引用本文： 王文岳, 楊天府, 劉雷, 裴福興. bFGF長循環脂質體對大鼠脊髓牽張性損傷影響的蛋白質組學研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(11): 1397-1405. doi: 10.7507/1002-1892.20140303 復制
脊髓牽張性損傷常見于脊柱外傷或脊柱矯形術中醫源性損傷，是嚴重并發癥，如何保護脊髓組織、促進損傷脊髓的功能重建是研究熱點之一。bFGF是神經損傷修復中的一個重要生長因子，具有神經營養作用，包括促進神經細胞再生和存活。但bFGF很難通過血腦屏障且半衰期短，需經過分子重構，以增加其透過血腦屏障的劑量和延長在血漿中的存留時間。脂質體具有生物可適性、生物可降解性、無毒和無免疫原性。通過將不能透過血腦屏障的藥物摻入脂質體，并與血腦屏障轉運載體相連，載體的攜帶能力將大大提高[1]。目前，國內罕見bFGF長循環脂質體用于脊髓牽張性損傷后蛋白質組學變化的研究。本研究擬比較大鼠脊髓牽張性損傷和使用bFGF長循環脂質體治療后脊髓組織的蛋白質圖譜差異，在蛋白質組水平上揭示bFGF長循環脂質體影響脊髓損傷修復的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級健康成年SD大鼠20只，雌雄不限，體重250～300?g，由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。bFGF長循環脂質體由四川大學華西藥學院制作并提供。
尿素、（3-膽堿胺丙基）-二乙胺-1-丙磺酸、SDS、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、瓊脂糖（Promega公司，美國）；蛋白酶抑制劑雞尾酒片（Roche公司，瑞士）；甘油、乙醇、乙酸、戊二醛、硫代硫酸鈉、乙酸鈉、EDTA、磷酸、甲醛、碳酸鈉（北京生化化學試劑廠）；Whatman?1號化學分析濾紙（杭州富陽特種紙業公司）；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（—20℃保存）、α-氰基-4羥基肉桂酸（α-cyano-4 hydroxy cinnamic acid，CCA）、過硫酸胺、四甲基乙二胺、牛血清白蛋白（Sigma公司，美國）；痕量溴酚藍（USB公司，美國）；SephadexG-50葡聚糖凝膠（Amersham Pharmacia公司，瑞典）；蛋白質分子量Marker、IPG膠條（Amersham Pharmacia公司，美國）；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA；Fluka公司，美國）；乙腈（Fisher公司，美國）；二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇（distearoylphosphatidylethano lamine-polyethylene glycol，DSPE-PEG）2000、大豆卵磷脂（soybean phosphatidyl choline，SPC）、膽固醇（cholesterin，Chol）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（Avanti Polar Lipids公司，美國）。
參照文獻[2]方法配制以下試劑：組織裂解液、Bradford貯存液、Bradford工作液、Tris-HCl（pH8.8）、重泡漲液、平衡液、30%丙烯酰胺/0.8%甲叉雙丙烯酰胺溶液、13%PAGE、0.5%瓊脂糖封膠液、銀染液（固定液、增敏液、銀染液、顯色液、終止液）、5%TFA、5×電泳緩沖液（Tris-甘氨酸-SDS）、CCA基質用溶劑、脫鹽液、洗脫液、飽和CCA溶液。
PE-10導管（BD公司，美國）；冷凍離心機（Sigma公司，美國）、Sonoiprepl50超聲破碎儀（Synol公司，日本）；EP213電子天平（Ohaus公司，美國）；Synergy185MilliPAK純水機（Millipore公司，美國）；IPGphor IEF System固相pH梯度等電聚焦儀、凝膠圖像掃描儀（Amersham Pharmacia公司，美國）；PROTEANⅡxi Cell垂直板電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；R-114型旋轉蒸發儀（BUchi公司，瑞士）；Sizer Nano ZS90型激光粒度及Zeta電位分析儀（Malvern公司，英國）；水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）；Hystar l.0軟件、數據分析軟件DataAnalysis 3.4（Bruker Dahonies公司，美國）；Imagemaster軟件（Newcastle upon Tyne公司，英國）；Apex 1.0（BAUKER公司，德國）；超高效納升液相色譜-電噴霧串聯質譜（nano ultra-high performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry，NanoUPLC-ESI-MS/MS；Waters公司，美國）。
1.2 bFGF長循環脂質體的制備及相關檢測
1.2.1 相關參數選擇
①脂質濃度選擇：本實驗選擇不同脂膜含量2.0%、2.5%、3.0%、4.0%和5.0%制備bFGF脂質體；參考預實驗結果及相關文獻[3]后，在12.5～30.0 mg/mL范圍內選擇合適脂質濃度制備脂質體。②介質pH值選擇：bFGF的等電點為9.6，pH8.0時脂質體的包封率較高[3]。但介質的pH值對脂質體的物理穩定性影響較大，磷脂膜荷負電，當介質在過于偏酸或偏堿的條件下可能因同性電荷排斥或異性電荷吸引，而影響脂質體溶液的物理穩定性。因此本實驗中介質pH值范圍為6.0～8.0。③最終脂質濃度選取：綜合脂膜含量、介質pH值的選擇以及確定制備方法后，根據文獻[4]報道在每份處方中加入2%PEG成膜，再用100μg/mL bFGF水化，通過預實驗篩選得到初步處方。采用薄膜分散法制備不同脂質濃度的bFGF長循環脂體，并通過其粒徑、電位及包封率測定以及外觀、穩定性評估確定最佳處方。
1.2.2 薄膜分散法制備bFGF長循環脂質體
①用茄形瓶稱取處方量SPC、Chol、DSPE-PEG2000，加入氯仿使之完全溶解（所用器具均先在紫外燈下輻射滅菌）；②使用旋轉蒸發儀利用旋轉蒸發法抽去溶液中的氯仿，在茄形瓶瓶底及內壁形成一層均勻的脂質薄膜；③真空干燥器內放置過夜；④加入bFGF溶液和10%蔗糖溶液，使用恒溫空氣搖床，在25℃、300 r/min、4?h條件下，使脂質薄膜充分水化；⑤水化后通過0.22?μm聚碳酸酯膜整粒5次，即得到包載bFGF的脂質體；⑥SephadexG-50葡聚糖凝膠預先用10%蔗糖平衡過夜，將制得的脂質體通過葡聚糖凝膠柱分離除去游離的bFGF，即得到bFGF長循環脂質體。
1.2.3 bFGF長循環脂質體的粒徑和電位檢測
取制得的bFGF長循環脂質體樣本，用Sizer Nano ZS90型激光粒度及Zeta電位分析儀測定脂質體的粒徑、多分散指數（polydisperse index，PDI）和微粒動電電位。
1.2.4 bFGF長循環脂質體包封率測定
采用ELISA法測定bFGF長循環脂質體包封率，公式為（W包/W總）×100%。其中W包為被包封藥量，W總為總投藥量。
