關鍵調控作用[1]。因而，Runx2及Osterix也被認為是成骨分化調控網絡的關鍵節點，參與組成該網絡的各條信號通路都直接或間接作用于該節點，并最終調控其下游靶基因的表達，從而調節成骨細胞分化及骨形成[2]
2 成骨細胞分化及骨形成關鍵信號通路
2.1 BMP-Smads信號通路
表達或激活成骨細胞分化及骨形成的關鍵轉錄因子（如Runx2）需多條信號通路共同參與調控。其中，BMP-Smads信號通路是最重要、也是最早發現和確認的一條通路。20世紀80年代有學者首次從牛骨中分離提取了BMPs類物質，將其植入小鼠體內后成功誘導出異位成骨模型[3]。隨后，BMPs被證實是TGF-β超家族中的重要成員，該家族成員還包括TGF-β、細胞活素等，其受體均為絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。TGF-β超家族通過作用于下游的信號分子（如Smads）發揮生物學功能。目前，已發現超過20種BMPs，其在胚胎發育、器官形成及細胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程中具有廣泛且重要的生物學作用[4-6]。有關BMPs，尤其是BMP-2、4、5、6、7、 9等，在MSCs成骨及成脂分化中的調節作用是目前研究熱點之一[7-9]。
研究表明，在成骨分化及骨形成方面，BMPs扮演著重要角色[10]。多數學者認為BMPs是骨形態發生最早期的信號分子，對成骨細胞分化及骨形成具有特異性誘導作用[11]。分子遺傳學研究表明，內源性或外源性BMPs通過結合細胞膜上特異性受體——BMP受體Ⅰ（BMP receptorⅠ，BMPR-Ⅰ）及BMPR-Ⅱ，使BMPR-Ⅰ磷酸化，再與BMPs特異作用的Smads蛋白（如Smad1、5、8）結合并使其也發生磷酸化，然后進入細胞核，繼而啟動并激活成骨細胞特異性轉錄因子（如Cbfα1/Runx2、Osterix/Sp7等），從而誘導MSCs向成骨細胞分化及骨形成[12-14]。在此過程中，BMP-Smads信號通路受多種細胞因子調控，其中Smurf蛋白最重要。該蛋白是E3連接酶中的重要成員，包括Smurf1和Smurf2，其中Smurf1是BMP-Smads信號通路負性調節因子，可介導BMPR-Ⅰ的調節，還能特異性識別和結合Runx2及Smad1，促使它們泛素化并被26S蛋白酶體識別和降解，進而負向調節BMP-Smads信號通路，從而抑制成骨細胞分化及骨形成[15]。
總之，BMP-Smads信號通路是參與調控MSCs向成骨細胞分化及骨形成的關鍵信號通路之一，同時其自身也受到多種細胞因子的調節，從而在生物體內形成了復雜調控網絡。明確其作用機制有助于對成骨細胞分化異常或骨形成障礙性疾患有更深刻認識，為臨床上治療該類疾病提供新的治療策略。
2.2 Wnt/β-catenin信號通路
Wnt/β-catenin信號通路在調節MSCs向成骨細胞分化及骨形成方面同樣具有重要作用[16]。Wnt基因最初是由Nusse等[17]在小鼠乳腺癌病毒誘導的小鼠乳腺癌組織中分離并克隆出的一種原癌基因。迄今為止，已發現人類19種Wnt基因。其編碼的Wnt蛋白家族由信號肽及23～24個位置保守的半胱氨酸殘基組成，在多種組織中廣泛表達，并且在進化上高度保守[18]。研究發現，Wnt信號通路參與調控許多生物學活動，有抑制脂肪形成而促進骨形成的作用，并與腫瘤發生密切相關[19]。Wnt信號通路根據是否有β-catenin參與分為經典和非經典信號通路。其中，在骨生長發育及骨代謝方面，經典Wnt信號通路（即Wnt/β-catenin通路）對成骨細胞的作用是研究熱點。經典Wnt信號通路由Wnt配體及其對應受體以及細胞內信號分子等組成，其成員主要包括膜外Wnt蛋白（配體）、卷曲蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白（low density lipoprotein receptor related protein，LRP）5/6（細胞膜共受體）、胞質內散亂蛋白、β-catenin、肌酸激酶1、糖原合酶激酶3β、軸蛋白2、大腸腺瘤樣蛋白、T細胞因子/淋巴增強因子、下游靶基因（如cylinD1、c-myc、Runx2、Osterix等），以及與Wnt/β-catenin信號通路相關的因子，如Dkks（Dickkopfs）、分泌型卷曲相關蛋白、TGF-β等。