引用本文： 李楠, 修磊, 關濤, 胡志伏, 金群華. TGF-β1和結締組織生長因子在不同退變程度的腰椎間盤組織中的表達. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(7): 891-895. doi: 10.7507/1002-1892.20140196 復制
椎間盤退變是引發中老年人腰腿痛的主要病因之一，其發病率高，危害較大。迄今為止，對于椎間盤退變的確切發病機制尚不清楚。研究表明，它是一種多病因疾病，與循環、生物力學及分子生物學等多種因素有關[1]。近年來分子生物學因素成為研究熱點，研究顯示[2]，細胞因子在椎間盤退變過程中扮演重要角色，其中TGF-β1和結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）頗受關注。TGF-β1是細胞生長和分化的多功能調節因子，既可誘導細胞的促凋亡反應[3]，又能增強細胞的抗凋亡作用[4]。在人體多數組織中，CTGF是TGF-β1/Smad通路中的下游介質，在TGF-β1的介導下發揮其生物學作用，通常參與組織的纖維化[5-7]。有研究[8-9]在人工干預退變的動物椎間盤組織中發現CTGF表達量顯著增高。但TGF-β1和CTGF在人類不同退變程度椎間盤組織中的表達量是否有差異，目前尚未見報道。本研究通過檢測人類不同退變程度椎間盤組織中TGF-β1和CTGF的表達，探討TGF-β1和CTGF在椎間盤退變發生發展中的作用，為臨床早期干預提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料收集
收集2012年11月－2013年4月寧夏醫科大學附屬總醫院33例臨床診斷為腰椎間盤突出癥患者的腰椎間盤組織，其中男20例，女13例；年齡28～68歲，平均49.6歲。另取12例同期臨床診斷為腰椎爆裂性骨折患者的腰椎間盤組織，其中男10例，女2例；年齡22～41歲，平均30.4歲。均采用后路標準術式摘取椎間盤，且術前均未行免疫治療、放療、化療；入選患者既往均無結締組織疾病、血液病、代謝病、免疫系統疾病及惡性腫瘤。以上腰椎間盤組織的獲取均經患者或其家屬同意，并經過寧夏醫科大學倫理委員會批準。
1.2 主要試劑及儀器
兔抗人CTGF單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗抗體IgG（香港Abcam公司）；兔抗人TGF-β1單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗抗體IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；兔抗人β微管蛋白（β-tubulin）多克隆抗體（北京生物合成技術有限公司）；凝膠制備試劑盒、HE染色劑、蛋白發光試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；BCA蛋白含量檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒、蛋白Marker（南京凱基生物科技發展有限公司）。Quantity one凝膠分析儀（Bio-Rad公司，美國）；超聲波細胞裂解儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。
1.3 實驗方法
將收集的每個組織樣本分為3部分，一部分用于HE染色，另外兩部分用于Western blot測定TGF-β1和CTGF表達。
1.3.1 HE染色
取組織樣本于室溫下生理鹽水反復沖洗后，置于10%甲醛溶液中浸泡固定，4℃保存24～48 h后梯度乙醇脫水、二甲苯透明，浸蠟包埋，5～8 μm厚切片，貼至載玻片后放入二甲苯中脫蠟，梯度乙醇入水，行HE染色，光鏡下觀察椎間盤髓核細胞和細胞外基質的組織學改變。根據參考文獻[10]標準并加以改良后對椎間盤組織進行病理學分型：正常組織：髓核細胞數量、大小及形態基本正常，細胞間質無膠原纖維增生；輕度退變：髓核細胞輕度變性、變大，細胞數量與正常組織接近，細胞間質無明顯膠原纖維增生，可有新生毛細血管生成及炎性細胞浸潤；中度退變：髓核細胞多數變大，僅有少數正常髓核細胞，細胞間質內膠原纖維輕度增生，可有新生毛細血管生成及炎性細胞浸潤；重度退變：無正常細胞，細胞間質內膠原纖維重度增生伴纖維化，幾無新生毛細血管。根據不同退變程度分組，進行Western blot檢測。
1.3.2 Western
