引用本文： 聶濤, 戴閩, 江川, 劉翔. 氯化鑭對氧化鋁陶瓷顆粒誘導RAW264.7細胞炎性因子表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 951-954. doi: 10.7507/1002-1892.20140209 復制
鑭元素是稀土元素中最為活躍的一種，具有獨特的分子結構和理化性質，在醫藥及臨床研究方面得到廣泛應用[1]。其抗炎性及作用于NF-κB信號通路的特點在人工關節無菌性松動領域具有探索價值，目前尚罕見報道。本研究擬通過對氯化鑭、氧化鋁陶瓷顆粒和小鼠巨噬細胞共培養，采用分子生物學方法觀察炎性因子IL-1β、TNF-α釋放情況以及氯化鑭對其影響，為人工關節無菌性松動的防治提供新思路及實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
小鼠RAW264.7細胞購自中國科學院上海生命科學院細胞庫。氯化鑭（LaCl3·7H2O，純度99.9%；Sigma-Aldrich公司，美國），溶于無菌注射用水配制成溶液。氧化鋁陶瓷顆粒（純度＞ 99%；大連海藍光電材料有限公司）。隨機取少量氧化鋁陶瓷顆粒掃描電鏡觀察示，平均粒徑0.18 μm。將氧化鋁陶瓷顆粒分成2份，第1 份用于配置實驗溶液，將樣本以75%乙醇浸泡過夜，250℃、3 h干烤，在無血清H-DMEM培養液內配成氧化鋁陶瓷顆粒懸液；第2份用于細菌培養和內毒素檢測。細菌培養檢測結果示無菌生長；鱟試劑盒（廈門市鱟試劑實驗廠）檢測內毒素含量低于0.02 EU/mL，可排除陶瓷顆粒中殘余內毒素對實驗的影響。
去熱原培養瓶（Corning公司，美國）；ELISA試劑盒（R&D公司，美國）；總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒（Promega公司，美國）；兔抗鼠NF-κB多克隆抗體（Abcam公司，美國）；二抗山羊抗兔IgG（ZSGB-BIO 公司，美國）；細胞核蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。酶標儀（Thermo公司，美國）；PCR儀（ABI公司，美國）；垂直電泳系統、超高靈敏度化學發光成像系統（Bio-Rad公司，美國）；全自動凝膠分析系統（珠海黑馬醫學儀器有限公司）。
1.2 實驗分組
將RAW264.7細胞以1 ×106個/mL密度接種于去熱原培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱，用含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的H-DMEM培養基培養，隔天換液1次，當培養瓶貼壁細胞達90%融合時，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取生長狀態良好的第3代RAW264.7細胞，根據培養液不同分成4組：A組，細胞培養液；B組，加入1 mg/mL氧化鋁陶瓷顆粒懸液；C組，加入1 mg/mL氧化鋁陶瓷顆粒懸液和10 μmol/L氯化鑭溶液；D組，加入10 μmol/L氯化鑭溶液。分組干預時換用無血清DMEM培養基培養。
1.3 檢測指標
1.3.1 MTT法檢測細胞活性
將第3代細胞以6 ×103個/孔密度接種于96孔板，貼壁后按分組干預，調整每組最終液體量為200 μL。放入37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，隨后每孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h；終止培養，吸棄上清；每孔加入DMSO 150 μL，置搖床12 min，使結晶完全溶解于DMSO。酶標儀上于490 nm波長處測量吸光度（A）值。
1.3.2 RT-PCR檢測
將第3代細胞以1.5 ×106個 / 孔密度接種于6孔板，貼壁后按分組干預48 h并棄培養基。參照總RNA提取試劑盒步驟提取總RNA，經逆轉錄合成cDNA。PCR引物由Invitrogen公司合成，各基因引物序列及產物大小見表 1。PCR反應條件：95℃預變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環；72℃延伸10 min。各取產物5 μL，于2%瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠分析系統灰度掃描分析。以目的基因與β-actin基因擴增片段灰度值之比表示目的基因相對表達量。
表1
各目的基因引物序列及產物大小
Table1.