它們分別對成骨細胞的分化增殖及骨生成起著重要調節作用[20]。分子遺傳學研究表明，當細胞外缺乏Wnt蛋白時，軸蛋白2、糖原合酶激酶3β、大腸腺瘤樣蛋白、肌酸激酶1等組成復合體，該復合體可降解β-catenin，進而阻斷Wnt/β-catenin信號通路，使成骨細胞增殖、分化受阻；當細胞外有Wnt蛋白時，Wnt/β-catenin信號通路則被激活，此時糖原合酶激酶3β活性受到抑制，促使β-catenin在細胞內大量聚集并進入細胞核內，繼而啟動下游靶基因的表達，從而促進成骨細胞分化及成熟[21-23]。
此外，大量體內外研究表明，經典Wnt信號通路在骨代謝調節過程中也扮演著重要角色[24-25]。例如，LRP5作為Wnt/β-catenin信號通路重要成員，其基因突變時可導致骨代謝失調，從而嚴重影響骨量平衡[26]。當LRP5功能獲得性突變時，可致人體出現高骨量表型，活組織檢查表現為骨小梁體積增加及髓內脂肪組織減少；相反，當LRP5功能缺失性突變時，會致人體出現低骨量表型，活組織檢查表現為骨量丟失及髓內脂肪增加。分子遺傳學研究表明，LRP5功能缺失性突變是導致臨床上一種罕見疾病骨質疏松-假性神經膠質瘤綜合征發生的根本原因[27]，相關體外實驗以及動物模型研究也得出了相同結論[28-29]。體外研究表明，轉導活化的LRP5進入經Wnt3a預先處理過的hMSCs（hMSC-LRP5 T253）后，細胞內ALP表達明顯增多，而脂滴形成減少；將該細胞復合于羥基磷灰石/磷酸三鈣并植于小鼠皮下后，發現細胞-支架復合物下有礦化骨形成；而轉導失活的LRP5（hMSCs-LRP5 T244）則可觀察到相反結果[30]。研究表明[31]，LRP5能通過上調Cbfα1/Runx2及ALP的表達促進MSCs向成骨細胞分化，同時下調CCAAT增強子結合蛋白α及過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達來抑制脂肪形成。其次，β-catenin作為Wnt信號通路的關鍵信號蛋白，對小鼠出生后骨骼發育及骨量維持也具有十分重要作用。β-catenin基因突變可引起小鼠骨量減少及破骨細胞數量增加[19, 32]。通過選擇性敲除向成骨細胞系分化的MSCs內β-catenin基因可致異位軟骨細胞形成，并且抑制正常成骨[33]。此外，Wnt/β-catenin信號通路的相關拮抗劑，如Dkks、 分泌型卷曲相關蛋白、Wnt抑制因子1、骨硬化蛋白等也可通過作用于Wnts、Fzd及LRP5/6等受體或配體，間接調節骨量及成骨分化[22]。
與BMP-Smads信號通路類似，經典Wnt信號通路在調節成骨細胞分化及骨形成方面最終也是通過作用于Runx2起作用。Hill等[34]的研究表明，Runx2基因啟動子序列包含一個TCF作用元件，它能將β-catenin及TCF1募集到該位點，繼而啟動Runx2及下游靶基因的表達，從而調節成骨細胞分化及骨形成。此外，Kang等[35]的研究表明，在MSCs中短暫激活Wnt/β-catenin信號通路可抑制成脂特異性轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達，并誘導成骨相關轉錄因子Dlx5、Osx的表達以促進成骨。
2.3 Notch信號通路