blot檢測 ① TGF-β1表達量測定：取各組標本于室溫下生理鹽水反復漂洗，然后在研缽中倒少量液氮研磨組織。取適量粉末組織稱量，加入裂解液和蛋白酶抑制劑后使用超聲波細胞裂解儀將組織進一步裂解，放入高速離心機中以15 000 × g離心15 min，取少許上清液用BCA法測定總蛋白濃度；取50 μL上清液加入上樣緩沖液后100℃變性10 min，再以10 000 × g離心5 min后取上清液30 μL待上樣；制備凝膠，然后進行SDS-PAGE電泳，切膠后將分離的蛋白以60 V電壓、100 mA電流2 h轉移至聚偏氟乙烯膜，TBST緩沖液洗膜3次后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶300稀釋的兔抗人TGF-β1單克隆抗體和1∶100稀釋的兔抗人β-tubulin多克隆抗體4℃過夜，次日TBST緩沖液洗膜3次后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗抗體IgG，室溫放置2 h，TBST緩沖液洗膜3次后暗室內加入化學發光試劑顯色曝光，洗片。以β-tubulin作為上樣量的內參照，用目的蛋白條帶吸光度（A）值/β-tubulin條帶A值作為TGF-β1的相對表達強度。② CTGF表達量測定：實驗步驟同上。兔抗人CTGF單克隆抗體稀釋濃度為1∶3 500，CTGF的相對表達強度計算方法同TGF-β1。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 HE染色觀察
根據病理學分型標準：正常組織10例（均來自腰椎骨折患者），作為正常組；輕度退變組織10例（2例來自腰椎骨折患者，8例來自腰椎間盤突出癥患者），作為輕度退變組；中度退變組織9例（均來自腰椎間盤突出癥患者），作為中度退變組；重度退變組織16例（均來自腰椎間盤突出癥患者），作為重度退變組。
正常組椎間盤組織的軟骨樣基質中分布大小一致的圓形髓核細胞，細胞間質均勻一致，未見膠原纖維增生（圖 1 a）；輕度退變組髓核細胞輕度變大，髓核細胞無明顯減少，基質內有少量炎性細胞浸潤，細胞間質內膠原纖維未見明顯增生（圖 1 b）；中度退變組髓核細胞變大，部分呈空泡樣，正常髓核細胞減少，細胞間質內膠原纖維輕度增生，可見小血管長入，炎性細胞浸潤（圖 1 c）；重度退變組髓核基質內未見正常髓核細胞，細胞間質內膠原纖維重度增生伴纖維化（圖 1 d）。
圖1
各組椎間盤組織HE染色觀察（×100） ? 正常組 箭頭示正常髓核細胞 ? 輕度退變組 黑箭頭示髓核細胞輕度變大，紅箭頭示基質內有炎性細胞浸潤 ? 中度退變組 黑箭頭示髓核細胞變大、呈空泡樣，黃箭頭示小血管，紅箭頭示炎性細胞 ? 重度退變組 箭頭示細胞間質內膠原纖維重度增生
Figure1.
HE staining observation of specimens in each group (×100) ? Normal discs Arrow indicated normal nucleus pulposus cells ? Mild degenerative discs Black arrow indicated slightly larger nucleus pulposus cells,and red arrow indicated a small quantity of inflammatory cells infiltrated in the matrix ? Moderate degenerative discs Black arrow indicated nucleus pulposus cells became bigger,like bulbs; yellow arrow indicated vessels; and red arrow indicated inflammatory cells ? Severe degenerative discs Arrow indicated severe hyperplasia of collagenous fiber
2.2 Western blot檢測
2.2.1 TGF-β1表達量測定
各組腰椎間盤組織中均有TGF-β1表達，正常組、輕度退變組、中度退變組及重度退變組TGF-β1相對表達量分別為0.208 ± 0.061、0.321 ± 0.072、0.343 ± 0.071、0.588 ± 0.113，3個退變組均顯著高于正常組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；重度退變組顯著高于輕度和中度退變組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），中度退變組TGF-β1相對表達量雖高于輕度退變組，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot檢測TGF-β1表達 Mr：相對分子質量 1：正常組 2：輕度退變組 3：中度退變組 4：重度退變組 ? ?2.2.2 CTGF表達量測定