1.2.5 bFGF長循環脂質體外觀及穩定性測試
將制得的bFGF長循環脂質體樣本于4℃恒溫冰箱放置1個月后，測定脂質體粒徑、PDI，并結合放置前后bFGF長循環脂質體的外觀，綜合判斷其穩定性。以呈半透明混懸液狀，溶液均勻、無明顯沉淀及漂浮顆粒物視為穩定性良好。
1.2.6 脂質體最佳處方的選取
經過對幾種不同脂質濃度制備的bFGF長循環脂質體樣品的綜合考察，最終確定脂膜含量為2.5%及SPC（20 mg/mL）+ Chol（5 mg/mL）時，為最終脂質濃度。另外，加入bFGF后整體處方如下：SPC 20 mg/ mL、Chol 5?mg/ mL、DSPE-PEG2000 2.2 mg/mL、bFGF 100?μg/ mL。
1.3 實驗分組及方法
將20只大鼠隨機分為脊髓牽張性損傷模型組（A組）和bFGF長循環脂質體治療組（B組），每組10只。參照既往制作脊髓牽張性損傷模型的方法[5]，對20只大鼠行體感誘發電位監測，撐開脊柱T12～L3節段至P1波幅分別下降70%后維持10 min。A組造模后取出脊柱撐開器，縫合肌肉、皮膚。B組于造模后參照Yaksh等[6]方法置PE-10導管灌注bFGF長循環脂質體，在術后即刻及1、2、3、4、5、6 d分別采用微泵經導管灌注bFGF長循環脂質體20?μg/kg[7]，給藥速度為10?μg/h；每次給藥前均以75%乙醇消毒導管，剪去封閉端，給藥完畢后以熱力封閉導管末端。術畢兩組分籠飼養觀察，防止B組大鼠互相咬噬導管；室溫控制在23～24℃，普通進食、水；造模術后即刻及術后3?d內每天肌肉注射青霉素40萬U。
1.4 檢測指標
1.4.1 雙向凝膠電泳圖譜及圖像分析
兩組分別于術后3周各取5只大鼠，5%水合氯醛麻醉后，開胸經左心室-主動脈插管，先用200 mL生理鹽水灌流，待右心房流出液透亮時，再注入4%多聚甲醛灌注固定，然后暴露T12～L3節段相應部位脊髓，完整取出T12～L3脊髓（長約1.5 cm），術中勿損傷脊髓，PBS清洗，濾紙吸水，液氮保存。測定前取出液氮保存脊髓研磨至細粉狀，取100 mg加入裂解液1?mL、蛋白酶抑制劑雞尾酒片20 mL，超聲破碎至清亮，加入RNAase和DNAase各10μL，冰浴20?min，4℃以14 000×g離心20?min，取上清，—80℃保存。采用Bradford法進行蛋白定量[8]。雙向凝膠電泳：實驗方法參考Bio-Rad蛋白質組雙向電泳實驗操作手冊，首先進行第1向固相pH梯度等電聚焦，第2步平衡為烷基化過程；然后完成第2向垂直平板電泳操作，凝膠固定后進行銀染。雙向電泳圖像分析：圖像掃描儀透射掃描雙向凝膠，采集蛋白圖像并發送至Imagemaster軟件分析程序進行凝膠圖像分析（在已進行蛋白點校正檢測的凝膠之間找出代表同一蛋白的點，以比較不同凝膠中的蛋白表達情況。激活主工具欄中的匹配按鈕，設置進行匹配的參數，點擊參考點和對比點，產生匹配向量線，觀察重疊匹配的效果以及匹配趨勢），標準化運算并精確比對、圖像校正、建立凝膠和點的實驗數據報告，將鑒定出來的差異蛋白點標示在相應分析膠上。表達上調或下調2倍被認為是差異蛋白并予以質譜鑒定。
1.4.2 差異蛋白鑒定方法
使用NanoUPLC-ESI-MS/MS串聯質譜鑒定差異蛋白，質譜采集時間40?min，進樣5 min后開始采集。質譜控制軟件為Apex 1.0，液相控制軟件為Hystar l.0。采用數據分析軟件DataAnalysis 3.4將每個樣品（已處理的術后3周樣品）所有MS/MS數據生成為一個mgf文件（包含各個母離子及碎片信息），首先通過搜索引擎Mascot（www.matrixscience.corn）的離子查詢方式（MS/MS ion search program）進行檢索；檢索結果的可靠性用肽段匹配率、得分值和匹配肽段在對應蛋白中的序列覆蓋率進行評價，鑒定出對應的蛋白。
2 結果
2.1 bFGF長循環脂質體相關檢測
按最佳處方制備的bFGF長循環脂質體粒徑較均勻，為（145.3?±4.5）nm，符合透過血腦屏障和血脊髓屏障的初步要求[9-10]；PDI為0.082?±0.003，微粒動電電位為（—?15.89?±2.54）mV；包封率為58.3%?±3.1%。物理穩定性較好，經放置1個月后的粒徑為（139.2?±5.7）nm，PDI為0.079?±0.004；呈半透明混懸液狀，溶液均勻、無明顯沉淀及漂浮顆粒物。
2.2 雙向凝膠電泳圖譜及圖像分析
A、B組脊髓組織總蛋白的雙向凝膠電泳圖譜見圖 1，用Imagemaster軟件檢測到蛋白點分別約為1?104個和1 015個。Imagemaster軟件分析示，A、B組組內凝膠匹配率為70%～80%，兩組間凝膠匹配率為70%～74%。
圖1
兩組脊髓組織總蛋白雙向凝膠電泳圖??Mr：相對分子質量? A組? B組??圖 2?兩組差異點匹配圖（兩組重疊圖像）?藍色圓圈和紅色圓圈分別表示圖像分析軟件自動識別的A組和B組蛋白點，成對展示為藍色的矢量（此矢量連接了堆疊凝膠中配對蛋白的位置）
Figure1.
Two-dimensional gel electrophoresis map of total protein of spinal cord tissue in 2 groups?? Mr: Relative molecular mass ?Group A ? Group B??Fig. 2?The match map of differential protein expression spots in 2 groups (overlapping images)? The blue circle and red circle represented the automatic recognized protein expression spots respectively in group A and group B according to the image analysis software. Pairwise display referred to the blue vector which connected the location of the paired proteins in stacking gel
對A、B組的脊髓組織進行雙向凝膠電泳的差異分析，Imagemaster軟件得出的差異點匹配報告見圖 2，其中紅色和藍色圓圈分別代表A、B組蛋白點。A、B組雙向凝膠電泳圖經Imagemaster軟件凝膠圖像分析及人工驗證，得到差異蛋白點10個，其中6個下調，4個上調（圖 3）。表達上調或下調2倍被認為是差異蛋白并予以質譜鑒定，共有26個差異蛋白予以質譜鑒定，見表 1。
圖2
兩組部分差異蛋白圓圈示差異點? ?A組? ?B組紅箭頭示與A組比較表達上調的差異蛋白，綠箭頭示與A組比較表達下調的差異蛋白
Figure2.
The partial differential expressed proteins in 2 groups?? The circle represented the differential spot ??Group A ? Group B ?Compared with the group A, the red arrow indicated the up-regulated differential expression trend, and the green arrow indicated the down-regulated differential expression trend
表1
兩組同一蛋白差異表達趨勢
Table1.
