引用本文： 王繼宏, 李恒彬, 溫樹正. 結締組織生長因子在大鼠坐骨神經慢性卡壓損傷中的表達及紅景天對其表達水平影響的研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(9): 1125-1132. doi: 10.7507/1002-1892.20140245 復制
慢性神經卡壓在臨床上較為常見，長期神經卡壓會使神經組織水腫、變性，細胞外基質顯著增生，導致神經功能下降[1]。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是多種組織變性的重要媒介，可在纖維化變性組織中過度表達[2]。紅景天作為一種環境適應原性藥物，在抗缺氧、抗疲勞等方面具有良好功效，其對缺氧導致的神經功能損傷修復作用已得到證實[3-4]，但對神經慢性卡壓損傷的修復作用罕見報道[5]。本研究通過建立大鼠坐骨神經卡壓模型，模擬人體神經慢性卡壓病理生理過程，觀察CTGF在神經慢性卡壓損傷過程中的表達及紅景天對CTGF表達水平的影響，為慢性神經卡壓的臨床治療及效果評價提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級健康成年雄性SD大鼠45只，體重（200±15）g，由內蒙古農業大學實驗動物中心提供。
戊巴比妥鈉（湖北鴻運隆生物科技有限公司）；紅景天膠囊（每100克紅景天中含紅景天苷0.4 g；西寧三普藥業股份有限公司）；DAB顯色液（武漢博士德生物工程有限公司）；免疫組織化學試劑盒及抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。電生理儀（DANTEC公司，丹麥）；PCR擴增儀（HYBAID公司，英國）；神經肌電圖儀（上海海神醫療電子儀器有限公司）；石蠟切片機（Leica公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；電子天平（Sartorius公司，德國）；HS1300型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；高速離心機（Sigma公司，德國）；勻漿機（IKA公司，德國）；JEM-2100F透射電鏡（日本電子株式會社）；Quantity One4.4.0軟件（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將45只大鼠隨機分成3組，每組15只；A組為假手術組，B組為坐骨神經慢性卡壓組，C組為坐骨神經卡壓+紅景天干預組。3組常規分籠飼養，適宜溫、濕度，自由飲水、進食。
腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉3組大鼠，沿右后肢背側作縱切口，暴露股二頭肌后鈍性分離，游離周圍結締組織，充分暴露坐骨神經。A組大鼠僅暴露坐骨神經后直接縫合切口。B、C組大鼠采用Mackinnon法[6]建立坐骨神經慢性卡壓模型，于梨狀肌下緣約0.5 cm處分離坐骨神經，將長約10 mm、內徑1 mm的硅膠管縱向切開后套住坐骨神經，然后用3條5-0尼龍線捆扎固定硅膠管至與神經直徑相當，使坐骨神經受到環形擠壓；20 min后檢測大鼠傷側坐骨神經復合肌肉動作電位（compound muscle action potential，CMAP）波幅及其遠端運動潛伏期（distal motor latency，DML），當神經運動傳導速度（motor conduction velocity，MCV）降至10 m/s以下，CMAP波幅 < 2 mV，DML > （5.4±0.7）ms時認為建模成功[7]；止血后縫合切口，常規飼養。C組大鼠術后每天給予紅景天灌胃，將100 g紅景天膠囊溶于50 mL純凈水制成濃度為2 g/mL的溶液，按0.5 mL/100 g體重灌胃，持續2周[5]。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察B、C組造模結果，術后3組大鼠存活及肢體運動情況。
1.3.2 坐骨神經功能指數（sciatic nerve function index，SFI）測量
參照沈寧江等[8]方法，自制一長60 cm、寬10 cm、高15 cm的兩端開口木槽，將70 g白紙裁成與木槽等長等寬后鋪于槽底。術后2、6、10周每組分別取5只大鼠，用顏料浸染雙后肢至雙踝關節水平，然后放于木槽的一端，使其自行向另一端行走，每側后肢各留下4～5個足印，選擇印記清晰的足印分別測量正常足（N）和傷側足（E）以下3個指標（結果精確至0.1 mm）：①足跡長度（print length，PL）：從足尖至足跟的最大距離；②足趾寬度（toe spread，TS）：第1趾至第5趾的距離；③中間足趾寬度（intermediary toe，IT）：第2趾至第4趾的距離。根據以下公式計算SFI：SFI=109.5 ×（TSE-TSN）/TSN-38.3 ×（PLE-PLN）/PLN + 13.3 ×（ITE-ITN）/ITE-8.8；SFI為0表示正常，為-100表示完全損傷。