各組腰椎間盤組織中均有CTGF表達，正常組、輕度退變組、中度退變組及重度退變組CTGF相對表達量分別為0.179 ± 0.048、0.244 ± 0.068、0.369 ± 0.106、0.643 ± 0.094，中、重度退變組顯著高于正常組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；輕度退變組高于正常組，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）；輕、中、重度退變組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3。
3 討論
椎間盤退變的原因至今仍未完全闡明，但退變過程中的基本病理變化現已大致明確，主要表現為椎間盤正常細胞逐漸減少，炎性細胞浸潤，細胞外基質蛋白聚糖及水分丟失和各型膠原蛋白比例改變，繼發椎間盤纖維化、骨終板鈣化等[11]。在臨床上腰椎間盤退變引起的相關疾病中，對病變椎間盤的病理學和形態學分型方法雖然很多，但主要是針對退變椎間盤組織的大體或影像學分型，缺少鏡下形態的分型標準。本研究根據腰椎間盤自然退變的一般病理特點，參考并改良了楊旸等[10]的椎間盤病理分級標準，將退變的椎間盤組織進一步分級。這樣不僅能在一定程度上消除性別和年齡偏倚，而且能更客觀、直觀顯示腰椎間盤退變的實際情況。
TGF-β1是TGF超家族中的一員，在人體內有著廣泛而復雜的生物學作用。在腰椎間盤，TGF-β1能促進其中BMSCs的增殖和向髓核細胞分化[12]，并參與組織細胞的損傷修復過程。有研究報道[13]，在退變早期的椎間盤組織中，TGF-β1可能起到維持正常細胞外基質合成的作用，包括促進髓核細胞分泌蛋白多糖、刺激Ⅱ型膠原產生、改善存活髓核細胞的活性并抑制其凋亡，但隨著退變的進一步發展，椎間盤組織中成纖維細胞增多，在TGF-β1刺激下，引起Ⅰ、Ⅲ型膠原合成進一步增加，并逐漸取代Ⅱ型膠原，使椎間盤組織纖維化，進而加重退變。同時，成纖維細胞在自分泌調控機制[14]的影響下，能分泌更多的TGF-β1。本研究采用Western blot法對不同退變程度腰椎間盤組織中的TGF-β1表達進行測定，發現正常組TGF-β1有少量表達，各退變組中有較高表達，盡管中度和輕度退變組TGF-β1相對表達量差異無統計學意義，但隨著椎間盤退變程度的加 重，TGF-β1相對表達量仍有逐步增高趨勢，鏡下觀察各級退變椎間盤時亦能發現椎間盤纖維化不斷加重，這可能會刺激更多TGF-β1表達。因此可以推斷，TGF-β1的過度表達在腰椎間盤退變過程中起一定作 用。
CTGF作為TGF-β1的下游因子在人體各個器官產生多種生物學效應。Bradham等[15]研究表明，CTGF可刺激成纖維細胞增殖，并促進膠原沉淀。生理狀態下，CTGF在各個組織中的表達程度均較低，但在高機械應力和炎性因子刺激下，在類軟骨組織中的表達可明顯增加[16]。在調節細胞外基質方面，生理量的CTGF可顯著增加細胞中Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的基因表達，維持椎間盤正常結構，而過量表達的CTGF則會降解細胞外基質，促使組織發生纖維化改變[17]。另外，CTGF還與組織新生血管的形成之間有著密切聯系，VEGF可誘導CTGF產生，而CTGF通過對細胞外基質結構的調節，反過來能促進血管床形成[18]；Ali等[19]和Peng等[20]發現退變的椎間盤多伴有血管新生，并且在血管新生區域CTGF表達明顯增高。本研究鏡下觀察發現，輕、中度退變的椎間盤組織部分可見新小血管。Western blot法檢測退變椎間盤組織中CTGF表達顯著增高，并且隨著椎間盤退變程度加重，其表達量逐步增高。但輕度退變組中CTGF的相對表達量較正常組無顯著增高，可能原因是在正常椎間盤組織中，CTGF呈較低的生理表達量，退變早期由于椎間盤組織中細胞外基質降解不明顯，椎間盤結構變化不大，各種影響其分泌的細胞和蛋白因子含量未出現明顯改變，CTGF仍處于生理表達狀態；至退變晚期，過量表達的CTGF可通過改變椎間盤膠原蛋白比例和細胞外基質含量使椎間盤發生纖維化等一系列病理改變，而這些病理變化又可進一步促進CTGF的表達。可以推測，椎間盤過表達CTGF和椎間盤退變之間有密切關系。