Primer sequence and product size of genes
1.3.3 ELISA檢測
將第3代細胞以1.2 ×106個/孔密度接種于12孔板，貼壁后按分組干預48 h，收集細胞上清，以離心半徑8 cm、3 000 r/min離心20 min，取上清，按ELISA試劑盒說明書操作，于酶標儀450 nm波長處檢測IL-1β及TNF-α含量。
1.3.4 Western blot檢測
將第3代細胞以5 ×106 個 / 孔密度接種于6孔板，貼壁后按分組干預48 h，收集細胞。采用細胞核蛋白提取試劑盒進行裂解和提取，4℃以離心半徑8 cm、12 000 r/min離心10 min，提取上清，根據BCA法測出的樣本蛋白濃度計算上樣蛋白需要量，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗兔抗鼠NF-κB多克隆抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記二抗山羊抗兔IgG，4℃孵育4 h，洗膜后發光液染膜，放入超高靈敏度化學發光成像系統中曝光，并用其配套軟件分析實驗結果。以NF-κB與β-actin灰度值之比表示NF-κB蛋白表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MTT法檢測細胞活性
A、B、C、D組A值分別為1.056 ± 0.091、0.789 ± 0.107、0.990 ± 0.072、0.933 ± 0.046，組間比較差異無統計學意義（F=2.180，P=0.142）。
2.2 RT-PCR檢測
RT-PCR檢測示，各組均有IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表達。B組IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表達量顯著高于其余3組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；D組各基因表達量低于A組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；見表 2。
表2
RT-PCR檢測各組IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA相對表達量（n=6，2.3 ELISA檢測
A、B、C、D組IL-1β含量分別為（34.51 ± 3.29）、（92.94 ± 7.79）、（50.46 ± 2.51）、（27.26 ± 2.69）ng/mL，TNF-α含量分別為（40.91 ± 2.64）、（110.56 ± 7.87）、（52.51 ± 3.74）、（25.32 ± 2.19）ng/mL。B組IL-1β和TNF-α含量均顯著高于其余3組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；D組顯著低于A組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.4 Western blot檢測
A、B、C、D組NF-κB蛋白表達量分別為0.565 ± 0.023、1.279 ± 0.077、0.602 ± 0.037、0.377 ± 0.030，B組顯著高于其余3組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。
3 討論
3.1 氯化鑭與RAW264.7細胞的關系
大量研究表明[2]，磨損顆粒及其黏附的內毒素均可引起巨噬細胞活化，釋放炎性因子，增強破骨細胞活性，導致骨吸收；此外，磨損顆粒使局部組織中的細胞浸潤增強，浸潤的單核細胞作為破骨細胞前體，進一步分化成破骨細胞。因此，募集破骨細胞的前體細胞，刺激破骨細胞形成并增加其活性是人工假體無菌性松動的關鍵環節。破骨細胞是磨損顆粒所致假體周圍骨溶解的終末細胞，各種炎性因子大多通過影響破骨細胞分化和成熟，最終發揮其溶骨活性。
本研究選用的RAW264.7細胞是小鼠單核細胞/巨噬細胞系，被視為破骨細胞的前體細胞[3]，在DMEM培養液中生長良好，細胞貼壁生長，形態以類圓形和不規則多邊形為主，一般含1～2個細胞核，胞體較小，有觸足。我們前期研究也表明RAW264.7細胞增殖穩定，可無限傳代，多次傳代后細胞生物學特性穩定，生長較快[4]；并且能表達成熟破骨細胞特異性表型基因以及與骨吸收相關的功能基因，形成骨吸收陷窩，能近似反映破骨細胞生物學特性[5]。本研究主要通過觀察氯化鑭對氧化鋁陶瓷顆粒誘導RAW264.7細胞產生炎性因子的影響，分析氯化鑭對假體無菌性松動的影響。