Comparison of differentially expressed proteins between groups A and B
2.3 差異蛋白鑒定
采用NanoUPLC-ESI-MS/MS進行鑒定，共鑒定出18種蛋白。Mascot檢索分值41～383，肽段匹配數1～73，序列覆蓋率4%～43%。18種蛋白中15種為已命名蛋白，3種為未知蛋白。與凋亡相關的蛋白4種：β微管蛋白、半乳糖苷凝集素、硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶、微管不穩定蛋白基因；與神經傳導和信號轉導相關的蛋白3種：甲狀腺激素結合蛋白、醛糖還原酶、2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶；參與代謝的蛋白7種：細胞色素C氧化酶、異檸檬酸脫氫酶、異戊酰輔酶A脫氫酶前體、二氫喋啶還原酶、碳酸酐酶和碳酸酐酶Ⅲ、磷酸丙糖異構酶。瘢痕形成-γ-對碘氧基苯甲醚功能不明；未知蛋白3種（gi|56905、gi|56905、gi|1334163），串聯質譜鑒定為未知蛋白。見表 2。
表2
差異蛋白鑒定結果
Table2.
Identification results of differentially expressed proteins
3 討論
3.1 bFGF長循環脂質體產生神經保護作用的可能機制
文獻報道[12-14]脊髓損傷時表達發生變化的蛋白有數十個，包括NADH脫氫酶、DJ-1蛋白、TPI1、蛋白酶體、N-myc下游調節基因1、膜聯蛋白、抗氧化物酶2、微管蛋白、熱休克蛋白、PRDX3等，它們與脊髓損傷的關系需進一步證實。我們在前期篩選并鑒定出與大鼠急性脊髓牽張性損傷相關的有意義的蛋白共16種，主要是與凋亡、神經信號轉導、代謝相關的蛋白[11]。本研究鑒定出的差異蛋白中，與凋亡相關的蛋白4種，與神經傳導和信號轉導相關的蛋白3種，參與代謝的蛋白7種。現就兩組差異蛋白的功能、臨床意義及其可能的相互關聯分述如下。
3.1.1 細胞色素C氧化酶
細胞色素C氧化酶在缺血腦組織的活性普遍低于正常腦組織[15-17]，活性的改變與線粒體細胞色素C釋出有關，神經元缺失可能與凋亡啟動和能量代謝障礙有關。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后細胞色素C氧化酶呈下調趨勢，經bFGF長循環脂質體治療后恢復至正常，其活性下降可能與脊髓損傷后神經元缺氧缺血有關。已有研究顯示脊髓損傷后一氧化氮（NO）過度產生會加強其所介導的細胞毒性損害，加重神經元的缺血、缺氧及代謝障礙，甚至引起神經元死亡[18]。NO對細胞色素C氧化酶有可逆的競爭性抑制作用，在脊髓缺血損傷后NO含量上升，可與氧競爭結合細胞色素C氧化酶的活性中心，從而降低細胞色素C氧化酶活性，而外源性bFGF能通過有效抑制一氧化氮合酶活性而減少NO的過度產生，從而保護神經元。提示bFGF長循環脂質體可能通過抑制一氧化氮合酶的活性而減少NO的過度產生，進而促進細胞色素C氧化酶活性恢復，對脊髓修復產生有益作用。
3.1.2 β微管蛋白與微管不穩定蛋白基因
β微管蛋白是細胞骨架蛋白的主要成分，參與調節多種激素或生長因子水平，對細胞分裂、細胞周期和凋亡起著重要調節作用[19]。微管不穩定蛋白基因通過與多種促細胞凋亡因子的相互作用參與細胞凋亡[20-21]。微管不穩定蛋白基因是多種細胞內激酶的作用底物，微管蛋白、微管及紡錘體等細胞器是其在細胞分裂周期中起關鍵作用的下游作用靶點。微管不穩定蛋白基因可積極調節微管蛋白合成。微管不穩定蛋白基因蛋白在神經系統中高表達，對于神經系統的發育及神經節的形成十分重要。本研究顯示脊髓牽張性損傷后β微管蛋白和微管不穩定蛋白基因均呈上調趨勢，可能與脊髓損傷后多種促細胞凋亡因子的相互作用參與細胞凋亡增加有關；經蛛網膜下腔灌注bFGF長循環脂質體后，微管不穩定蛋白基因恢復至正常水平，而β微管蛋白仍呈上調趨勢，提示bFGF長循環脂質體可能通過微管不穩定蛋白基因調節微管蛋白合成途徑，減少促細胞凋亡因子的生成，從而抑制細胞凋亡。
3.1.3 甲狀腺激素結合蛋白與碳酸酐酶
甲狀腺激素結合蛋白是運輸甲狀腺激素的重要蛋白，在循環中能結合95%以上的甲狀腺激素，起運輸、緩沖、儲存作用；該蛋白廣泛存在于腦脊液中，其濃度改變可影響甲狀腺激素水平，參與神經系統退行性變[22]。碳酸酐酶可能與細胞內的氧化應激、信號傳導和細胞凋亡有關[23-24]。此前對于脊髓中碳酸酐酶的表達及其意義鮮有報道。目前有研究報道甲狀腺激素可能會降低碳酸酐酶合成反應的速率，過多的甲狀腺激素可減少碳酸酐酶的合成。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后甲狀腺激素結合蛋白呈上調趨勢，并出現了碳酸酐酶表達，經bFGF長循環脂質體治療后甲狀腺激素結合蛋白較損傷后下調，并恢復至正常，而碳酸酐酶表達較正常脊髓組織明顯上調。顯示bFGF長循環脂質體產生神經保護作用可能的機制是通過下調甲狀腺激素結合蛋白并導致甲狀腺激素水平下降，從而增加碳酸酐酶合成。碳酸酐酶參與穩定細胞內環境，更重要的作用是抗氧化損傷及抑制細胞凋亡，減少脊髓繼發性損傷，從而保護脊髓神經細胞、利于脊髓功能恢復。對脊髓損傷的干預治療是否可通過抑制甲狀腺激素結合蛋白水平、增加碳酸酐酶合成來達到保護脊髓功能值得進一步研究。
3.1.4 半乳糖苷凝集素
半乳糖苷凝集素是急、慢性炎癥的調節因子，參加信號通路和調節生物反應，包括細胞凋亡、細胞分化、細胞遷移，在免疫和炎性應答方面扮演了重要角色，并對中樞神經系統退行性變的發展起著重要作用[25-26]。半乳糖苷凝集素家族中半乳糖苷凝集素1、7、8、9、12可通過誘導TNF、IL-1、IL-6等細胞因子的分泌來促進或誘導細胞凋亡，而半乳糖苷凝集素3被認為是凋亡抑制因子，其機制可能是半乳糖苷凝集素3保護細胞免受由抗FAS抗體誘導的凋亡。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后半乳糖苷凝集素呈下調趨勢，bFGF長循環脂質體治療后半乳糖苷凝集素恢復至正常。提示脊髓損傷后半乳糖苷凝集素家族中半乳糖苷凝集素3可能占優勢，牽張損傷抑制了半乳糖苷凝集素3表達而促進細胞凋亡，應用bFGF長循環脂質體可能促進凋亡抑制因子半乳糖苷凝集素3恢復至正常表達水平而抑制細胞凋亡，從而對脊髓修復產生有益作用。
3.1.5 異檸檬酸脫氫酶
異檸檬酸脫氫酶在生物的能量產生和合成代謝中起著重要作用。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后異檸檬酸脫氫酶呈上調趨勢，可能與脊髓損傷后促進異檸檬酸脫氫酶表達，從而抑制其細胞能量代謝有關；經過bFGF長循環脂質體治療后異檸檬酸脫氫酶恢復正常，促進細胞能量代謝，從而對脊髓修復產生有益作用。從細胞能量代謝方面看，bFGF長循環脂質體治療后調節的異檸檬酸脫氫酶可能主要是NAD-異檸檬酸脫氫酶，但在脊髓損傷的具體作用機制尚未明確，有待研究。
3.1.6 二氫喋啶還原酶