綜上述，隨著椎間盤退變不斷加重，TGF-β1和CTGF表達量呈逐步增高的趨勢，在椎間盤退變的發生發展中共同起著一定作用。然而，兩種蛋白均有雙重生物學效應，即抗退變和促退變，在椎間盤退變的不同時期，這兩種作用是否同時發揮作用，哪種作用在某一時期占主導尚不明確，由于該過程參與分子眾多，機制復雜，仍需進一步深入研究。
椎間盤退變是引發中老年人腰腿痛的主要病因之一，其發病率高，危害較大。迄今為止，對于椎間盤退變的確切發病機制尚不清楚。研究表明，它是一種多病因疾病，與循環、生物力學及分子生物學等多種因素有關[1]。近年來分子生物學因素成為研究熱點，研究顯示[2]，細胞因子在椎間盤退變過程中扮演重要角色，其中TGF-β1和結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）頗受關注。TGF-β1是細胞生長和分化的多功能調節因子，既可誘導細胞的促凋亡反應[3]，又能增強細胞的抗凋亡作用[4]。在人體多數組織中，CTGF是TGF-β1/Smad通路中的下游介質，在TGF-β1的介導下發揮其生物學作用，通常參與組織的纖維化[5-7]。有研究[8-9]在人工干預退變的動物椎間盤組織中發現CTGF表達量顯著增高。但TGF-β1和CTGF在人類不同退變程度椎間盤組織中的表達量是否有差異，目前尚未見報道。本研究通過檢測人類不同退變程度椎間盤組織中TGF-β1和CTGF的表達，探討TGF-β1和CTGF在椎間盤退變發生發展中的作用，為臨床早期干預提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料收集
收集2012年11月－2013年4月寧夏醫科大學附屬總醫院33例臨床診斷為腰椎間盤突出癥患者的腰椎間盤組織，其中男20例，女13例；年齡28～68歲，平均49.6歲。另取12例同期臨床診斷為腰椎爆裂性骨折患者的腰椎間盤組織，其中男10例，女2例；年齡22～41歲，平均30.4歲。均采用后路標準術式摘取椎間盤，且術前均未行免疫治療、放療、化療；入選患者既往均無結締組織疾病、血液病、代謝病、免疫系統疾病及惡性腫瘤。以上腰椎間盤組織的獲取均經患者或其家屬同意，并經過寧夏醫科大學倫理委員會批準。
1.2 主要試劑及儀器
兔抗人CTGF單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗抗體IgG（香港Abcam公司）；兔抗人TGF-β1單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗抗體IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；兔抗人β微管蛋白（β-tubulin）多克隆抗體（北京生物合成技術有限公司）；凝膠制備試劑盒、HE染色劑、蛋白發光試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；BCA蛋白含量檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒、蛋白Marker（南京凱基生物科技發展有限公司）。Quantity one凝膠分析儀（Bio-Rad公司，美國）；超聲波細胞裂解儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。
1.3 實驗方法
將收集的每個組織樣本分為3部分，一部分用于HE染色，另外兩部分用于Western blot測定TGF-β1和CTGF表達。
1.3.1 HE染色
取組織樣本于室溫下生理鹽水反復沖洗后，置于10%甲醛溶液中浸泡固定，4℃保存24～48 h后梯度乙醇脫水、二甲苯透明，浸蠟包埋，5～8 μm厚切片，貼至載玻片后放入二甲苯中脫蠟，梯度乙醇入水，行HE染色，光鏡下觀察椎間盤髓核細胞和細胞外基質的組織學改變。根據參考文獻[10]標準并加以改良后對椎間盤組織進行病理學分型：正常組織：髓核細胞數量、大小及形態基本正常，細胞間質無膠原纖維增生；輕度退變：髓核細胞輕度變性、變大，細胞數量與正常組織接近，細胞間質無明顯膠原纖維增生，可有新生毛細血管生成及炎性細胞浸潤；中度退變：髓核細胞多數變大，僅有少數正常髓核細胞，細胞間質內膠原纖維輕度增生，可有新生毛細血管生成及炎性細胞浸潤；重度退變：無正常細胞，細胞間質內膠原纖維重度增生伴纖維化，幾無新生毛細血管。根據不同退變程度分組，進行Western blot檢測。
1.3.2 Western