1.3.3 神經功能檢測
術后各時間點SFI檢測后，取各組大鼠行神經功能檢測。檢測前肢體均用熱水復溫至40℃，采用電生理儀將針電極置于臀部、表面電極置于腘窩刺激，同心圓針極在脛骨前肌記錄MCV。另外，以刺激電流時限0.1～0.5 ms，刺激電流強度40～50 mA，測定CMAP波幅及DML。
1.3.4 甲苯胺藍染色觀察
術后各時間點神經功能檢測后，同前法麻醉大鼠，原切口入路，取坐骨神經卡壓段約1 cm。一部分標本置于10%甲醛固定，常規石蠟包埋，2 μm厚切片，切片脫蠟，蒸餾水洗3次，然后用0.1%甲苯胺藍液浸染10 min，蒸餾水洗去多余染液，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封固，光鏡下觀察。
1.3.5 透射電鏡觀察
取各時間點各組標本，2.5%戊二醛緩沖固定液固定60～120 min，鋨酸固定120 min，PBS清洗，梯度乙醇脫水，丙酮與環氧樹脂l：l浸透2 h，純環氧樹脂包埋劑浸透，包埋，超薄切片。鉛鹽染色后透射電鏡觀察。采用北航醫學圖像分析管理系統進行圖像分析，測量有髓神經纖維數、髓鞘厚度及神經纖維有效面積。
1.3.6 實時熒光定量PCR檢測CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達
取各時間點各組樣本，采用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用PCR擴增CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原，以GAPDH為內參。引物序列：CTGF上游5'-CTAAGACCTGTGGGATGGGC-3'，下游5'-CTAAGACCTGTGGGATGGGC-3'，PCR產物長度383 bp；Ⅰ型膠原上游5'-AGGAGAGAGTGCCAACT-CCA-3'，下游5'-CCACCCCAGGGATAAAAACT-3'，PCR產物長度208 bp；Ⅲ型膠原上游5'-TGGCCAAC-CAGGAGAAAGG-3'，下游5'-ATCCGTCTCGACGGG-CTGA-3'，PCR產物長度301 bp。具體步驟：取0.6 mL離心管，每管加入隨機引物2 μL、總RNA 1.0 μg混勻，70℃孵育10 min；離心管加樣：25 mmol/L MgCl2 4 μL，RT10×Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNasin Inhibiter 0.5 μL，AMV逆轉錄酶0.5 μL，加水至總體積20 μL。PCR擴增儀擴增：42℃、1 h；95℃、10 min；4℃保存；94℃預變性3 min，94℃變性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸30 s，共50個循環。應用SYBR GreenⅠ熒光染料技術行實時熒光定量PCR反應，獲取各組標本的標準曲線，各基因表達量以Ct值表示。
1.3.7 Western blot法檢測CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達
取各時間點各組樣本100 mg勻漿后提取蛋白，經上樣、轉膜、封閉后，依次加入兔抗鼠CTGF多克隆抗體（1：400）、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅰ、Ⅲ型膠原多克隆抗體（1：2 400）、ECL，曝光顯色。Quantity One4.4.0軟件分析，得到450 nm波長下的吸光度（A）值，以各蛋白與β-actin的A值比值作為各蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
造模后，B、C組大鼠坐骨神經MCV分別為（6.82±1.45）m/s和（6.78±1.34）m/s，均低于10 m/s，提示造模成功。各組大鼠均存活至實驗結束。術后2周各組大鼠均呈神經損傷表現，術側肢體活動欠靈活，以B、C組為著，膝關節呈伸直狀態，屈曲功能消失；6周后逐漸恢復，A組與健側無明顯差別，B組仍不能正常屈曲，C組膝關節屈曲程度優于B組；10周后A、C組術側下肢活動與健側相仿，B組膝關節仍不能完全屈曲。
2.2 SFI測量