二氫喋啶還原酶具有抗氧化作用，其缺乏可影響神經遞質的合成及神經傳導速度。已有研究顯示二氫喋啶還原酶是參與四氫生物喋呤代謝通路的重要酶，而四氫生物喋呤是一氧化氮合酶的輔因子，能催化精氨酸轉化為瓜氨酸，釋放NO[27]。二氫喋啶還原酶減少可導致TGF-1的顯著增加，減少NO生成，而TGF-1具有促進細胞增殖、分化和抑制細胞凋亡的作用[28]。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后二氫喋啶還原酶呈上調趨勢，可能是因為在脊髓牽張性損傷后早期細胞凋亡與缺血再灌注損傷，導致脂質過氧化、大量自由基產生，應激刺激導致二氫喋啶還原酶表達增高，而二氫喋啶還原酶通過抗氧化作用起到保護脊髓神經功能的作用；經bFGF長循環脂質體治療后二氫喋啶還原酶表達恢復至正常，此時細胞凋亡高峰已過，二氫喋啶還原酶的抗氧化作用已無重要意義，由于在bFGF長循環脂質體治療后早期未進行蛋白組學檢測，因此不能確切了解治療后早期二氫喋啶還原酶的表達水平變化，但根據治療3周后結果發現二氫喋啶還原酶蛋白表達仍處于正常水平，是否是bFGF長循環脂質體的作用尚不清楚。總之，二氫喋啶還原酶保持正常水平對神經遞質的合成及脊髓神經功能恢復具有重要意義。
3.1.7 硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶
硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶主要作用包括抗氧化防御、多途徑抑制細胞凋亡、清除過氧化物及羥基[29-31]。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶呈上調趨勢，經bFGF長循環脂質體治療后出現下調，分析其上調與脊髓牽張性損傷后的細胞凋亡與缺血再灌注損傷，即脂質過氧化、大量自由基產生密切相關，硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶的強烈抗氧化和清除過氧化物作用可能對急性脊髓損傷產生一定保護作用。目前關于硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶在脊髓損傷中研究的報道極少，更多機制尚待研究。由于在bFGF長循環脂質體治療后早期未進行蛋白組學檢測，因此不能確切了解治療后早期硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶的表達水平變化。
3.1.8 磷酸丙糖異構酶
磷酸丙糖異構酶參與糖酵解途徑或有氧氧化，參與人體內能量代謝；并將糖酵解途徑與丙酮醛途徑相偶聯，通過丙酮醛途徑介導細胞損傷、細胞凋亡等。已有研究表明磷酸丙糖異構酶在脊髓損傷后可發生變化[32]。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后磷酸丙糖異構酶呈下調趨勢，經bFGF長循環脂質體治療后仍下調，提示磷酸丙糖異構酶可能主要通過能量代謝途徑對脊髓神經細胞能量代謝產生影響，而通過丙酮醛途徑干預細胞凋亡等作用的可能性較低。磷酸丙糖異構酶與脊髓牽張性損傷后的神經功能恢復可能具有一定相關性，但同時是否可將磷酸丙糖異構酶視為判斷脊髓損傷程度及恢復狀況的指標之一，以及bFGF長循環脂質體通過磷酸丙糖異構酶的何種作用機制對脊髓損傷起作用尚待研究。
3.1.9 醛糖還原酶
醛糖還原酶可抑制TNF-α誘導的血管平滑肌細胞的增殖、抗氧化應激，上調環氧化酶2、前列腺素E2及人結腸癌細胞水平[33-35]。我們的前期研究顯示，脊髓牽張性損傷組醛糖還原酶表達相比假手術組出現了明顯上調[11]，可能與其損傷后氧化應激增加導致醛糖還原酶表達增加，促進炎性因子產生、參與炎性反應有關。本研究中，B組應用bFGF長循環脂質體治療3周后醛糖還原酶表達與A組相比出現了下降，可能與bFGF長循環脂質體抑制醛糖還原酶以減弱氧化應激有關，是防止脊髓牽張損傷后繼發損傷的有效途徑。目前已有足夠證據證明醛糖還原酶抑制劑可應用于內毒素相關的炎性疾病[36]，其是否可作為脊髓損傷治療的一個有效方法尚需研究。
3.1.10 2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶
2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶表達的改變表明其可能參與了少突膠質細胞凋亡的調節[37]。研究顯示，2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶在微管蛋白與RNA的關聯中起著橋梁作用，可調節中樞神經系統中少突膠質細胞mRNAs的表達[38]。本研究顯示脊髓牽張性損傷后β微管蛋白呈上調趨勢，2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶表達均呈下調趨勢，二者可能共同作用參與調節中樞神經系統中少突膠質細胞mRNAs的表達、促進少突膠質細胞分化。B組應用bFGF長循環脂質體治療3周后2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶表達與A組相比有明顯上調趨勢，恢復至正常。提示其經蛛網膜下腔途徑給藥對少突膠質細胞凋亡有調節作用。
3.2 脊髓牽張性損傷與bFGF長循環脂質體治療的蛋白質組學差異
磷酸丙糖異構酶、碳酸酐酶、碳酸酐酶Ⅲ、醛糖還原酶、硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶、β微管蛋白等在脊髓牽張性損傷和bFGF長循環脂質體治療后蛋白表達量均發生了明顯變化，這些蛋白點可能對研究脊髓牽張性損傷的損傷和修復機制以及bFGF長循環脂質體治療脊髓損傷的作用機制有重要意義。其余12種蛋白尚未見與脊髓損傷有關的報道，這些新發現的差異蛋白可能為深入研究以上內容提供有價值的線索。本研究中3種未知蛋白在脊髓損傷后表達明顯上調，提示這些未知蛋白可能與脊髓損傷后細胞凋亡、修復和再生機制有關；bFGF長循環脂質體治療后第22號蛋白點（序列號gi|1334163）表達明顯下調，可能是bFGF長循環脂質體對脊髓牽張性損傷產生作用的重要蛋白。此3個蛋白將在今后研究中進一步探討其本身的結構和功能，以及與脊髓損傷修復和中樞神經系統可塑性的相關關系。研究中發現的一些主要參與能量代謝的蛋白可能同時參與調節細胞凋亡過程，甚至占有重要地位；一些蛋白質組成員在參與神經傳導、能量代謝、細胞凋亡等方面具有一定相關性，其具體相互作用機制需進一步研究。