研究發現，在調節細胞增殖、分化及凋亡等一系列生理病理過程中，除上述通路外，Notch信號通路也具有重要作用，尤其表現在MSCs向成骨細胞分化及骨形成過程中[36-38]。Notch信號通路主要成員包括Notch受體、配體、CSL蛋白以及Notch信號的效應分子。其中，Notch本身是一類在進化上高度保守的受體蛋白，在哺乳動物中Notch受體的同源分子有4種，分別為Notch1、2、3、4。配體同源分子目前已知有5 種，分別為Delta1、3、4以及Jagged1、2。Notch信號效應分子主要為HES，該家族包含6個成員，其中HES1與HES5在Notch信號通路中發揮主要作用[39-40]。分子遺傳學研究表明，當Notch受體與相鄰細胞表面的配體結合后，Notch信號通路即被激活，此時Notch受體分別在TACE及γ-分泌酶的作用下相繼發生兩次蛋白水解，釋放出Notch受體胞內活性片段（Notch intracellular domain，NICD），并轉移至細胞核內與CSL蛋白（一種DNA結合蛋白）及其共活化因子MAML結合，從而激活并啟動其下游靶基因（如HES、HEY等）的表達[41-42]。
目前，Notch信號通路在調節MSCs向成骨細胞分化過程中的重要作用，已在多種體內外模型中得到印證。Ugarte等[43]的研究表明，Notch信號通路在體外具有誘導和抑制成骨細胞分化的雙向調節作用。Zanotti等[44]研究發現，Notch信號通路具有抑制成骨細胞分化以及降低骨量的作用。Engin等[45]通過轉基因小鼠實驗證實，當成骨細胞中過表達NICD信號可致骨質密集或硬化骨形成，而當γ-分泌酶（Notch通路關鍵酶）基因發生突變時，可引起遲發型年齡相關性骨質疏松癥。其中，導致硬化骨形成的原因不是由于降低了破骨細胞活性，而是提高了未成熟成骨細胞的增殖、分化能力；同樣，Notch功能缺失型小鼠發生骨質疏松的原因也不是因提高了破骨細胞的活性，而是成骨細胞增殖分化能力下降所致。Watanabe等[46]認為，Notch信號通路能提高成骨細胞增殖能力，可能是通過轉錄激活Osterix/Sp7啟動子，以及上調細胞周期蛋白D和周期蛋白E來實現的，還可通過結合Runx2來抑制成骨細胞成熟。Hilton等[47]通過免疫共沉淀實驗表明，瞬時轉染NICD、HES及HEY的MSCs均可通過降低Runx2生物活性而抑制成骨。
此外，Notch信號通路還參與調節BMP及Wnt信號誘導的成骨細胞分化及骨形成。例如，Deregowski等[48]報道，在MSCs中NICD過度表達可導致BMP-2及Wnt3α對ALP活性起抑制作用。Zamurovic等[49]報道，Notch的目的基因HEYl在成骨細胞前體MC3B細胞株中可以被BMP-2誘導。總之，Notch信號通路可通過多種途徑直接或間接地參與調控成骨細胞分化及骨形成。
2.4 Hedgehog信號通路
Hedgehog基因最早由Lee等于1980年從果蠅胚胎體內分離得到，目前已被證實是一種高度保守基因，該基因突變時可致果蠅胚胎發育成毛團狀，酷似刺猬，故又被稱為刺猬基因。其編碼的Hedgehog蛋白是一類分泌型信號蛋白，在哺乳動物體內Hedgehog蛋白家族主要包括3種同源蛋白，即Indian hedgehog（Ihh）、Sonic hedgehog（Shh）及Desert hedgehog（Dhh）[50]。分子遺傳學研究表明，Hedgehog信號通路與其他信號通路類似，也是由Hedgehog相應配體（Ihh、Shh、Dhh）、受體（Patched/Ptc、Smoothened/Smo）及細胞內信號分子（Cos2/Kif7、Fu、Ci/Gli）等組成[51]。當Hedgehog蛋白與細胞膜上特殊受體Ptc結合時，Smo得以活化，活化的Smo與Cos2、Fu結合形成復合物，該復合物可激活鋅指蛋白家族Ci/Gli，促使它們進入核內聚集并激活轉錄，從而啟動下游靶基因（如Cyclin D/E、HIP、Myc等）的表達。
既往研究顯示[52-53]，Hedgehog信號通路在胚胎發育及腫瘤發生過程中扮演著重要角色，它在調節各種組織器官的生長發育及形態功能上具有獨特的生物學功能。近期研究發現[54-55]，Hedgehog信號通路在調節細胞增殖、分化過程中亦具有十分重要作用；其中以研究Hedgehog通路在MSCs增殖、分化過程中的調控作用較多。該信號通路主要參與促進MSCs向成骨細胞及軟骨細胞分化，而阻止其向脂肪細胞分化[56]。在成骨細胞分化方面，Ihh及Shh是調控肢體發育及成骨細胞分化的重要信號分子。其中，Shh是成骨細胞分化早期的關鍵信號之一，而Ihh主要在后期參與分化的調控[57-58]。