3組組內術后各時間點間SFI比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。術后2周，各組間SFI比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后6、10周，A、C組SFI均優于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組SFI比較（n=5，2.3 神經功能檢測
3組組內術后各時間點間MCV、CMAP波幅和DML比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后2周，3組MCV、CMAP波幅和DML比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后6、10周，B組MCV、CMAP波幅較A、C組明顯降低，DML明顯延長，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點各組神經功能及神經纖維檢測指標比較（n=5，2.4 甲苯胺藍染色觀察
A組術后2周可見髓鞘部分水腫，偶見髓鞘形態欠規則；6周水腫消失，髓鞘形態基本規整；10周髓鞘水腫消失，形態規則。與A組相比，B組術后2周坐骨神經有明顯瓦勒變性，髓鞘形態不規則，分布不均勻；6周較多髓鞘水腫后模糊不清，失去正常髓鞘形態；10周隨著卡壓時間延長，較多髓鞘碎片殘留。C組術后2周坐骨神經髓鞘形態欠規則；6周時部分髓鞘出現水腫，隨著藥物作用時間的延長，10周時可見殘留部分碎片。見圖 1。
圖1
術后各時間點各組甲苯胺藍染色觀察（× 200）?A組2周?A組6周?A組10周?B組2周?B組6周?B組10周?C組2周?C組6周?C組10周??圖 2術后10周各組透射電鏡觀察（× 400）?A組?B組?C組
Figure1.
Toluidine blue staining observation in 3 groups after operation (× 200) ?Group A at 2 weeks ?Group A at 6 weeks ?Group A at 10 weeks ?Group B at 2 weeks ?Group B at 6 weeks ?Group B at 10 weeks ?Group C at 2 weeks ?Group C at 6 weeks ?Group C at 10 weeks ??Fig. 2 Transmission electron microscope observation in 3 groups at 10 weeks after operation (× 400) ?Group A ?Group B ? Group C
2.5 透射電鏡觀察
透射電鏡下，A組術后各時間點均可見有髓神經纖維排列整齊，形態規整，板層致密，軸索居中，大小均勻。與A組比較，B、C組術后2周有髓神經纖維大小不一，變形髓鞘較多，髓鞘板層增厚明顯，板層結構松散、變形，呈空網狀改變，密度不均呈花斑狀；軸索形態不規則，相對變細，多偏向一側，可見髓鞘套疊現象，有的逐漸消失，呈空泡樣改變；有髓神經纖維之間可見細條索狀增生膠原纖維；神經外膜及束膜血管內較多血小板淤積。術后6周，B組可見神經組織被較大的有髓神經纖維逐步取代，新生有髓神經纖維髓鞘板層致密，但較A組薄，有髓神經纖維明顯增加；神經內條索狀膠原纖維沉積增多。C組神經組織基本被有髓神經纖維取代，新生有髓神經髓鞘板層致密，厚度與A組相仿，有髓神經纖維顯著增加；神經內條索狀膠原纖維沉積明顯增多。術后10周，B組神經組織新生有髓神經纖維髓鞘板層致密，有髓神經纖維明顯增加；神經內條索狀膠原纖維沉積明顯增多。C組有髓神經纖維顯著增加；神經內條索狀膠原纖維沉積較前明顯增多。見圖 2。
3組術后隨時間延長有髓神經纖維逐漸增多，神經纖維有效面積逐漸增大，除A組髓鞘厚度在6周時最厚外，B、C組髓鞘厚度均逐漸變薄；3組組內各時間點間各指標比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后2周，B、C組有髓神經纖維數明顯少于A組，髓鞘厚度明顯大于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05），B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。術后6、10周，B、C組有髓神經纖維數明顯多于A組（P < 0.05），B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）；B組髓鞘厚度明顯小于A、C組（P < 0.05），A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。各時間點3組間神經纖維有效面積比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
