引用本文： 石偉哲, 肖海軍, 薛鋒, 吳江. 基質金屬蛋白酶9在大鼠跟腱異位骨化模型中的動態變化研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(9): 1133-1138. doi: 10.7507/1002-1892.20140246 復制
異位骨化是指不應發生骨化的軟組織內病理性骨組織形成，多見于骨骼肌肉創傷、骨關節術后、神經系統損傷等。隨著人工關節置換的廣泛應用以及交通傷導致的高能量創傷數量增加，其發病率也顯著上升[1]。目前，異位骨化的發病機制仍不明確，早期診斷較困難，研究表明它可能與細胞外基質重塑及鈣化有關[2]。基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）是一種糖化蛋白酶，由間質細胞（如巨噬細胞、中性粒細胞、毛細血管內皮細胞）分泌，參與內皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞和基質角質細胞核遷移等，被認為是早期細胞外基質重組的生物標記物[3]。本研究通過建立大鼠跟腱異位骨化模型，觀察創傷早期不同時間點血清與局部組織中MMP-9水平變化，初步探討MMP-9對預測異位骨化發生的價值。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～5周齡雄性SD大鼠132只，體重（135.0±6.5）g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司；于華東師范大學生命醫學研究所實驗動物中心SPF級環境適應性飼養1周。ELISA試劑盒（R & D systems公司，美國）；MMP-9抗體（Abcam公司，英國）；山羊抗兔抗體（Jackson公司，美國）；TRIzol（Invitrogen公司，美國）；反轉錄試劑盒[寶生物工程（大連）公司]；PCR試劑盒[伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]。X線機（Kodak公司，美國）；光鏡（Olympus公司，日本）；微量分光光度儀（NanoDrop公司，美國）。
1.2 動物模型制備及分組
取132只大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.2～0.3 mL/100 g）麻醉后，隨機分為兩組，每組66只。實驗組：無菌條件下，于大鼠右后肢作后外側入路暴露跟腱，用血管鉗反復鉗夾5次，造成一定創傷，然后在中點將跟腱完全切斷，不予縫合，關閉切口。對照組：同實驗組方法暴露跟腱，不作任何處理，直接關閉切口。
1.3 觀測指標
術后2、3、4、5、6、7、8 d兩組各取8只大鼠，同上法麻醉后行大鼠心臟采血，然后斷頸處死，按原切口入路收集跟腱和周圍軟組織，行大體、組織學及免疫組織化學染色觀察以及ELISA、RT-PCR檢測。對兩組各剩余的10只大鼠，術后5、10周攝X線片及10周行組織學觀察，綜合評價異位骨化形成情況。
1.3.1 大體觀察
術后觀察兩組大鼠成活、切口愈合情況。各時間點觀察兩組大鼠跟腱組織顏色、厚度、彈性及硬度。
1.3.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