3.2 氯化鑭與磨損顆粒的關系
假體周圍骨溶解導致的無菌性松動是人工關節置換術后最常見遠期并發癥[6]。大多數學者認為假體產生的磨損顆粒在無菌性松動中起重要作用，已被證實可誘導炎性反應，從而誘導骨溶解[7]。磨損顆粒被假體周圍的單核巨噬細胞吞噬，釋放炎性因子，主要包括IL-1β、TNF-α[8]。陶瓷假體主要成分為氧化鋁[9-10]。鑭元素作為稀土元素中的研究熱點，在燒傷、腫瘤、腎臟等疾病領域有較深入研究，并已證實其具有抗炎、抗菌等生物學作用[11]，然而氯化鑭在人工關節無菌性松動領域的研究尚罕見報道。
本研究發現，給予氯化鑭和氧化鋁陶瓷顆粒溶液干預后，MTT檢測示A值未見明顯改變，表明氧化鋁陶瓷顆粒和氯化鑭對巨噬細胞無明顯細胞毒性。ELISA和RT-PCR檢測結果示，加入氧化鋁陶瓷顆粒后細胞的炎性因子IL-1β、TNF-α表達顯著增高；繼續加入氯化鑭后，炎性因子釋放明顯減少，表明氯化鑭可以抑制陶瓷顆粒對巨噬細胞的炎性刺激，預防骨溶解的發生。
3.3 氯化鑭與NF-κB的關系
在磨損顆粒誘導骨溶解過程中，NF-κB信號轉導通路對破骨細胞的發生、分化、成熟、死亡起著重要調節作用。顆粒本身就是一種細胞外信號，能夠激活細胞內信號轉導通路并引起生物學效應。目前磨損顆粒對NF-κB受體活化因子信號轉導系統影響的研究，主要集中在NF-κB信號通路方面。磨損顆粒能夠激活破骨細胞及其前體細胞內的轉錄因子NF-κB。
大量研究表明，通過阻斷NF-κB信號轉導通路，可以抑制破骨細胞分化、激活或誘導破骨細胞凋亡，在骨質疏松癥、類風濕性關節炎的治療中已獲得初步效果[12]。Clohisy等[13]體外實驗條件下用NF-κB抑制劑TPCK或CPI阻止I-κB的磷酸化，可以明顯抑制骨水泥顆粒對NF-κB的活化作用。Ren等[14]研究表明紅霉素能抑制聚甲基丙烯酸甲酯和超高分子聚乙烯混合顆粒對NF-κB的活化作用，減少前體細胞的炎性因子基因表達，減輕NF-κB受體活化因子配體對前體細胞的刺激，進而減少破骨細胞生成，同時還能抑制成熟破骨細胞的吸收活性。Goater等[15]將轉染后穩定分泌骨保護素的成纖維樣滑膜細胞植入小鼠顱骨，可有效抑制鈦顆粒誘導的骨溶解。
本研究結果顯示，給予氧化鋁陶瓷顆粒刺激后NF-κB含量明顯增高，說明氧化鋁陶瓷顆粒會影響NF-κB信號轉導通路；加入氯化鑭后，NF-κB基因表達和蛋白含量明顯降低，說明氯化鑭可通過調控NF-κB信號通路明顯抑制磨損顆粒誘導的炎性反應。因此我們將在此基礎上進一步觀察和研究氯化鑭對無菌性松動的抑制效果和機制，為鑭元素應用于人工關節無菌性松動防治提供實驗依據。
鑭元素是稀土元素中最為活躍的一種，具有獨特的分子結構和理化性質，在醫藥及臨床研究方面得到廣泛應用[1]。其抗炎性及作用于NF-κB信號通路的特點在人工關節無菌性松動領域具有探索價值，目前尚罕見報道。本研究擬通過對氯化鑭、氧化鋁陶瓷顆粒和小鼠巨噬細胞共培養，采用分子生物學方法觀察炎性因子IL-1β、TNF-α釋放情況以及氯化鑭對其影響，為人工關節無菌性松動的防治提供新思路及實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
小鼠RAW264.7細胞購自中國科學院上海生命科學院細胞庫。氯化鑭（LaCl3·7H2O，純度99.9%；Sigma-Aldrich公司，美國），溶于無菌注射用水配制成溶液。氧化鋁陶瓷顆粒（純度＞ 99%；大連海藍光電材料有限公司）。隨機取少量氧化鋁陶瓷顆粒掃描電鏡觀察示，平均粒徑0.18 μm。將氧化鋁陶瓷顆粒分成2份，第1 份用于配置實驗溶液，將樣本以75%乙醇浸泡過夜，250℃、3 h干烤，在無血清H-DMEM培養液內配成氧化鋁陶瓷顆粒懸液；第2份用于細菌培養和內毒素檢測。細菌培養檢測結果示無菌生長；鱟試劑盒（廈門市鱟試劑實驗廠）檢測內毒素含量低于0.02 EU/mL，可排除陶瓷顆粒中殘余內毒素對實驗的影響。
去熱原培養瓶（Corning公司，美國）；ELISA試劑盒（R&D公司，美國）；總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒（Promega公司，美國）；兔抗鼠NF-κB多克隆抗體（Abcam公司，美國）；二抗山羊抗兔IgG（ZSGB-BIO 公司，美國）；細胞核蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。酶標儀（Thermo公司，美國）；PCR儀（ABI公司，美國）；垂直電泳系統、超高靈敏度化學發光成像系統（Bio-Rad公司，美國）；全自動凝膠分析系統（珠海黑馬醫學儀器有限公司）。
1.2 實驗分組