2.6 實時熒光定量PCR及Western blot檢測CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達
術后2、6、10周各組CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達量均呈先增加后降低趨勢，各組組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后各時間點B組CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白相對表達量均顯著高于A、C組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 3。
表3
術后各時間點各組CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白相對表達量比較（n=5，3 討論
慢性神經卡壓損傷可致神經脫髓鞘病變及細胞外基質中膠原蛋白等過度沉積，引起神經功能障礙。卡壓時間長的患者較難自行恢復，嚴重影響了患者生活質量[9-10]。紅景天屬景天科，在兩千年前已被發現，屬藏藥的一種，能夠增強體質、提高身體對缺氧刺激的適應能力。研究發現，紅景天的主要有效成分紅景天苷可抑制神經組織中自由基和NO的產生，通過加強自由基的清除、調節凋亡和抗凋亡蛋白的表達減輕神經組織損傷，促進其修復[11]。
本研究在Mackinnon神經卡壓模型基礎上，觀察CTGF在大鼠坐骨神經慢性卡壓損傷中的表達，分析紅景天在神經恢復中的作用。有研究觀察了大鼠周圍神經慢性卡壓模型不同時期坐骨神經形態學改變，顯示卡壓8個月后有髓神經纖維髓鞘厚度減小，有髓神經纖維減少，而細小的有髓神經纖維明顯增多[12-16]。本研究中B組組織學及透射電鏡觀察同樣顯示，卡壓后坐骨神經出現大量有髓神經纖維瓦勒變性，隨時間延長瓦勒變性程度加重，神經髓鞘結構疏松，髓鞘板層呈絲狀、網狀改變，神經纖維之間大量膠原纖維增生，部分出現纖維化改變。細小的有髓神經纖維逐漸增多，存在較多增生的膠原纖維，神經纖維化也未緩解，影響神經功能的恢復。C組應用紅景天后，瓦勒變性程度逐漸減輕，較大的有髓神經纖維逐步取代變性神經纖維，新生有髓神經纖維髓鞘板層致密。
CTGF廣泛存在于心、肺、肝、腎等組織中，其基因啟動子中包含導致肝、腎、肺、皮膚等重要器官纖維化的啟動因子元件，與誘導細胞外基質沉積、導致其纖維化密切相關[17]。研究表明，CTGF長期過度表達能明顯促進纖維化的發生發展[18]。Ⅰ、Ⅲ型膠原是細胞外基質中的一種結構蛋白，是細胞外基質的主要組成成分，在組織修復尤其是神經修復過程中也發揮重要作用，是動物結締組織形成過程中的重要組成成分。術后2、6、10周各組CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達量均呈先增加后降低趨勢，各組變化過程均有統計學意義（P < 0.05）。B組坐骨神經CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達均較A、C組顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。結果提示CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達在神經卡壓過程中發揮重要作用。
神經損傷后會通過瓦勒變性、雪旺細胞增生等改變自行逐漸恢復，不同類型損傷決定了神經恢復程度的不同。SFI是觀察和評價大鼠坐骨神經損傷恢復程度的可靠指標[19]。本研究中，各組大鼠分別于術后2、6、10周作1次足印測定，結果顯示術后2周各組大鼠均呈神經損傷表現，6周開始逐漸恢復；其中A、C組恢復程度優于B組，而A、C組間差異無統計學意義。術后2周各組大鼠MCV、CMAP波幅和DML均呈神經損傷表現，6周開始逐漸恢復，各項指標組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后2周3組坐骨神經MCV、CMAP波幅和DML比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。術后6、10周，B組MCV、CMAP波幅較A、C組明顯降低，DML明顯延長，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。結果表明紅景天在神經修復中具有重要作用，修復后能明顯提高MCV及CMAP波幅，縮短DML。