各時間點取兩組部分跟腱組織置于10%中性甲醛固定24 h，15%EDTA脫鈣1周，脫鈣完全后梯度乙醇脫水，透明石蠟包埋，5 μm厚切片。取部分切片常規HE染色，光鏡觀察。剩余切片脫蠟水化，抗原修復，PBS洗滌，3%H2O2 37 ℃孵育30 min，PBS洗滌；10%山羊血清室溫孵育1 h；滴加一抗（1：200）150 μL，用PBS代替一抗作陰性對照，4℃孵育過夜，PBS洗滌；滴加二抗（1：200）150 μL，室溫孵育1 h，PBS洗滌；DAB顯色5～10 min，PBS洗滌；蘇木精復染1 min，自來水沖洗15 min；脫水、封片，光鏡下觀察。
1.3.3 ELISA檢測MMP-9蛋白含量
各時間點檢測兩組大鼠血清及跟腱組織中MMP-9蛋白含量。取100 mg跟腱組織，PBS清洗后剪成小塊進行研磨，加入1 mL PBS制成勻漿；大鼠血液標本于室溫放置2 h后，以1 000×g離心15 min，取上清液。將制備的標本按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測MMP-9蛋白含量。
1.3.4 RT-PCR檢測MMP-9基因表達
各時間點取兩組跟腱組織，置于經DEPC處理并加入1 mL TRIzol的5 mL EP管中。徹底勻漿后，加入200 μL氯仿混勻，以10 000×g離心15 min。移取400 μL上清至另一1.5 mL EP管中，加入400 μL異丙醇，充分混勻，— 70℃助沉30 min，以10 000×g離心10 min；徹底棄上清液，加入1 mL冰75%乙醇，以10 000×g離心5 min。室溫下靜置10～15 min，使RNA適度干燥。用不含Rnase去離子水溶解后取1 μL測定濃度。引物設計：MMP-9，上游5'-CGCCACCACCGCCAACTATGA-3'，下游5'-ACGTCGTCGCGCACCAGAGG-3'；內參照18s引物，上游5'-AGTCGCCGTGCCTACCAT-3'，下游5'-CGGGTCGGGAGTGGGTAAT-3'。采用反轉錄試劑盒進行RNA反轉錄及PCR擴增。以與內參照18s基因表達量的比值作為樣品MMP-9基因相對表達量。
1.3.5 異位骨化診斷
① X線片觀察：術后5、10周，對照組及實驗組大鼠同上法麻醉后攝右后肢側位X線片，觀察是否存在高亮陰影。②組織學觀察：術后10周攝片后，斷頸處死兩組大鼠，按原切口入路大體觀察跟腱形態，然后取跟腱組織同1.3.2方法切片，常規HE染色，光鏡觀察。綜合X線片及組織學觀察結果，如X線片示跟腱部位出現高亮陰影，且組織學觀察示骨組織存在，確診為異位骨化。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tamhane’s T2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
所有大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好。各時間點對照組大鼠跟腱無明顯變化，跟腱呈白色，寬約3 mm、厚1 mm。實驗組大鼠術后2 d跟腱斷端出現萎縮；3 d跟腱斷端發生粘連，斷端可觸及硬結，分離肌肉組織見跟腱斷端硬結呈白色；4、5 d跟腱硬結硬度增加，仍呈白色，跟腱斷端間出現淡黃色增生纖維結締組織相連，質地柔韌；6～8 d跟腱斷端間纖維結締組織呈淡黃色，柔軟度及彈性下降，跟腱斷端硬結仍呈白色。見圖 1。
圖1
兩組跟腱組織大體觀察?對照組5 d ?實驗組2 d ?實驗組3 d ?實驗組4 d ?實驗組5 d ?實驗組6 d ?實驗組7 d ?實驗組8 d ??圖 2兩組跟腱組織組織學觀察（HE×200）?對照組5 d ?實驗組2 d ?實驗組3 d ?實驗組4 d ?實驗組5 d ?實驗組6 d ?實驗組7 d ?實驗組8 d
Figure1.