將RAW264.7細胞以1 ×106個/mL密度接種于去熱原培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱，用含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的H-DMEM培養基培養，隔天換液1次，當培養瓶貼壁細胞達90%融合時，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取生長狀態良好的第3代RAW264.7細胞，根據培養液不同分成4組：A組，細胞培養液；B組，加入1 mg/mL氧化鋁陶瓷顆粒懸液；C組，加入1 mg/mL氧化鋁陶瓷顆粒懸液和10 μmol/L氯化鑭溶液；D組，加入10 μmol/L氯化鑭溶液。分組干預時換用無血清DMEM培養基培養。
1.3 檢測指標
1.3.1 MTT法檢測細胞活性
將第3代細胞以6 ×103個/孔密度接種于96孔板，貼壁后按分組干預，調整每組最終液體量為200 μL。放入37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，隨后每孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h；終止培養，吸棄上清；每孔加入DMSO 150 μL，置搖床12 min，使結晶完全溶解于DMSO。酶標儀上于490 nm波長處測量吸光度（A）值。
1.3.2 RT-PCR檢測
將第3代細胞以1.5 ×106個 / 孔密度接種于6孔板，貼壁后按分組干預48 h并棄培養基。參照總RNA提取試劑盒步驟提取總RNA，經逆轉錄合成cDNA。PCR引物由Invitrogen公司合成，各基因引物序列及產物大小見表 1。PCR反應條件：95℃預變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環；72℃延伸10 min。各取產物5 μL，于2%瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠分析系統灰度掃描分析。以目的基因與β-actin基因擴增片段灰度值之比表示目的基因相對表達量。
表1
各目的基因引物序列及產物大小
Table1.
Primer sequence and product size of genes
1.3.3 ELISA檢測
將第3代細胞以1.2 ×106個/孔密度接種于12孔板，貼壁后按分組干預48 h，收集細胞上清，以離心半徑8 cm、3 000 r/min離心20 min，取上清，按ELISA試劑盒說明書操作，于酶標儀450 nm波長處檢測IL-1β及TNF-α含量。
1.3.4 Western blot檢測
將第3代細胞以5 ×106 個 / 孔密度接種于6孔板，貼壁后按分組干預48 h，收集細胞。采用細胞核蛋白提取試劑盒進行裂解和提取，4℃以離心半徑8 cm、12 000 r/min離心10 min，提取上清，根據BCA法測出的樣本蛋白濃度計算上樣蛋白需要量，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗兔抗鼠NF-κB多克隆抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記二抗山羊抗兔IgG，4℃孵育4 h，洗膜后發光液染膜，放入超高靈敏度化學發光成像系統中曝光，并用其配套軟件分析實驗結果。以NF-κB與β-actin灰度值之比表示NF-κB蛋白表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MTT法檢測細胞活性
A、B、C、D組A值分別為1.056 ± 0.091、0.789 ± 0.107、0.990 ± 0.072、0.933 ± 0.046，組間比較差異無統計學意義（F=2.180，P=0.142）。
2.2 RT-PCR檢測
RT-PCR檢測示，各組均有IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表達。B組IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表達量顯著高于其余3組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；D組各基因表達量低于A組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；見表 2。
表2
RT-PCR檢測各組IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA相對表達量（n=6，2.3 ELISA檢測