綜上述，CTGF在大鼠坐骨神經卡壓后呈高表達狀態，與膠原蛋白沉積成正相關，與神經纖維的瘢痕形成密切相關。紅景天對神經功能恢復具有積極意義，能早期阻斷CTGF生物學效應，顯著促進神經功能恢復，改善大鼠神經卡壓預后。
慢性神經卡壓在臨床上較為常見，長期神經卡壓會使神經組織水腫、變性，細胞外基質顯著增生，導致神經功能下降[1]。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是多種組織變性的重要媒介，可在纖維化變性組織中過度表達[2]。紅景天作為一種環境適應原性藥物，在抗缺氧、抗疲勞等方面具有良好功效，其對缺氧導致的神經功能損傷修復作用已得到證實[3-4]，但對神經慢性卡壓損傷的修復作用罕見報道[5]。本研究通過建立大鼠坐骨神經卡壓模型，模擬人體神經慢性卡壓病理生理過程，觀察CTGF在神經慢性卡壓損傷過程中的表達及紅景天對CTGF表達水平的影響，為慢性神經卡壓的臨床治療及效果評價提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級健康成年雄性SD大鼠45只，體重（200±15）g，由內蒙古農業大學實驗動物中心提供。
戊巴比妥鈉（湖北鴻運隆生物科技有限公司）；紅景天膠囊（每100克紅景天中含紅景天苷0.4 g；西寧三普藥業股份有限公司）；DAB顯色液（武漢博士德生物工程有限公司）；免疫組織化學試劑盒及抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。電生理儀（DANTEC公司，丹麥）；PCR擴增儀（HYBAID公司，英國）；神經肌電圖儀（上海海神醫療電子儀器有限公司）；石蠟切片機（Leica公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；電子天平（Sartorius公司，德國）；HS1300型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；高速離心機（Sigma公司，德國）；勻漿機（IKA公司，德國）；JEM-2100F透射電鏡（日本電子株式會社）；Quantity One4.4.0軟件（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將45只大鼠隨機分成3組，每組15只；A組為假手術組，B組為坐骨神經慢性卡壓組，C組為坐骨神經卡壓+紅景天干預組。3組常規分籠飼養，適宜溫、濕度，自由飲水、進食。
腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉3組大鼠，沿右后肢背側作縱切口，暴露股二頭肌后鈍性分離，游離周圍結締組織，充分暴露坐骨神經。A組大鼠僅暴露坐骨神經后直接縫合切口。B、C組大鼠采用Mackinnon法[6]建立坐骨神經慢性卡壓模型，于梨狀肌下緣約0.5 cm處分離坐骨神經，將長約10 mm、內徑1 mm的硅膠管縱向切開后套住坐骨神經，然后用3條5-0尼龍線捆扎固定硅膠管至與神經直徑相當，使坐骨神經受到環形擠壓；20 min后檢測大鼠傷側坐骨神經復合肌肉動作電位（compound muscle action potential，CMAP）波幅及其遠端運動潛伏期（distal motor latency，DML），當神經運動傳導速度（motor conduction velocity，MCV）降至10 m/s以下，CMAP波幅 < 2 mV，DML > （5.4±0.7）ms時認為建模成功[7]；止血后縫合切口，常規飼養。C組大鼠術后每天給予紅景天灌胃，將100 g紅景天膠囊溶于50 mL純凈水制成濃度為2 g/mL的溶液，按0.5 mL/100 g體重灌胃，持續2周[5]。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察B、C組造模結果，術后3組大鼠存活及肢體運動情況。
1.3.2 坐骨神經功能指數（sciatic nerve function index，SFI）測量
參照沈寧江等[8]方法，自制一長60 cm、寬10 cm、高15 cm的兩端開口木槽，將70 g白紙裁成與木槽等長等寬后鋪于槽底。術后2、6、10周每組分別取5只大鼠，用顏料浸染雙后肢至雙踝關節水平，然后放于木槽的一端，使其自行向另一端行走，每側后肢各留下4～5個足印，選擇印記清晰的足印分別測量正常足（N）和傷側足（E）以下3個指標（結果精確至0.1 mm）：①足跡長度（print length，PL）：從足尖至足跟的最大距離；②足趾寬度（toe spread，TS）：第1趾至第5趾的距離；③中間足趾寬度（intermediary toe，IT）：第2趾至第4趾的距離。根據以下公式計算SFI：SFI=109.5 ×（TSE-TSN）/TSN-38.3 ×（PLE-PLN）/PLN + 13.3 ×（ITE-ITN）/ITE-8.8；SFI為0表示正常，為-100表示完全損傷。