Gross observation of Achilles tendon tissue in 2 groups ?Control group at 5 days ?Experimental group at 2 days ?Experimental group at 3 days ?Experimental group at 4 days ?Experimental group at 5 days ?Experimental group at 6 days ?Experimental group at 7 days ?Experimental group at 8 days ??Fig. 2 Histological observation of Achilles tendon tissue in 2 groups (HE×200) ?Control group at 5 days ?Experimental group at 2 days ?Experimental group at 3 days ?Experimental group at 4 days ? Experimental group at 5 days ?Experimental group at 6 days ?Experimental group at 7 days ?Experimental group at 8 days
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
各時間點對照組HE染色觀察情況一致，跟腱組織為規則結締組織。實驗組術后2、3 d可見大量炎性細胞浸潤及出現不規則結締組織，粗大的膠原纖維縱橫交織，形成致密板層結構，纖維間含有基質細胞及成纖維細胞；4、5 d可見大量不規則結締組織及巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤；6～8 d不規則結締組織中出現軟骨細胞并逐漸增多。見圖 2。
各時間點對照組免疫組織化學染色觀察情況一致，鏡下可見少量淡黃色顆粒。實驗組各時間點可見大量深褐色顆粒，較對照組顏色明顯加深。見圖 3。
圖3
兩組跟腱組織免疫組織化學染色觀察（× 200）?對照組5 d ?實驗組2 d ?實驗組3 d ?實驗組4 d ?實驗組5 d ?實驗組6 d ?實驗組7 d ?實驗組8 d ??圖 4各時間點兩組MMP-9蛋白含量?血清?跟腱組織??圖 5各時間點兩組MMP-9基因相對表達量??圖 6兩組X線片觀察?對照組術后5周?對照組術后10周?實驗組術后5周?實驗組術后10周??圖 7術后10周兩組組織學觀察（HE×200）?對照組?實驗組箭頭示軟骨細胞
Figure3.
Immunohistochemical staining observation of Achilles tendon tissue in 2 groups (× 200) ?Control group at 5 days ?Experimental group at 2 days ?Experimental group at 3 days ?Experimental group at 4 days ?Experimental group at 5 days ?Experimental group at 6 days ?Experimental group at 7 days ?Experimental group at 8 days ??Fig. 4 The expression of MMP-9 protein in 2 groups at different time points ? Serum ? Achilles tendon ??Fig. 5 The expression of MMP-9 mRNA in 2 groups at different time points ??Fig. 6 X-ray films of 2 groups ?Control group at 5 weeks ?Control group at 10 weeks ?Experimental group at 5 weeks ?Experimental group at 10 weeks ??Fig. 7 Histological observation of 2 groups at 10 weeks (HE×200) ?Control group ?Experimental group Arrow indicated cartilage cells
2.3 MMP-9蛋白及基因檢測