脊髓牽張性損傷常見于脊柱外傷或脊柱矯形術中醫源性損傷，是嚴重并發癥，如何保護脊髓組織、促進損傷脊髓的功能重建是研究熱點之一。bFGF是神經損傷修復中的一個重要生長因子，具有神經營養作用，包括促進神經細胞再生和存活。但bFGF很難通過血腦屏障且半衰期短，需經過分子重構，以增加其透過血腦屏障的劑量和延長在血漿中的存留時間。脂質體具有生物可適性、生物可降解性、無毒和無免疫原性。通過將不能透過血腦屏障的藥物摻入脂質體，并與血腦屏障轉運載體相連，載體的攜帶能力將大大提高[1]。目前，國內罕見bFGF長循環脂質體用于脊髓牽張性損傷后蛋白質組學變化的研究。本研究擬比較大鼠脊髓牽張性損傷和使用bFGF長循環脂質體治療后脊髓組織的蛋白質圖譜差異，在蛋白質組水平上揭示bFGF長循環脂質體影響脊髓損傷修復的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級健康成年SD大鼠20只，雌雄不限，體重250～300?g，由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。bFGF長循環脂質體由四川大學華西藥學院制作并提供。
尿素、（3-膽堿胺丙基）-二乙胺-1-丙磺酸、SDS、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、瓊脂糖（Promega公司，美國）；蛋白酶抑制劑雞尾酒片（Roche公司，瑞士）；甘油、乙醇、乙酸、戊二醛、硫代硫酸鈉、乙酸鈉、EDTA、磷酸、甲醛、碳酸鈉（北京生化化學試劑廠）；Whatman?1號化學分析濾紙（杭州富陽特種紙業公司）；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（—20℃保存）、α-氰基-4羥基肉桂酸（α-cyano-4 hydroxy cinnamic acid，CCA）、過硫酸胺、四甲基乙二胺、牛血清白蛋白（Sigma公司，美國）；痕量溴酚藍（USB公司，美國）；SephadexG-50葡聚糖凝膠（Amersham Pharmacia公司，瑞典）；蛋白質分子量Marker、IPG膠條（Amersham Pharmacia公司，美國）；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA；Fluka公司，美國）；乙腈（Fisher公司，美國）；二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇（distearoylphosphatidylethano lamine-polyethylene glycol，DSPE-PEG）2000、大豆卵磷脂（soybean phosphatidyl choline，SPC）、膽固醇（cholesterin，Chol）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）（Avanti Polar Lipids公司，美國）。
參照文獻[2]方法配制以下試劑：組織裂解液、Bradford貯存液、Bradford工作液、Tris-HCl（pH8.8）、重泡漲液、平衡液、30%丙烯酰胺/0.8%甲叉雙丙烯酰胺溶液、13%PAGE、0.5%瓊脂糖封膠液、銀染液（固定液、增敏液、銀染液、顯色液、終止液）、5%TFA、5×電泳緩沖液（Tris-甘氨酸-SDS）、CCA基質用溶劑、脫鹽液、洗脫液、飽和CCA溶液。
PE-10導管（BD公司，美國）；冷凍離心機（Sigma公司，美國）、Sonoiprepl50超聲破碎儀（Synol公司，日本）；EP213電子天平（Ohaus公司，美國）；Synergy185MilliPAK純水機（Millipore公司，美國）；IPGphor IEF System固相pH梯度等電聚焦儀、凝膠圖像掃描儀（Amersham Pharmacia公司，美國）；PROTEANⅡxi Cell垂直板電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；R-114型旋轉蒸發儀（BUchi公司，瑞士）；Sizer Nano ZS90型激光粒度及Zeta電位分析儀（Malvern公司，英國）；水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司）；Hystar l.0軟件、數據分析軟件DataAnalysis 3.4（Bruker Dahonies公司，美國）；Imagemaster軟件（Newcastle upon Tyne公司，英國）；Apex 1.0（BAUKER公司，德國）；超高效納升液相色譜-電噴霧串聯質譜（nano ultra-high performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry，NanoUPLC-ESI-MS/MS；Waters公司，美國）。
1.2 bFGF長循環脂質體的制備及相關檢測
1.2.1 相關參數選擇
①脂質濃度選擇：本實驗選擇不同脂膜含量2.0%、2.5%、3.0%、4.0%和5.0%制備bFGF脂質體；參考預實驗結果及相關文獻[3]后，在12.5～30.0 mg/mL范圍內選擇合適脂質濃度制備脂質體。②介質pH值選擇：bFGF的等電點為9.6，pH8.0時脂質體的包封率較高[3]。但介質的pH值對脂質體的物理穩定性影響較大，磷脂膜荷負電，當介質在過于偏酸或偏堿的條件下可能因同性電荷排斥或異性電荷吸引，而影響脂質體溶液的物理穩定性。因此本實驗中介質pH值范圍為6.0～8.0。③最終脂質濃度選取：綜合脂膜含量、介質pH值的選擇以及確定制備方法后，根據文獻[4]報道在每份處方中加入2%PEG成膜，再用100μg/mL bFGF水化，通過預實驗篩選得到初步處方。采用薄膜分散法制備不同脂質濃度的bFGF長循環脂體，并通過其粒徑、電位及包封率測定以及外觀、穩定性評估確定最佳處方。
1.2.2 薄膜分散法制備bFGF長循環脂質體
①用茄形瓶稱取處方量SPC、Chol、DSPE-PEG2000，加入氯仿使之完全溶解（所用器具均先在紫外燈下輻射滅菌）；②使用旋轉蒸發儀利用旋轉蒸發法抽去溶液中的氯仿，在茄形瓶瓶底及內壁形成一層均勻的脂質薄膜；③真空干燥器內放置過夜；④加入bFGF溶液和10%蔗糖溶液，使用恒溫空氣搖床，在25℃、300 r/min、4?h條件下，使脂質薄膜充分水化；⑤水化后通過0.22?μm聚碳酸酯膜整粒5次，即得到包載bFGF的脂質體；⑥SephadexG-50葡聚糖凝膠預先用10%蔗糖平衡過夜，將制得的脂質體通過葡聚糖凝膠柱分離除去游離的bFGF，即得到bFGF長循環脂質體。
1.2.3 bFGF長循環脂質體的粒徑和電位檢測
取制得的bFGF長循環脂質體樣本，用Sizer Nano ZS90型激光粒度及Zeta電位分析儀測定脂質體的粒徑、多分散指數（polydisperse index，PDI）和微粒動電電位。
1.2.4 bFGF長循環脂質體包封率測定
采用ELISA法測定bFGF長循環脂質體包封率，公式為（W包/W總）×100%。其中W包為被包封藥量，W總為總投藥量。
1.2.5 bFGF長循環脂質體外觀及穩定性測試
將制得的bFGF長循環脂質體樣本于4℃恒溫冰箱放置1個月后，測定脂質體粒徑、PDI，并結合放置前后bFGF長循環脂質體的外觀，綜合判斷其穩定性。以呈半透明混懸液狀，溶液均勻、無明顯沉淀及漂浮顆粒物視為穩定性良好。
1.2.6 脂質體最佳處方的選取