1.3.3 神經功能檢測
術后各時間點SFI檢測后，取各組大鼠行神經功能檢測。檢測前肢體均用熱水復溫至40℃，采用電生理儀將針電極置于臀部、表面電極置于腘窩刺激，同心圓針極在脛骨前肌記錄MCV。另外，以刺激電流時限0.1～0.5 ms，刺激電流強度40～50 mA，測定CMAP波幅及DML。
1.3.4 甲苯胺藍染色觀察
術后各時間點神經功能檢測后，同前法麻醉大鼠，原切口入路，取坐骨神經卡壓段約1 cm。一部分標本置于10%甲醛固定，常規石蠟包埋，2 μm厚切片，切片脫蠟，蒸餾水洗3次，然后用0.1%甲苯胺藍液浸染10 min，蒸餾水洗去多余染液，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封固，光鏡下觀察。
1.3.5 透射電鏡觀察
取各時間點各組標本，2.5%戊二醛緩沖固定液固定60～120 min，鋨酸固定120 min，PBS清洗，梯度乙醇脫水，丙酮與環氧樹脂l：l浸透2 h，純環氧樹脂包埋劑浸透，包埋，超薄切片。鉛鹽染色后透射電鏡觀察。采用北航醫學圖像分析管理系統進行圖像分析，測量有髓神經纖維數、髓鞘厚度及神經纖維有效面積。
1.3.6 實時熒光定量PCR檢測CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達
取各時間點各組樣本，采用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用PCR擴增CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原，以GAPDH為內參。引物序列：CTGF上游5'-CTAAGACCTGTGGGATGGGC-3'，下游5'-CTAAGACCTGTGGGATGGGC-3'，PCR產物長度383 bp；Ⅰ型膠原上游5'-AGGAGAGAGTGCCAACT-CCA-3'，下游5'-CCACCCCAGGGATAAAAACT-3'，PCR產物長度208 bp；Ⅲ型膠原上游5'-TGGCCAAC-CAGGAGAAAGG-3'，下游5'-ATCCGTCTCGACGGG-CTGA-3'，PCR產物長度301 bp。具體步驟：取0.6 mL離心管，每管加入隨機引物2 μL、總RNA 1.0 μg混勻，70℃孵育10 min；離心管加樣：25 mmol/L MgCl2 4 μL，RT10×Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNasin Inhibiter 0.5 μL，AMV逆轉錄酶0.5 μL，加水至總體積20 μL。PCR擴增儀擴增：42℃、1 h；95℃、10 min；4℃保存；94℃預變性3 min，94℃變性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸30 s，共50個循環。應用SYBR GreenⅠ熒光染料技術行實時熒光定量PCR反應，獲取各組標本的標準曲線，各基因表達量以Ct值表示。
1.3.7 Western blot法檢測CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達
取各時間點各組樣本100 mg勻漿后提取蛋白，經上樣、轉膜、封閉后，依次加入兔抗鼠CTGF多克隆抗體（1：400）、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅰ、Ⅲ型膠原多克隆抗體（1：2 400）、ECL，曝光顯色。Quantity One4.4.0軟件分析，得到450 nm波長下的吸光度（A）值，以各蛋白與β-actin的A值比值作為各蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
造模后，B、C組大鼠坐骨神經MCV分別為（6.82±1.45）m/s和（6.78±1.34）m/s，均低于10 m/s，提示造模成功。各組大鼠均存活至實驗結束。術后2周各組大鼠均呈神經損傷表現，術側肢體活動欠靈活，以B、C組為著，膝關節呈伸直狀態，屈曲功能消失；6周后逐漸恢復，A組與健側無明顯差別，B組仍不能正常屈曲，C組膝關節屈曲程度優于B組；10周后A、C組術側下肢活動與健側相仿，B組膝關節仍不能完全屈曲。
2.2 SFI測量