各時間點實驗組MMP-9蛋白含量及基因相對表達量均顯著高于對照組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。組內比較：實驗組術后MMP-9蛋白含量呈明顯上升趨勢，與術后2 d相比，4 d時顯著升高，5、6、7、8 d保持較高水平，差異有統計學意義（P < 0.05）；實驗組MMP-9基因相對表達量總體呈上升趨勢，與術后2 d相比，6 d時基因相對表達量達峰值，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。對照組術后MMP-9蛋白含量逐漸上升，與術后2 d相比，4 d時達峰值后含量降低，維持較低水平，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；MMP-9基因相對表達量各時間點間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4、5。
2.4 異位骨化診斷
X線片觀察示，對照組均無高亮陰影出現；術后5周實驗組8只大鼠跟腱部位出現高亮陰影，10周時10只均出現高亮陰影。見圖 6。術后10周組織學觀察示，實驗組可見成熟的骨組織、骨小梁等結構，與X線片顯示高亮陰影部位對應；跟腱組織中可見軟骨細胞。對照組跟腱組織仍為規則結締組織。見圖 7。
根據X線片及組織學觀察結果，術后10周實驗組大鼠跟腱組織均發生異位骨化，對照組均無異位骨化發生。
3 討論
目前，相關異位骨化研究中動物模型制備方法較多，例如對家兔膝關節進行暴力按摩誘導異位骨化[4]、大鼠肌肉注射BMP誘導異位骨化[3]等。本實驗采用大鼠跟腱切斷法誘導異位骨化，該方法能在相對較短時間內成功誘導形成異位骨，而且在形態和影像學上與臨床創傷手術導致的異位骨化病理狀態相似，重復性好[5-7]。本研究中，術后10周經X線片及組織學觀察顯示，實驗組均成功制備大鼠跟腱異位骨化模型。
MMP是降解細胞外基質的重要蛋白水解酶類，通過生長因子β進行調節，一種MMP蛋白可降解多種細胞外基質，也可通過激活其他類型MMP蛋白進而發生作用，形成瀑布反應[8-9]。研究表明，MMP參與了骨重塑階段和血管生成等重建過程，在神經性異位骨化研究中被視為潛在的生物標記物[10]。MMP在創傷愈合修復中也起到重要作用，在創傷早期炎性浸潤階段，中性粒細胞及巨噬細胞等分泌MMP，促進細胞遷移及新生血管形成，并在組織成熟及重塑階段發揮作用[11-13]。MMP-9是明膠酶一個重要組成部分，它具有降解變性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白能力，也可以對Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ型膠原及彈性蛋白、明膠等小分子細胞外基質成分起分解作用[14]。在正常人體中MMP-9表達量較少，正常軟骨組織中僅有少量軟骨表達MMP-9[15]。Rodenberg等[3]發現在BMP-2誘導大鼠股四頭肌異位骨化的病理過程中，MMP-9在細胞外基質重組中起重要作用，與異位骨化形成相關。因此，本研究選擇對創傷早期大鼠跟腱組織中MMP-9水平進行觀測，探討其能否作為預測異位骨化形成的指標。
異位骨化形成與骨痂形成在組織學上無區別，有學者提出了在軟組織中誘導成骨的3個必需條件：成骨前體細胞（靶細胞）、成骨誘導因子及適宜環境[16]。本研究發現，術后實驗組MMP-9蛋白含量呈升高趨勢，且各時間點實驗組含量顯著高于對照組，提示MMP-9在異位骨化早期以及創傷愈合過程中起作用，表明通過檢測MMP-9水平對早期診斷異位骨化具有一定提示作用。組織學觀察示，術后實驗組大鼠跟腱組織受炎性細胞浸潤，部分規則致密結締組織變為不規則致密結締組織，出現粗大的膠原纖維縱橫交織，形成致密板層結構，纖維間含有基質細胞及成纖維細胞。在術后3 d局部組織出現巨噬細胞及中性粒細胞浸潤。免疫組織化學染色提示，MMP-9蛋白由中性粒細胞與巨噬細胞產生，并在跟腱局部組織發生反應。跟腱組織行MMP-9基因定量檢測顯示，實驗組中跟腱局部組織中的MMP-9基因表達明顯高于對照組，且隨著時間延長，表達呈上升趨勢，對照組跟腱組織中MMP-9基因基本保持較低水平表達。進一步提示異位骨化形成早期，跟腱局部產生的MMP-9高于創傷愈合過程，并在局部起重要作用。
我們認為，在異位骨化形成早期大鼠跟腱組織受炎性細胞浸潤，中性粒細胞及巨噬細胞等分泌MMP-9參與細胞遷移及細胞外基質的降解及重塑過程。實驗組大鼠跟腱組織中出現不規則致密結締組織及大量炎性細胞持續浸潤，同時由于MMP-9基因表達具有“誘導性”，即細胞因子、激素、生長因子等多種因素均能誘導增加MMP-9的表達[17-18]，導致MMP-9蛋白及一些特定生長因子（如VEGF、BMP等）在跟腱組織中持續升高。BMP具有很強的誘導MSCs分化成成骨細胞能力[19]，VEGF在軟骨組織發生、發育及再生過程中也起到重要作用。有研究顯示，外源性VEGF能增加體外培養的成骨細胞ALP活性，在誘導成骨細胞遷移、增強ALP活性中起重要作用[20]。ALP可使焦磷酸酶分解，由此促進組織中鈣鹽沉積。隨著鈣鹽在組織中沉積，骨樣組織可逐步變為骨組織[21]，這可能提供了異位骨化形成的適宜環境及其誘導因子。所以我們認為MMP-9在細胞外基質降解、重塑、鈣化等病理生理過程中起重要作用，并且刺激多種生長因子分泌，是異位骨化病變早期的重要標記物，對MMP-9的研究可能對早期診斷異位骨化發生具有重要意義。