也有研究表明，Shh能促進間充質細胞系C3H10T1/2及前成骨細胞系MC3T3-E1合成及表達ALP；而Ihh參與了軟骨內成骨的調節[59-60]。此外，Shimoyama等[61]報道，Hedgehog信號通路中的Gli2蛋白也與MSCs成骨分化密切相關。Gli2過度表達能誘導ALP、骨鈣素的表達，使MSCs鈣化；經Ihh處理或使Gli2過度表達后能使MSCs的Runx2的表達上調，而經同樣處理的Runx2缺陷MSCs則不能增加ALP活性；在未敲除Runx2的MSCs中，顯型陰性的Gli2可明顯抑制Ihh誘導的成骨分化。由此表明Ihh是通過Gli2上調Runx2的表達來調控成骨細胞分化。
總之，Hedgehog信號通路不僅在胚胎發育及腫瘤發生過程中扮演著重要角色，同時也可通過間接調控Runx2的表達來調節成骨細胞分化及骨形成等，因而也被視作調控成骨細胞分化及骨形成關鍵信號通路之一，但其具體調節機制目前還未完全闡明，仍需進一步研究。
2.5 FGF信號通路
FGFs家族是一類由23種基因編碼的結構相關的分泌性蛋白。目前研究顯示，FGF通過與細胞表面的特異性受體FGFR（FGFR1～5）結合，使FGFR發生二聚化，并促使FGFR胞內酪氨酸殘基磷酸化，再通過相應機制活化并啟動其下游信號轉導路徑，如Ras、絲裂原活化蛋白激酶、3-磷脂酰肌醇激酶/蘇氨酸激酶、蛋白激酶C等，將細胞外信號傳遞至細胞內，從而激活下游靶基因的表達[62]。研究表明，FGF信號通路參與了胚胎發育及多種細胞生物學活動的調節，對細胞的增殖、分化、凋亡起著重要的調控作用[63]。其中，關于骨骼系統，Marie等[64]報道FGF信號通路對出生前后骨骼系統的發育具有重要的調節作用。因此，探明FGF信號通路在成骨細胞分化及骨代謝中的調節機制已逐漸成為一個新的研究熱點，特別是在細胞及分子學水平上揭示其作用機制，對深入研究相關骨代謝疾病的發病機制具有重要意義。
Su等[65]報道，FGF可刺激多種細胞系的增殖及分化，其中包括成骨前體細胞及MSCs等。Fei等[66]報道，FGF-2作為FGFs家族的重要成員之一，可由成骨細胞合成并表達，然后存儲于細胞外基質，其對成骨細胞分化及骨形成具有正向調節作用。也有研究顯示[67]，FGF-2可誘導人MSCs中ALP的表達，但并不改變骨鈣素mRNA的表達水平，表明FGF-2可能參與了成骨細胞分化早期的調節。此外，針對小鼠及人類的細胞及遺傳學研究證實，FGF信號通路可通過募集與活化成軟骨細胞及成骨細胞系來調控軟骨生成、成骨細胞分化及骨形成等[68-69]。最新研究發現，FGF信號通路也可通過激活Runx2及BMP-2的表達來調控成骨分化及骨形成。例如，Kodama等[70]通過凝膠系統持續向小鼠體內釋放人重組FGF-2，結果顯示實驗組小鼠的下頜骨體積較對照組大1.5倍，且分化的成骨細胞數目較對照組增多，Runx2及BMP-2的表達也明顯提高。Agas等[71]通過培養敲除FGF-2基因的小鼠MSCs，發現細胞中Runx2 mRNA表達明顯下調，而加入FGF-2后Runx2 mRNA表達則明顯提高。此外，Kim等[72]通過研究證實，FGF-2可誘導Runx2發生磷酸化并活化，從而調節成骨細胞分化。
以上研究結果表明，FGF信號通路不但對胚胎發育及細胞增殖、分化、凋亡起著重要調控作用；而且對成骨細胞分化及骨形成也具有關鍵作用，并且也可間接調節Runx2及BMP-2的表達，從而與上述其他信號通路組成復雜的調控網絡，共同參與成骨細胞分化及骨形成的調節。
3 小結
綜上述，成骨細胞分化及骨形成受諸如BMP、Wnt、Notch、Hedgehog、FGF等多條關鍵信號通路的調節，它們通過直接或間接作用于Runx2或Osterix等關鍵轉錄因子而彼此相互聯系，相互影響，從而組成了錯綜復雜的調控網絡，協同參與成骨細胞分化及骨形成的調節。盡管目前對相關信號通路的研究較多，并且也取得了一些重大研究成果，但有關各信號通路在調控成骨細胞分化及骨形成方面的確切分子機制及相互作用方式仍不十分明了。相信隨著有關研究的進一步深入，有望徹底揭開成骨細胞分化及骨形成過程的完整分子機制，從而為臨床有效防治與成骨分化及骨形成異常相關的疾病（如骨質疏松癥、異位骨化等）提供新的理論依據與治療靶點。