經過對幾種不同脂質濃度制備的bFGF長循環脂質體樣品的綜合考察，最終確定脂膜含量為2.5%及SPC（20 mg/mL）+ Chol（5 mg/mL）時，為最終脂質濃度。另外，加入bFGF后整體處方如下：SPC 20 mg/ mL、Chol 5?mg/ mL、DSPE-PEG2000 2.2 mg/mL、bFGF 100?μg/ mL。
1.3 實驗分組及方法
將20只大鼠隨機分為脊髓牽張性損傷模型組（A組）和bFGF長循環脂質體治療組（B組），每組10只。參照既往制作脊髓牽張性損傷模型的方法[5]，對20只大鼠行體感誘發電位監測，撐開脊柱T12～L3節段至P1波幅分別下降70%后維持10 min。A組造模后取出脊柱撐開器，縫合肌肉、皮膚。B組于造模后參照Yaksh等[6]方法置PE-10導管灌注bFGF長循環脂質體，在術后即刻及1、2、3、4、5、6 d分別采用微泵經導管灌注bFGF長循環脂質體20?μg/kg[7]，給藥速度為10?μg/h；每次給藥前均以75%乙醇消毒導管，剪去封閉端，給藥完畢后以熱力封閉導管末端。術畢兩組分籠飼養觀察，防止B組大鼠互相咬噬導管；室溫控制在23～24℃，普通進食、水；造模術后即刻及術后3?d內每天肌肉注射青霉素40萬U。
1.4 檢測指標
1.4.1 雙向凝膠電泳圖譜及圖像分析
兩組分別于術后3周各取5只大鼠，5%水合氯醛麻醉后，開胸經左心室-主動脈插管，先用200 mL生理鹽水灌流，待右心房流出液透亮時，再注入4%多聚甲醛灌注固定，然后暴露T12～L3節段相應部位脊髓，完整取出T12～L3脊髓（長約1.5 cm），術中勿損傷脊髓，PBS清洗，濾紙吸水，液氮保存。測定前取出液氮保存脊髓研磨至細粉狀，取100 mg加入裂解液1?mL、蛋白酶抑制劑雞尾酒片20 mL，超聲破碎至清亮，加入RNAase和DNAase各10μL，冰浴20?min，4℃以14 000×g離心20?min，取上清，—80℃保存。采用Bradford法進行蛋白定量[8]。雙向凝膠電泳：實驗方法參考Bio-Rad蛋白質組雙向電泳實驗操作手冊，首先進行第1向固相pH梯度等電聚焦，第2步平衡為烷基化過程；然后完成第2向垂直平板電泳操作，凝膠固定后進行銀染。雙向電泳圖像分析：圖像掃描儀透射掃描雙向凝膠，采集蛋白圖像并發送至Imagemaster軟件分析程序進行凝膠圖像分析（在已進行蛋白點校正檢測的凝膠之間找出代表同一蛋白的點，以比較不同凝膠中的蛋白表達情況。激活主工具欄中的匹配按鈕，設置進行匹配的參數，點擊參考點和對比點，產生匹配向量線，觀察重疊匹配的效果以及匹配趨勢），標準化運算并精確比對、圖像校正、建立凝膠和點的實驗數據報告，將鑒定出來的差異蛋白點標示在相應分析膠上。表達上調或下調2倍被認為是差異蛋白并予以質譜鑒定。
1.4.2 差異蛋白鑒定方法
使用NanoUPLC-ESI-MS/MS串聯質譜鑒定差異蛋白，質譜采集時間40?min，進樣5 min后開始采集。質譜控制軟件為Apex 1.0，液相控制軟件為Hystar l.0。采用數據分析軟件DataAnalysis 3.4將每個樣品（已處理的術后3周樣品）所有MS/MS數據生成為一個mgf文件（包含各個母離子及碎片信息），首先通過搜索引擎Mascot（www.matrixscience.corn）的離子查詢方式（MS/MS ion search program）進行檢索；檢索結果的可靠性用肽段匹配率、得分值和匹配肽段在對應蛋白中的序列覆蓋率進行評價，鑒定出對應的蛋白。
2 結果
2.1 bFGF長循環脂質體相關檢測
按最佳處方制備的bFGF長循環脂質體粒徑較均勻，為（145.3?±4.5）nm，符合透過血腦屏障和血脊髓屏障的初步要求[9-10]；PDI為0.082?±0.003，微粒動電電位為（—?15.89?±2.54）mV；包封率為58.3%?±3.1%。物理穩定性較好，經放置1個月后的粒徑為（139.2?±5.7）nm，PDI為0.079?±0.004；呈半透明混懸液狀，溶液均勻、無明顯沉淀及漂浮顆粒物。
2.2 雙向凝膠電泳圖譜及圖像分析
A、B組脊髓組織總蛋白的雙向凝膠電泳圖譜見圖 1，用Imagemaster軟件檢測到蛋白點分別約為1?104個和1 015個。Imagemaster軟件分析示，A、B組組內凝膠匹配率為70%～80%，兩組間凝膠匹配率為70%～74%。
圖1
兩組脊髓組織總蛋白雙向凝膠電泳圖??Mr：相對分子質量? A組? B組??圖 2?兩組差異點匹配圖（兩組重疊圖像）?藍色圓圈和紅色圓圈分別表示圖像分析軟件自動識別的A組和B組蛋白點，成對展示為藍色的矢量（此矢量連接了堆疊凝膠中配對蛋白的位置）
Figure1.
Two-dimensional gel electrophoresis map of total protein of spinal cord tissue in 2 groups?? Mr: Relative molecular mass ?Group A ? Group B??Fig. 2?The match map of differential protein expression spots in 2 groups (overlapping images)? The blue circle and red circle represented the automatic recognized protein expression spots respectively in group A and group B according to the image analysis software. Pairwise display referred to the blue vector which connected the location of the paired proteins in stacking gel
對A、B組的脊髓組織進行雙向凝膠電泳的差異分析，Imagemaster軟件得出的差異點匹配報告見圖 2，其中紅色和藍色圓圈分別代表A、B組蛋白點。A、B組雙向凝膠電泳圖經Imagemaster軟件凝膠圖像分析及人工驗證，得到差異蛋白點10個，其中6個下調，4個上調（圖 3）。表達上調或下調2倍被認為是差異蛋白并予以質譜鑒定，共有26個差異蛋白予以質譜鑒定，見表 1。
圖2
兩組部分差異蛋白圓圈示差異點? ?A組? ?B組紅箭頭示與A組比較表達上調的差異蛋白，綠箭頭示與A組比較表達下調的差異蛋白
Figure2.
The partial differential expressed proteins in 2 groups?? The circle represented the differential spot ??Group A ? Group B ?Compared with the group A, the red arrow indicated the up-regulated differential expression trend, and the green arrow indicated the down-regulated differential expression trend
表1
兩組同一蛋白差異表達趨勢
Table1.