異位骨化是指不應發生骨化的軟組織內病理性骨組織形成，多見于骨骼肌肉創傷、骨關節術后、神經系統損傷等。隨著人工關節置換的廣泛應用以及交通傷導致的高能量創傷數量增加，其發病率也顯著上升[1]。目前，異位骨化的發病機制仍不明確，早期診斷較困難，研究表明它可能與細胞外基質重塑及鈣化有關[2]。基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）是一種糖化蛋白酶，由間質細胞（如巨噬細胞、中性粒細胞、毛細血管內皮細胞）分泌，參與內皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞和基質角質細胞核遷移等，被認為是早期細胞外基質重組的生物標記物[3]。本研究通過建立大鼠跟腱異位骨化模型，觀察創傷早期不同時間點血清與局部組織中MMP-9水平變化，初步探討MMP-9對預測異位骨化發生的價值。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～5周齡雄性SD大鼠132只，體重（135.0±6.5）g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司；于華東師范大學生命醫學研究所實驗動物中心SPF級環境適應性飼養1周。ELISA試劑盒（R & D systems公司，美國）；MMP-9抗體（Abcam公司，英國）；山羊抗兔抗體（Jackson公司，美國）；TRIzol（Invitrogen公司，美國）；反轉錄試劑盒[寶生物工程（大連）公司]；PCR試劑盒[伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]。X線機（Kodak公司，美國）；光鏡（Olympus公司，日本）；微量分光光度儀（NanoDrop公司，美國）。
1.2 動物模型制備及分組
取132只大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.2～0.3 mL/100 g）麻醉后，隨機分為兩組，每組66只。實驗組：無菌條件下，于大鼠右后肢作后外側入路暴露跟腱，用血管鉗反復鉗夾5次，造成一定創傷，然后在中點將跟腱完全切斷，不予縫合，關閉切口。對照組：同實驗組方法暴露跟腱，不作任何處理，直接關閉切口。
1.3 觀測指標
術后2、3、4、5、6、7、8 d兩組各取8只大鼠，同上法麻醉后行大鼠心臟采血，然后斷頸處死，按原切口入路收集跟腱和周圍軟組織，行大體、組織學及免疫組織化學染色觀察以及ELISA、RT-PCR檢測。對兩組各剩余的10只大鼠，術后5、10周攝X線片及10周行組織學觀察，綜合評價異位骨化形成情況。
1.3.1 大體觀察
術后觀察兩組大鼠成活、切口愈合情況。各時間點觀察兩組大鼠跟腱組織顏色、厚度、彈性及硬度。
1.3.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
各時間點取兩組部分跟腱組織置于10%中性甲醛固定24 h，15%EDTA脫鈣1周，脫鈣完全后梯度乙醇脫水，透明石蠟包埋，5 μm厚切片。取部分切片常規HE染色，光鏡觀察。剩余切片脫蠟水化，抗原修復，PBS洗滌，3%H2O2 37 ℃孵育30 min，PBS洗滌；10%山羊血清室溫孵育1 h；滴加一抗（1：200）150 μL，用PBS代替一抗作陰性對照，4℃孵育過夜，PBS洗滌；滴加二抗（1：200）150 μL，室溫孵育1 h，PBS洗滌；DAB顯色5～10 min，PBS洗滌；蘇木精復染1 min，自來水沖洗15 min；脫水、封片，光鏡下觀察。
1.3.3 ELISA檢測MMP-9蛋白含量
各時間點檢測兩組大鼠血清及跟腱組織中MMP-9蛋白含量。取100 mg跟腱組織，PBS清洗后剪成小塊進行研磨，加入1 mL PBS制成勻漿；大鼠血液標本于室溫放置2 h后，以1 000×g離心15 min，取上清液。將制備的標本按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測MMP-9蛋白含量。
1.3.4 RT-PCR檢測MMP-9基因表達