blot檢測 ① TGF-β1表達量測定：取各組標本于室溫下生理鹽水反復漂洗，然后在研缽中倒少量液氮研磨組織。取適量粉末組織稱量，加入裂解液和蛋白酶抑制劑后使用超聲波細胞裂解儀將組織進一步裂解，放入高速離心機中以15 000 × g離心15 min，取少許上清液用BCA法測定總蛋白濃度；取50 μL上清液加入上樣緩沖液后100℃變性10 min，再以10 000 × g離心5 min后取上清液30 μL待上樣；制備凝膠，然后進行SDS-PAGE電泳，切膠后將分離的蛋白以60 V電壓、100 mA電流2 h轉移至聚偏氟乙烯膜，TBST緩沖液洗膜3次后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶300稀釋的兔抗人TGF-β1單克隆抗體和1∶100稀釋的兔抗人β-tubulin多克隆抗體4℃過夜，次日TBST緩沖液洗膜3次后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗抗體IgG，室溫放置2 h，TBST緩沖液洗膜3次后暗室內加入化學發光試劑顯色曝光，洗片。以β-tubulin作為上樣量的內參照，用目的蛋白條帶吸光度（A）值/β-tubulin條帶A值作為TGF-β1的相對表達強度。② CTGF表達量測定：實驗步驟同上。兔抗人CTGF單克隆抗體稀釋濃度為1∶3 500，CTGF的相對表達強度計算方法同TGF-β1。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 HE染色觀察
根據病理學分型標準：正常組織10例（均來自腰椎骨折患者），作為正常組；輕度退變組織10例（2例來自腰椎骨折患者，8例來自腰椎間盤突出癥患者），作為輕度退變組；中度退變組織9例（均來自腰椎間盤突出癥患者），作為中度退變組；重度退變組織16例（均來自腰椎間盤突出癥患者），作為重度退變組。
正常組椎間盤組織的軟骨樣基質中分布大小一致的圓形髓核細胞，細胞間質均勻一致，未見膠原纖維增生（圖 1 a）；輕度退變組髓核細胞輕度變大，髓核細胞無明顯減少，基質內有少量炎性細胞浸潤，細胞間質內膠原纖維未見明顯增生（圖 1 b）；中度退變組髓核細胞變大，部分呈空泡樣，正常髓核細胞減少，細胞間質內膠原纖維輕度增生，可見小血管長入，炎性細胞浸潤（圖 1 c）；重度退變組髓核基質內未見正常髓核細胞，細胞間質內膠原纖維重度增生伴纖維化（圖 1 d）。
圖1
各組椎間盤組織HE染色觀察（×100） ? 正常組 箭頭示正常髓核細胞 ? 輕度退變組 黑箭頭示髓核細胞輕度變大，紅箭頭示基質內有炎性細胞浸潤 ? 中度退變組 黑箭頭示髓核細胞變大、呈空泡樣，黃箭頭示小血管，紅箭頭示炎性細胞 ? 重度退變組 箭頭示細胞間質內膠原纖維重度增生
Figure1.
HE staining observation of specimens in each group (×100) ? Normal discs Arrow indicated normal nucleus pulposus cells ? Mild degenerative discs Black arrow indicated slightly larger nucleus pulposus cells,and red arrow indicated a small quantity of inflammatory cells infiltrated in the matrix ? Moderate degenerative discs Black arrow indicated nucleus pulposus cells became bigger,like bulbs; yellow arrow indicated vessels; and red arrow indicated inflammatory cells ? Severe degenerative discs Arrow indicated severe hyperplasia of collagenous fiber
2.2 Western blot檢測
2.2.1 TGF-β1表達量測定
各組腰椎間盤組織中均有TGF-β1表達，正常組、輕度退變組、中度退變組及重度退變組TGF-β1相對表達量分別為0.208 ± 0.061、0.321 ± 0.072、0.343 ± 0.071、0.588 ± 0.113，3個退變組均顯著高于正常組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；重度退變組顯著高于輕度和中度退變組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），中度退變組TGF-β1相對表達量雖高于輕度退變組，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot檢測TGF-β1表達 Mr：相對分子質量 1：正常組 2：輕度退變組 3：中度退變組 4：重度退變組 ? ?2.2.2 CTGF表達量測定