Comparison of differentially expressed proteins between groups A and B
2.3 差異蛋白鑒定
采用NanoUPLC-ESI-MS/MS進行鑒定，共鑒定出18種蛋白。Mascot檢索分值41～383，肽段匹配數1～73，序列覆蓋率4%～43%。18種蛋白中15種為已命名蛋白，3種為未知蛋白。與凋亡相關的蛋白4種：β微管蛋白、半乳糖苷凝集素、硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶、微管不穩定蛋白基因；與神經傳導和信號轉導相關的蛋白3種：甲狀腺激素結合蛋白、醛糖還原酶、2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶；參與代謝的蛋白7種：細胞色素C氧化酶、異檸檬酸脫氫酶、異戊酰輔酶A脫氫酶前體、二氫喋啶還原酶、碳酸酐酶和碳酸酐酶Ⅲ、磷酸丙糖異構酶。瘢痕形成-γ-對碘氧基苯甲醚功能不明；未知蛋白3種（gi|56905、gi|56905、gi|1334163），串聯質譜鑒定為未知蛋白。見表 2。
表2
差異蛋白鑒定結果
Table2.
Identification results of differentially expressed proteins
3 討論
3.1 bFGF長循環脂質體產生神經保護作用的可能機制
文獻報道[12-14]脊髓損傷時表達發生變化的蛋白有數十個，包括NADH脫氫酶、DJ-1蛋白、TPI1、蛋白酶體、N-myc下游調節基因1、膜聯蛋白、抗氧化物酶2、微管蛋白、熱休克蛋白、PRDX3等，它們與脊髓損傷的關系需進一步證實。我們在前期篩選并鑒定出與大鼠急性脊髓牽張性損傷相關的有意義的蛋白共16種，主要是與凋亡、神經信號轉導、代謝相關的蛋白[11]。本研究鑒定出的差異蛋白中，與凋亡相關的蛋白4種，與神經傳導和信號轉導相關的蛋白3種，參與代謝的蛋白7種。現就兩組差異蛋白的功能、臨床意義及其可能的相互關聯分述如下。
3.1.1 細胞色素C氧化酶
細胞色素C氧化酶在缺血腦組織的活性普遍低于正常腦組織[15-17]，活性的改變與線粒體細胞色素C釋出有關，神經元缺失可能與凋亡啟動和能量代謝障礙有關。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后細胞色素C氧化酶呈下調趨勢，經bFGF長循環脂質體治療后恢復至正常，其活性下降可能與脊髓損傷后神經元缺氧缺血有關。已有研究顯示脊髓損傷后一氧化氮（NO）過度產生會加強其所介導的細胞毒性損害，加重神經元的缺血、缺氧及代謝障礙，甚至引起神經元死亡[18]。NO對細胞色素C氧化酶有可逆的競爭性抑制作用，在脊髓缺血損傷后NO含量上升，可與氧競爭結合細胞色素C氧化酶的活性中心，從而降低細胞色素C氧化酶活性，而外源性bFGF能通過有效抑制一氧化氮合酶活性而減少NO的過度產生，從而保護神經元。提示bFGF長循環脂質體可能通過抑制一氧化氮合酶的活性而減少NO的過度產生，進而促進細胞色素C氧化酶活性恢復，對脊髓修復產生有益作用。
3.1.2 β微管蛋白與微管不穩定蛋白基因
β微管蛋白是細胞骨架蛋白的主要成分，參與調節多種激素或生長因子水平，對細胞分裂、細胞周期和凋亡起著重要調節作用[19]。微管不穩定蛋白基因通過與多種促細胞凋亡因子的相互作用參與細胞凋亡[20-21]。微管不穩定蛋白基因是多種細胞內激酶的作用底物，微管蛋白、微管及紡錘體等細胞器是其在細胞分裂周期中起關鍵作用的下游作用靶點。微管不穩定蛋白基因可積極調節微管蛋白合成。微管不穩定蛋白基因蛋白在神經系統中高表達，對于神經系統的發育及神經節的形成十分重要。本研究顯示脊髓牽張性損傷后β微管蛋白和微管不穩定蛋白基因均呈上調趨勢，可能與脊髓損傷后多種促細胞凋亡因子的相互作用參與細胞凋亡增加有關；經蛛網膜下腔灌注bFGF長循環脂質體后，微管不穩定蛋白基因恢復至正常水平，而β微管蛋白仍呈上調趨勢，提示bFGF長循環脂質體可能通過微管不穩定蛋白基因調節微管蛋白合成途徑，減少促細胞凋亡因子的生成，從而抑制細胞凋亡。
3.1.3 甲狀腺激素結合蛋白與碳酸酐酶
甲狀腺激素結合蛋白是運輸甲狀腺激素的重要蛋白，在循環中能結合95%以上的甲狀腺激素，起運輸、緩沖、儲存作用；該蛋白廣泛存在于腦脊液中，其濃度改變可影響甲狀腺激素水平，參與神經系統退行性變[22]。碳酸酐酶可能與細胞內的氧化應激、信號傳導和細胞凋亡有關[23-24]。此前對于脊髓中碳酸酐酶的表達及其意義鮮有報道。目前有研究報道甲狀腺激素可能會降低碳酸酐酶合成反應的速率，過多的甲狀腺激素可減少碳酸酐酶的合成。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后甲狀腺激素結合蛋白呈上調趨勢，并出現了碳酸酐酶表達，經bFGF長循環脂質體治療后甲狀腺激素結合蛋白較損傷后下調，并恢復至正常，而碳酸酐酶表達較正常脊髓組織明顯上調。顯示bFGF長循環脂質體產生神經保護作用可能的機制是通過下調甲狀腺激素結合蛋白并導致甲狀腺激素水平下降，從而增加碳酸酐酶合成。碳酸酐酶參與穩定細胞內環境，更重要的作用是抗氧化損傷及抑制細胞凋亡，減少脊髓繼發性損傷，從而保護脊髓神經細胞、利于脊髓功能恢復。對脊髓損傷的干預治療是否可通過抑制甲狀腺激素結合蛋白水平、增加碳酸酐酶合成來達到保護脊髓功能值得進一步研究。
3.1.4 半乳糖苷凝集素
半乳糖苷凝集素是急、慢性炎癥的調節因子，參加信號通路和調節生物反應，包括細胞凋亡、細胞分化、細胞遷移，在免疫和炎性應答方面扮演了重要角色，并對中樞神經系統退行性變的發展起著重要作用[25-26]。半乳糖苷凝集素家族中半乳糖苷凝集素1、7、8、9、12可通過誘導TNF、IL-1、IL-6等細胞因子的分泌來促進或誘導細胞凋亡，而半乳糖苷凝集素3被認為是凋亡抑制因子，其機制可能是半乳糖苷凝集素3保護細胞免受由抗FAS抗體誘導的凋亡。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后半乳糖苷凝集素呈下調趨勢，bFGF長循環脂質體治療后半乳糖苷凝集素恢復至正常。提示脊髓損傷后半乳糖苷凝集素家族中半乳糖苷凝集素3可能占優勢，牽張損傷抑制了半乳糖苷凝集素3表達而促進細胞凋亡，應用bFGF長循環脂質體可能促進凋亡抑制因子半乳糖苷凝集素3恢復至正常表達水平而抑制細胞凋亡，從而對脊髓修復產生有益作用。
3.1.5 異檸檬酸脫氫酶
異檸檬酸脫氫酶在生物的能量產生和合成代謝中起著重要作用。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后異檸檬酸脫氫酶呈上調趨勢，可能與脊髓損傷后促進異檸檬酸脫氫酶表達，從而抑制其細胞能量代謝有關；經過bFGF長循環脂質體治療后異檸檬酸脫氫酶恢復正常，促進細胞能量代謝，從而對脊髓修復產生有益作用。從細胞能量代謝方面看，bFGF長循環脂質體治療后調節的異檸檬酸脫氫酶可能主要是NAD-異檸檬酸脫氫酶，但在脊髓損傷的具體作用機制尚未明確，有待研究。