各時間點取兩組跟腱組織，置于經DEPC處理并加入1 mL TRIzol的5 mL EP管中。徹底勻漿后，加入200 μL氯仿混勻，以10 000×g離心15 min。移取400 μL上清至另一1.5 mL EP管中，加入400 μL異丙醇，充分混勻，— 70℃助沉30 min，以10 000×g離心10 min；徹底棄上清液，加入1 mL冰75%乙醇，以10 000×g離心5 min。室溫下靜置10～15 min，使RNA適度干燥。用不含Rnase去離子水溶解后取1 μL測定濃度。引物設計：MMP-9，上游5'-CGCCACCACCGCCAACTATGA-3'，下游5'-ACGTCGTCGCGCACCAGAGG-3'；內參照18s引物，上游5'-AGTCGCCGTGCCTACCAT-3'，下游5'-CGGGTCGGGAGTGGGTAAT-3'。采用反轉錄試劑盒進行RNA反轉錄及PCR擴增。以與內參照18s基因表達量的比值作為樣品MMP-9基因相對表達量。
1.3.5 異位骨化診斷
① X線片觀察：術后5、10周，對照組及實驗組大鼠同上法麻醉后攝右后肢側位X線片，觀察是否存在高亮陰影。②組織學觀察：術后10周攝片后，斷頸處死兩組大鼠，按原切口入路大體觀察跟腱形態，然后取跟腱組織同1.3.2方法切片，常規HE染色，光鏡觀察。綜合X線片及組織學觀察結果，如X線片示跟腱部位出現高亮陰影，且組織學觀察示骨組織存在，確診為異位骨化。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tamhane’s T2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
所有大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好。各時間點對照組大鼠跟腱無明顯變化，跟腱呈白色，寬約3 mm、厚1 mm。實驗組大鼠術后2 d跟腱斷端出現萎縮；3 d跟腱斷端發生粘連，斷端可觸及硬結，分離肌肉組織見跟腱斷端硬結呈白色；4、5 d跟腱硬結硬度增加，仍呈白色，跟腱斷端間出現淡黃色增生纖維結締組織相連，質地柔韌；6～8 d跟腱斷端間纖維結締組織呈淡黃色，柔軟度及彈性下降，跟腱斷端硬結仍呈白色。見圖 1。
圖1
兩組跟腱組織大體觀察?對照組5 d ?實驗組2 d ?實驗組3 d ?實驗組4 d ?實驗組5 d ?實驗組6 d ?實驗組7 d ?實驗組8 d ??圖 2兩組跟腱組織組織學觀察（HE×200）?對照組5 d ?實驗組2 d ?實驗組3 d ?實驗組4 d ?實驗組5 d ?實驗組6 d ?實驗組7 d ?實驗組8 d
Figure1.
Gross observation of Achilles tendon tissue in 2 groups ?Control group at 5 days ?Experimental group at 2 days ?Experimental group at 3 days ?Experimental group at 4 days ?Experimental group at 5 days ?Experimental group at 6 days ?Experimental group at 7 days ?Experimental group at 8 days ??Fig. 2 Histological observation of Achilles tendon tissue in 2 groups (HE×200) ?Control group at 5 days ?Experimental group at 2 days ?Experimental group at 3 days ?Experimental group at 4 days ? Experimental group at 5 days ?Experimental group at 6 days ?Experimental group at 7 days ?Experimental group at 8 days
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
各時間點對照組HE染色觀察情況一致，跟腱組織為規則結締組織。實驗組術后2、3 d可見大量炎性細胞浸潤及出現不規則結締組織，粗大的膠原纖維縱橫交織，形成致密板層結構，纖維間含有基質細胞及成纖維細胞；4、5 d可見大量不規則結締組織及巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤；6～8 d不規則結締組織中出現軟骨細胞并逐漸增多。見圖 2。
各時間點對照組免疫組織化學染色觀察情況一致，鏡下可見少量淡黃色顆粒。實驗組各時間點可見大量深褐色顆粒，較對照組顏色明顯加深。見圖 3。
圖3
兩組跟腱組織免疫組織化學染色觀察（× 200）?對照組5 d ?實驗組2 d ?實驗組3 d ?實驗組4 d ?實驗組5 d ?實驗組6 d ?實驗組7 d ?實驗組8 d ??圖 4各時間點兩組MMP-9蛋白含量?血清?跟腱組織??圖 5各時間點兩組MMP-9基因相對表達量??圖 6兩組X線片觀察?對照組術后5周?對照組術后10周?實驗組術后5周?實驗組術后10周??圖 7術后10周兩組組織學觀察（HE×200）?對照組?實驗組箭頭示軟骨細胞
Figure3.