A、B、C、D組IL-1β含量分別為（34.51 ± 3.29）、（92.94 ± 7.79）、（50.46 ± 2.51）、（27.26 ± 2.69）ng/mL，TNF-α含量分別為（40.91 ± 2.64）、（110.56 ± 7.87）、（52.51 ± 3.74）、（25.32 ± 2.19）ng/mL。B組IL-1β和TNF-α含量均顯著高于其余3組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；D組顯著低于A組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.4 Western blot檢測
A、B、C、D組NF-κB蛋白表達量分別為0.565 ± 0.023、1.279 ± 0.077、0.602 ± 0.037、0.377 ± 0.030，B組顯著高于其余3組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。
3 討論
3.1 氯化鑭與RAW264.7細胞的關系
大量研究表明[2]，磨損顆粒及其黏附的內毒素均可引起巨噬細胞活化，釋放炎性因子，增強破骨細胞活性，導致骨吸收；此外，磨損顆粒使局部組織中的細胞浸潤增強，浸潤的單核細胞作為破骨細胞前體，進一步分化成破骨細胞。因此，募集破骨細胞的前體細胞，刺激破骨細胞形成并增加其活性是人工假體無菌性松動的關鍵環節。破骨細胞是磨損顆粒所致假體周圍骨溶解的終末細胞，各種炎性因子大多通過影響破骨細胞分化和成熟，最終發揮其溶骨活性。
本研究選用的RAW264.7細胞是小鼠單核細胞/巨噬細胞系，被視為破骨細胞的前體細胞[3]，在DMEM培養液中生長良好，細胞貼壁生長，形態以類圓形和不規則多邊形為主，一般含1～2個細胞核，胞體較小，有觸足。我們前期研究也表明RAW264.7細胞增殖穩定，可無限傳代，多次傳代后細胞生物學特性穩定，生長較快[4]；并且能表達成熟破骨細胞特異性表型基因以及與骨吸收相關的功能基因，形成骨吸收陷窩，能近似反映破骨細胞生物學特性[5]。本研究主要通過觀察氯化鑭對氧化鋁陶瓷顆粒誘導RAW264.7細胞產生炎性因子的影響，分析氯化鑭對假體無菌性松動的影響。
3.2 氯化鑭與磨損顆粒的關系
假體周圍骨溶解導致的無菌性松動是人工關節置換術后最常見遠期并發癥[6]。大多數學者認為假體產生的磨損顆粒在無菌性松動中起重要作用，已被證實可誘導炎性反應，從而誘導骨溶解[7]。磨損顆粒被假體周圍的單核巨噬細胞吞噬，釋放炎性因子，主要包括IL-1β、TNF-α[8]。陶瓷假體主要成分為氧化鋁[9-10]。鑭元素作為稀土元素中的研究熱點，在燒傷、腫瘤、腎臟等疾病領域有較深入研究，并已證實其具有抗炎、抗菌等生物學作用[11]，然而氯化鑭在人工關節無菌性松動領域的研究尚罕見報道。
本研究發現，給予氯化鑭和氧化鋁陶瓷顆粒溶液干預后，MTT檢測示A值未見明顯改變，表明氧化鋁陶瓷顆粒和氯化鑭對巨噬細胞無明顯細胞毒性。ELISA和RT-PCR檢測結果示，加入氧化鋁陶瓷顆粒后細胞的炎性因子IL-1β、TNF-α表達顯著增高；繼續加入氯化鑭后，炎性因子釋放明顯減少，表明氯化鑭可以抑制陶瓷顆粒對巨噬細胞的炎性刺激，預防骨溶解的發生。
3.3 氯化鑭與NF-κB的關系
在磨損顆粒誘導骨溶解過程中，NF-κB信號轉導通路對破骨細胞的發生、分化、成熟、死亡起著重要調節作用。顆粒本身就是一種細胞外信號，能夠激活細胞內信號轉導通路并引起生物學效應。目前磨損顆粒對NF-κB受體活化因子信號轉導系統影響的研究，主要集中在NF-κB信號通路方面。磨損顆粒能夠激活破骨細胞及其前體細胞內的轉錄因子NF-κB。
大量研究表明，通過阻斷NF-κB信號轉導通路，可以抑制破骨細胞分化、激活或誘導破骨細胞凋亡，在骨質疏松癥、類風濕性關節炎的治療中已獲得初步效果[12]。Clohisy等[13]體外實驗條件下用NF-κB抑制劑TPCK或CPI阻止I-κB的磷酸化，可以明顯抑制骨水泥顆粒對NF-κB的活化作用。Ren等[14]研究表明紅霉素能抑制聚甲基丙烯酸甲酯和超高分子聚乙烯混合顆粒對NF-κB的活化作用，減少前體細胞的炎性因子基因表達，減輕NF-κB受體活化因子配體對前體細胞的刺激，進而減少破骨細胞生成，同時還能抑制成熟破骨細胞的吸收活性。Goater等[15]將轉染后穩定分泌骨保護素的成纖維樣滑膜細胞植入小鼠顱骨，可有效抑制鈦顆粒誘導的骨溶解。
本研究結果顯示，給予氧化鋁陶瓷顆粒刺激后NF-κB含量明顯增高，說明氧化鋁陶瓷顆粒會影響NF-κB信號轉導通路；加入氯化鑭后，NF-κB基因表達和蛋白含量明顯降低，說明氯化鑭可通過調控NF-κB信號通路明顯抑制磨損顆粒誘導的炎性反應。因此我們將在此基礎上進一步觀察和研究氯化鑭對無菌性松動的抑制效果和機制，為鑭元素應用于人工關節無菌性松動防治提供實驗依據。