各組腰椎間盤組織中均有CTGF表達，正常組、輕度退變組、中度退變組及重度退變組CTGF相對表達量分別為0.179 ± 0.048、0.244 ± 0.068、0.369 ± 0.106、0.643 ± 0.094，中、重度退變組顯著高于正常組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；輕度退變組高于正常組，但差異無統計學意義（P＞ 0.05）；輕、中、重度退變組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3。
3 討論
椎間盤退變的原因至今仍未完全闡明，但退變過程中的基本病理變化現已大致明確，主要表現為椎間盤正常細胞逐漸減少，炎性細胞浸潤，細胞外基質蛋白聚糖及水分丟失和各型膠原蛋白比例改變，繼發椎間盤纖維化、骨終板鈣化等[11]。在臨床上腰椎間盤退變引起的相關疾病中，對病變椎間盤的病理學和形態學分型方法雖然很多，但主要是針對退變椎間盤組織的大體或影像學分型，缺少鏡下形態的分型標準。本研究根據腰椎間盤自然退變的一般病理特點，參考并改良了楊旸等[10]的椎間盤病理分級標準，將退變的椎間盤組織進一步分級。這樣不僅能在一定程度上消除性別和年齡偏倚，而且能更客觀、直觀顯示腰椎間盤退變的實際情況。
TGF-β1是TGF超家族中的一員，在人體內有著廣泛而復雜的生物學作用。在腰椎間盤，TGF-β1能促進其中BMSCs的增殖和向髓核細胞分化[12]，并參與組織細胞的損傷修復過程。有研究報道[13]，在退變早期的椎間盤組織中，TGF-β1可能起到維持正常細胞外基質合成的作用，包括促進髓核細胞分泌蛋白多糖、刺激Ⅱ型膠原產生、改善存活髓核細胞的活性并抑制其凋亡，但隨著退變的進一步發展，椎間盤組織中成纖維細胞增多，在TGF-β1刺激下，引起Ⅰ、Ⅲ型膠原合成進一步增加，并逐漸取代Ⅱ型膠原，使椎間盤組織纖維化，進而加重退變。同時，成纖維細胞在自分泌調控機制[14]的影響下，能分泌更多的TGF-β1。本研究采用Western blot法對不同退變程度腰椎間盤組織中的TGF-β1表達進行測定，發現正常組TGF-β1有少量表達，各退變組中有較高表達，盡管中度和輕度退變組TGF-β1相對表達量差異無統計學意義，但隨著椎間盤退變程度的加 重，TGF-β1相對表達量仍有逐步增高趨勢，鏡下觀察各級退變椎間盤時亦能發現椎間盤纖維化不斷加重，這可能會刺激更多TGF-β1表達。因此可以推斷，TGF-β1的過度表達在腰椎間盤退變過程中起一定作 用。
CTGF作為TGF-β1的下游因子在人體各個器官產生多種生物學效應。Bradham等[15]研究表明，CTGF可刺激成纖維細胞增殖，并促進膠原沉淀。生理狀態下，CTGF在各個組織中的表達程度均較低，但在高機械應力和炎性因子刺激下，在類軟骨組織中的表達可明顯增加[16]。在調節細胞外基質方面，生理量的CTGF可顯著增加細胞中Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的基因表達，維持椎間盤正常結構，而過量表達的CTGF則會降解細胞外基質，促使組織發生纖維化改變[17]。另外，CTGF還與組織新生血管的形成之間有著密切聯系，VEGF可誘導CTGF產生，而CTGF通過對細胞外基質結構的調節，反過來能促進血管床形成[18]；Ali等[19]和Peng等[20]發現退變的椎間盤多伴有血管新生，并且在血管新生區域CTGF表達明顯增高。本研究鏡下觀察發現，輕、中度退變的椎間盤組織部分可見新小血管。Western blot法檢測退變椎間盤組織中CTGF表達顯著增高，并且隨著椎間盤退變程度加重，其表達量逐步增高。但輕度退變組中CTGF的相對表達量較正常組無顯著增高，可能原因是在正常椎間盤組織中，CTGF呈較低的生理表達量，退變早期由于椎間盤組織中細胞外基質降解不明顯，椎間盤結構變化不大，各種影響其分泌的細胞和蛋白因子含量未出現明顯改變，CTGF仍處于生理表達狀態；至退變晚期，過量表達的CTGF可通過改變椎間盤膠原蛋白比例和細胞外基質含量使椎間盤發生纖維化等一系列病理改變，而這些病理變化又可進一步促進CTGF的表達。可以推測，椎間盤過表達CTGF和椎間盤退變之間有密切關系。
綜上述，隨著椎間盤退變不斷加重，TGF-β1和CTGF表達量呈逐步增高的趨勢，在椎間盤退變的發生發展中共同起著一定作用。然而，兩種蛋白均有雙重生物學效應，即抗退變和促退變，在椎間盤退變的不同時期，這兩種作用是否同時發揮作用，哪種作用在某一時期占主導尚不明確，由于該過程參與分子眾多，機制復雜，仍需進一步深入研究。