Immunohistochemical staining observation of Achilles tendon tissue in 2 groups (× 200) ?Control group at 5 days ?Experimental group at 2 days ?Experimental group at 3 days ?Experimental group at 4 days ?Experimental group at 5 days ?Experimental group at 6 days ?Experimental group at 7 days ?Experimental group at 8 days ??Fig. 4 The expression of MMP-9 protein in 2 groups at different time points ? Serum ? Achilles tendon ??Fig. 5 The expression of MMP-9 mRNA in 2 groups at different time points ??Fig. 6 X-ray films of 2 groups ?Control group at 5 weeks ?Control group at 10 weeks ?Experimental group at 5 weeks ?Experimental group at 10 weeks ??Fig. 7 Histological observation of 2 groups at 10 weeks (HE×200) ?Control group ?Experimental group Arrow indicated cartilage cells
2.3 MMP-9蛋白及基因檢測
各時間點實驗組MMP-9蛋白含量及基因相對表達量均顯著高于對照組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。組內比較：實驗組術后MMP-9蛋白含量呈明顯上升趨勢，與術后2 d相比，4 d時顯著升高，5、6、7、8 d保持較高水平，差異有統計學意義（P < 0.05）；實驗組MMP-9基因相對表達量總體呈上升趨勢，與術后2 d相比，6 d時基因相對表達量達峰值，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。對照組術后MMP-9蛋白含量逐漸上升，與術后2 d相比，4 d時達峰值后含量降低，維持較低水平，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；MMP-9基因相對表達量各時間點間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4、5。
2.4 異位骨化診斷
X線片觀察示，對照組均無高亮陰影出現；術后5周實驗組8只大鼠跟腱部位出現高亮陰影，10周時10只均出現高亮陰影。見圖 6。術后10周組織學觀察示，實驗組可見成熟的骨組織、骨小梁等結構，與X線片顯示高亮陰影部位對應；跟腱組織中可見軟骨細胞。對照組跟腱組織仍為規則結締組織。見圖 7。
根據X線片及組織學觀察結果，術后10周實驗組大鼠跟腱組織均發生異位骨化，對照組均無異位骨化發生。
3 討論
目前，相關異位骨化研究中動物模型制備方法較多，例如對家兔膝關節進行暴力按摩誘導異位骨化[4]、大鼠肌肉注射BMP誘導異位骨化[3]等。本實驗采用大鼠跟腱切斷法誘導異位骨化，該方法能在相對較短時間內成功誘導形成異位骨，而且在形態和影像學上與臨床創傷手術導致的異位骨化病理狀態相似，重復性好[5-7]。本研究中，術后10周經X線片及組織學觀察顯示，實驗組均成功制備大鼠跟腱異位骨化模型。