3.1.6 二氫喋啶還原酶
二氫喋啶還原酶具有抗氧化作用，其缺乏可影響神經遞質的合成及神經傳導速度。已有研究顯示二氫喋啶還原酶是參與四氫生物喋呤代謝通路的重要酶，而四氫生物喋呤是一氧化氮合酶的輔因子，能催化精氨酸轉化為瓜氨酸，釋放NO[27]。二氫喋啶還原酶減少可導致TGF-1的顯著增加，減少NO生成，而TGF-1具有促進細胞增殖、分化和抑制細胞凋亡的作用[28]。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后二氫喋啶還原酶呈上調趨勢，可能是因為在脊髓牽張性損傷后早期細胞凋亡與缺血再灌注損傷，導致脂質過氧化、大量自由基產生，應激刺激導致二氫喋啶還原酶表達增高，而二氫喋啶還原酶通過抗氧化作用起到保護脊髓神經功能的作用；經bFGF長循環脂質體治療后二氫喋啶還原酶表達恢復至正常，此時細胞凋亡高峰已過，二氫喋啶還原酶的抗氧化作用已無重要意義，由于在bFGF長循環脂質體治療后早期未進行蛋白組學檢測，因此不能確切了解治療后早期二氫喋啶還原酶的表達水平變化，但根據治療3周后結果發現二氫喋啶還原酶蛋白表達仍處于正常水平，是否是bFGF長循環脂質體的作用尚不清楚。總之，二氫喋啶還原酶保持正常水平對神經遞質的合成及脊髓神經功能恢復具有重要意義。
3.1.7 硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶
硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶主要作用包括抗氧化防御、多途徑抑制細胞凋亡、清除過氧化物及羥基[29-31]。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶呈上調趨勢，經bFGF長循環脂質體治療后出現下調，分析其上調與脊髓牽張性損傷后的細胞凋亡與缺血再灌注損傷，即脂質過氧化、大量自由基產生密切相關，硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶的強烈抗氧化和清除過氧化物作用可能對急性脊髓損傷產生一定保護作用。目前關于硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶在脊髓損傷中研究的報道極少，更多機制尚待研究。由于在bFGF長循環脂質體治療后早期未進行蛋白組學檢測，因此不能確切了解治療后早期硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶的表達水平變化。
3.1.8 磷酸丙糖異構酶
磷酸丙糖異構酶參與糖酵解途徑或有氧氧化，參與人體內能量代謝；并將糖酵解途徑與丙酮醛途徑相偶聯，通過丙酮醛途徑介導細胞損傷、細胞凋亡等。已有研究表明磷酸丙糖異構酶在脊髓損傷后可發生變化[32]。本研究顯示在脊髓牽張性損傷后磷酸丙糖異構酶呈下調趨勢，經bFGF長循環脂質體治療后仍下調，提示磷酸丙糖異構酶可能主要通過能量代謝途徑對脊髓神經細胞能量代謝產生影響，而通過丙酮醛途徑干預細胞凋亡等作用的可能性較低。磷酸丙糖異構酶與脊髓牽張性損傷后的神經功能恢復可能具有一定相關性，但同時是否可將磷酸丙糖異構酶視為判斷脊髓損傷程度及恢復狀況的指標之一，以及bFGF長循環脂質體通過磷酸丙糖異構酶的何種作用機制對脊髓損傷起作用尚待研究。
3.1.9 醛糖還原酶
醛糖還原酶可抑制TNF-α誘導的血管平滑肌細胞的增殖、抗氧化應激，上調環氧化酶2、前列腺素E2及人結腸癌細胞水平[33-35]。我們的前期研究顯示，脊髓牽張性損傷組醛糖還原酶表達相比假手術組出現了明顯上調[11]，可能與其損傷后氧化應激增加導致醛糖還原酶表達增加，促進炎性因子產生、參與炎性反應有關。本研究中，B組應用bFGF長循環脂質體治療3周后醛糖還原酶表達與A組相比出現了下降，可能與bFGF長循環脂質體抑制醛糖還原酶以減弱氧化應激有關，是防止脊髓牽張損傷后繼發損傷的有效途徑。目前已有足夠證據證明醛糖還原酶抑制劑可應用于內毒素相關的炎性疾病[36]，其是否可作為脊髓損傷治療的一個有效方法尚需研究。
3.1.10 2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶
2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶表達的改變表明其可能參與了少突膠質細胞凋亡的調節[37]。研究顯示，2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶在微管蛋白與RNA的關聯中起著橋梁作用，可調節中樞神經系統中少突膠質細胞mRNAs的表達[38]。本研究顯示脊髓牽張性損傷后β微管蛋白呈上調趨勢，2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶表達均呈下調趨勢，二者可能共同作用參與調節中樞神經系統中少突膠質細胞mRNAs的表達、促進少突膠質細胞分化。B組應用bFGF長循環脂質體治療3周后2'，3'-環核苷酸-3'-磷酸二酯酶表達與A組相比有明顯上調趨勢，恢復至正常。提示其經蛛網膜下腔途徑給藥對少突膠質細胞凋亡有調節作用。
3.2 脊髓牽張性損傷與bFGF長循環脂質體治療的蛋白質組學差異
磷酸丙糖異構酶、碳酸酐酶、碳酸酐酶Ⅲ、醛糖還原酶、硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶、β微管蛋白等在脊髓牽張性損傷和bFGF長循環脂質體治療后蛋白表達量均發生了明顯變化，這些蛋白點可能對研究脊髓牽張性損傷的損傷和修復機制以及bFGF長循環脂質體治療脊髓損傷的作用機制有重要意義。其余12種蛋白尚未見與脊髓損傷有關的報道，這些新發現的差異蛋白可能為深入研究以上內容提供有價值的線索。本研究中3種未知蛋白在脊髓損傷后表達明顯上調，提示這些未知蛋白可能與脊髓損傷后細胞凋亡、修復和再生機制有關；bFGF長循環脂質體治療后第22號蛋白點（序列號gi|1334163）表達明顯下調，可能是bFGF長循環脂質體對脊髓牽張性損傷產生作用的重要蛋白。此3個蛋白將在今后研究中進一步探討其本身的結構和功能，以及與脊髓損傷修復和中樞神經系統可塑性的相關關系。研究中發現的一些主要參與能量代謝的蛋白可能同時參與調節細胞凋亡過程，甚至占有重要地位；一些蛋白質組成員在參與神經傳導、能量代謝、細胞凋亡等方面具有一定相關性，其具體相互作用機制需進一步研究。