3組組內術后各時間點間SFI比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。術后2周，各組間SFI比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后6、10周，A、C組SFI均優于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組SFI比較（n=5，2.3 神經功能檢測
3組組內術后各時間點間MCV、CMAP波幅和DML比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后2周，3組MCV、CMAP波幅和DML比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；術后6、10周，B組MCV、CMAP波幅較A、C組明顯降低，DML明顯延長，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
術后各時間點各組神經功能及神經纖維檢測指標比較（n=5，2.4 甲苯胺藍染色觀察
A組術后2周可見髓鞘部分水腫，偶見髓鞘形態欠規則；6周水腫消失，髓鞘形態基本規整；10周髓鞘水腫消失，形態規則。與A組相比，B組術后2周坐骨神經有明顯瓦勒變性，髓鞘形態不規則，分布不均勻；6周較多髓鞘水腫后模糊不清，失去正常髓鞘形態；10周隨著卡壓時間延長，較多髓鞘碎片殘留。C組術后2周坐骨神經髓鞘形態欠規則；6周時部分髓鞘出現水腫，隨著藥物作用時間的延長，10周時可見殘留部分碎片。見圖 1。
圖1
術后各時間點各組甲苯胺藍染色觀察（× 200）?A組2周?A組6周?A組10周?B組2周?B組6周?B組10周?C組2周?C組6周?C組10周??圖 2術后10周各組透射電鏡觀察（× 400）?A組?B組?C組
Figure1.
Toluidine blue staining observation in 3 groups after operation (× 200) ?Group A at 2 weeks ?Group A at 6 weeks ?Group A at 10 weeks ?Group B at 2 weeks ?Group B at 6 weeks ?Group B at 10 weeks ?Group C at 2 weeks ?Group C at 6 weeks ?Group C at 10 weeks ??Fig. 2 Transmission electron microscope observation in 3 groups at 10 weeks after operation (× 400) ?Group A ?Group B ? Group C
2.5 透射電鏡觀察
透射電鏡下，A組術后各時間點均可見有髓神經纖維排列整齊，形態規整，板層致密，軸索居中，大小均勻。與A組比較，B、C組術后2周有髓神經纖維大小不一，變形髓鞘較多，髓鞘板層增厚明顯，板層結構松散、變形，呈空網狀改變，密度不均呈花斑狀；軸索形態不規則，相對變細，多偏向一側，可見髓鞘套疊現象，有的逐漸消失，呈空泡樣改變；有髓神經纖維之間可見細條索狀增生膠原纖維；神經外膜及束膜血管內較多血小板淤積。術后6周，B組可見神經組織被較大的有髓神經纖維逐步取代，新生有髓神經纖維髓鞘板層致密，但較A組薄，有髓神經纖維明顯增加；神經內條索狀膠原纖維沉積增多。C組神經組織基本被有髓神經纖維取代，新生有髓神經髓鞘板層致密，厚度與A組相仿，有髓神經纖維顯著增加；神經內條索狀膠原纖維沉積明顯增多。術后10周，B組神經組織新生有髓神經纖維髓鞘板層致密，有髓神經纖維明顯增加；神經內條索狀膠原纖維沉積明顯增多。C組有髓神經纖維顯著增加；神經內條索狀膠原纖維沉積較前明顯增多。見圖 2。
3組術后隨時間延長有髓神經纖維逐漸增多，神經纖維有效面積逐漸增大，除A組髓鞘厚度在6周時最厚外，B、C組髓鞘厚度均逐漸變薄；3組組內各時間點間各指標比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后2周，B、C組有髓神經纖維數明顯少于A組，髓鞘厚度明顯大于A組，差異均有統計學意義（P < 0.05），B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。術后6、10周，B、C組有髓神經纖維數明顯多于A組（P < 0.05），B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）；B組髓鞘厚度明顯小于A、C組（P < 0.05），A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。各時間點3組間神經纖維有效面積比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