MMP是降解細胞外基質的重要蛋白水解酶類，通過生長因子β進行調節，一種MMP蛋白可降解多種細胞外基質，也可通過激活其他類型MMP蛋白進而發生作用，形成瀑布反應[8-9]。研究表明，MMP參與了骨重塑階段和血管生成等重建過程，在神經性異位骨化研究中被視為潛在的生物標記物[10]。MMP在創傷愈合修復中也起到重要作用，在創傷早期炎性浸潤階段，中性粒細胞及巨噬細胞等分泌MMP，促進細胞遷移及新生血管形成，并在組織成熟及重塑階段發揮作用[11-13]。MMP-9是明膠酶一個重要組成部分，它具有降解變性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白能力，也可以對Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ型膠原及彈性蛋白、明膠等小分子細胞外基質成分起分解作用[14]。在正常人體中MMP-9表達量較少，正常軟骨組織中僅有少量軟骨表達MMP-9[15]。Rodenberg等[3]發現在BMP-2誘導大鼠股四頭肌異位骨化的病理過程中，MMP-9在細胞外基質重組中起重要作用，與異位骨化形成相關。因此，本研究選擇對創傷早期大鼠跟腱組織中MMP-9水平進行觀測，探討其能否作為預測異位骨化形成的指標。
異位骨化形成與骨痂形成在組織學上無區別，有學者提出了在軟組織中誘導成骨的3個必需條件：成骨前體細胞（靶細胞）、成骨誘導因子及適宜環境[16]。本研究發現，術后實驗組MMP-9蛋白含量呈升高趨勢，且各時間點實驗組含量顯著高于對照組，提示MMP-9在異位骨化早期以及創傷愈合過程中起作用，表明通過檢測MMP-9水平對早期診斷異位骨化具有一定提示作用。組織學觀察示，術后實驗組大鼠跟腱組織受炎性細胞浸潤，部分規則致密結締組織變為不規則致密結締組織，出現粗大的膠原纖維縱橫交織，形成致密板層結構，纖維間含有基質細胞及成纖維細胞。在術后3 d局部組織出現巨噬細胞及中性粒細胞浸潤。免疫組織化學染色提示，MMP-9蛋白由中性粒細胞與巨噬細胞產生，并在跟腱局部組織發生反應。跟腱組織行MMP-9基因定量檢測顯示，實驗組中跟腱局部組織中的MMP-9基因表達明顯高于對照組，且隨著時間延長，表達呈上升趨勢，對照組跟腱組織中MMP-9基因基本保持較低水平表達。進一步提示異位骨化形成早期，跟腱局部產生的MMP-9高于創傷愈合過程，并在局部起重要作用。
我們認為，在異位骨化形成早期大鼠跟腱組織受炎性細胞浸潤，中性粒細胞及巨噬細胞等分泌MMP-9參與細胞遷移及細胞外基質的降解及重塑過程。實驗組大鼠跟腱組織中出現不規則致密結締組織及大量炎性細胞持續浸潤，同時由于MMP-9基因表達具有“誘導性”，即細胞因子、激素、生長因子等多種因素均能誘導增加MMP-9的表達[17-18]，導致MMP-9蛋白及一些特定生長因子（如VEGF、BMP等）在跟腱組織中持續升高。BMP具有很強的誘導MSCs分化成成骨細胞能力[19]，VEGF在軟骨組織發生、發育及再生過程中也起到重要作用。有研究顯示，外源性VEGF能增加體外培養的成骨細胞ALP活性，在誘導成骨細胞遷移、增強ALP活性中起重要作用[20]。ALP可使焦磷酸酶分解，由此促進組織中鈣鹽沉積。隨著鈣鹽在組織中沉積，骨樣組織可逐步變為骨組織[21]，這可能提供了異位骨化形成的適宜環境及其誘導因子。所以我們認為MMP-9在細胞外基質降解、重塑、鈣化等病理生理過程中起重要作用，并且刺激多種生長因子分泌，是異位骨化病變早期的重要標記物，對MMP-9的研究可能對早期診斷異位骨化發生具有重要意義。