2.6 實時熒光定量PCR及Western blot檢測CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達
術后2、6、10周各組CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達量均呈先增加后降低趨勢，各組組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后各時間點B組CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白相對表達量均顯著高于A、C組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 3。
表3
術后各時間點各組CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白相對表達量比較（n=5，3 討論
慢性神經卡壓損傷可致神經脫髓鞘病變及細胞外基質中膠原蛋白等過度沉積，引起神經功能障礙。卡壓時間長的患者較難自行恢復，嚴重影響了患者生活質量[9-10]。紅景天屬景天科，在兩千年前已被發現，屬藏藥的一種，能夠增強體質、提高身體對缺氧刺激的適應能力。研究發現，紅景天的主要有效成分紅景天苷可抑制神經組織中自由基和NO的產生，通過加強自由基的清除、調節凋亡和抗凋亡蛋白的表達減輕神經組織損傷，促進其修復[11]。
本研究在Mackinnon神經卡壓模型基礎上，觀察CTGF在大鼠坐骨神經慢性卡壓損傷中的表達，分析紅景天在神經恢復中的作用。有研究觀察了大鼠周圍神經慢性卡壓模型不同時期坐骨神經形態學改變，顯示卡壓8個月后有髓神經纖維髓鞘厚度減小，有髓神經纖維減少，而細小的有髓神經纖維明顯增多[12-16]。本研究中B組組織學及透射電鏡觀察同樣顯示，卡壓后坐骨神經出現大量有髓神經纖維瓦勒變性，隨時間延長瓦勒變性程度加重，神經髓鞘結構疏松，髓鞘板層呈絲狀、網狀改變，神經纖維之間大量膠原纖維增生，部分出現纖維化改變。細小的有髓神經纖維逐漸增多，存在較多增生的膠原纖維，神經纖維化也未緩解，影響神經功能的恢復。C組應用紅景天后，瓦勒變性程度逐漸減輕，較大的有髓神經纖維逐步取代變性神經纖維，新生有髓神經纖維髓鞘板層致密。
CTGF廣泛存在于心、肺、肝、腎等組織中，其基因啟動子中包含導致肝、腎、肺、皮膚等重要器官纖維化的啟動因子元件，與誘導細胞外基質沉積、導致其纖維化密切相關[17]。研究表明，CTGF長期過度表達能明顯促進纖維化的發生發展[18]。Ⅰ、Ⅲ型膠原是細胞外基質中的一種結構蛋白，是細胞外基質的主要組成成分，在組織修復尤其是神經修復過程中也發揮重要作用，是動物結締組織形成過程中的重要組成成分。術后2、6、10周各組CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達量均呈先增加后降低趨勢，各組變化過程均有統計學意義（P < 0.05）。B組坐骨神經CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達均較A、C組顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。結果提示CTGF及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達在神經卡壓過程中發揮重要作用。
神經損傷后會通過瓦勒變性、雪旺細胞增生等改變自行逐漸恢復，不同類型損傷決定了神經恢復程度的不同。SFI是觀察和評價大鼠坐骨神經損傷恢復程度的可靠指標[19]。本研究中，各組大鼠分別于術后2、6、10周作1次足印測定，結果顯示術后2周各組大鼠均呈神經損傷表現，6周開始逐漸恢復；其中A、C組恢復程度優于B組，而A、C組間差異無統計學意義。術后2周各組大鼠MCV、CMAP波幅和DML均呈神經損傷表現，6周開始逐漸恢復，各項指標組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。術后2周3組坐骨神經MCV、CMAP波幅和DML比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。術后6、10周，B組MCV、CMAP波幅較A、C組明顯降低，DML明顯延長，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。結果表明紅景天在神經修復中具有重要作用，修復后能明顯提高MCV及CMAP波幅，縮短DML。
綜上述，CTGF在大鼠坐骨神經卡壓后呈高表達狀態，與膠原蛋白沉積成正相關，與神經纖維的瘢痕形成密切相關。紅景天對神經功能恢復具有積極意義，能早期阻斷CTGF生物學效應，顯著促進神經功能恢復，改善大鼠神經卡壓預后。
