引用本文： 韓夫, 王耀軍, 王耘川, 賈艷慧, 楊龍龍, 賈文斌, 方小兵, 白曉智, 胡大海. 吲哚胺2，3-雙加氧酶基因修飾BMSCs在大鼠同種異體復合組織移植免疫排斥反應中的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 745-751. doi: 10.7507/1002-1892.20140166 復制
BMSCs 是一群骨髓來源的具有多向分化潛能的MSCs，因具備低免疫原性及負性免疫調節特性，已被用于自身免疫性疾病、移植物抗宿主病治療等臨床試驗[1]。然而，BMSCs 自身的免疫調節能力尚不足以完全抑制免疫排斥反應[2]。研究表明，吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）可抑制效應性T淋巴細胞增殖、促進其凋亡，同時可誘導調節性T淋巴細胞產生而抑制其排斥效應[3]。本實驗中，我們通過基因轉染使BMSCs 穩定高表達IDO，體外研究其對異基因T淋巴細胞增殖的抑制作用，體內觀察其對同種異體大鼠復合組織移植排斥反應的影響，探索IDO 轉染的BMSCs 應用于同種異體復合組織移植排斥反應中的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級4～6周齡BN大鼠30只作為供體，遺傳背景為RT1n，雌雄不限，體重180～220 g；SPF級4～6周齡LEWIS大鼠30只作為受體，遺傳背景為RT11，雌雄不限，體重180～220 g；均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物實驗方案由第四軍醫大學動物倫理委員會批準并監督，符合國家技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。
BMSCs專用培養基、成脂誘導培養基（含10%FBS、1 μmol/L地塞米松、200 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L異丁基黃嘌呤、10 μg/mL胰島素的BMSCs專用培養基）、成骨誘導培養基（含10%FBS、1 μmol/ L地塞米松、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的BMSCs專用培養基）（廣州賽業生物科技有限公司）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；0.25%胰蛋白酶[康成生物科技（廣州）有限公司]； IDO過表達慢病毒載體GV287：IDO[綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）]-Lenti、慢病毒陰性對照GFP-Lenti、聚凝胺（上海吉凱基因化學技術有限公司）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；RIPA細胞裂解液（Bio Legend公司，美國）；兔抗鼠IDO單抗、30%三氯乙酸、愛爾希試劑、犬尿氨酸標準曲線、1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT）、絲裂霉素C（Sigma公司，美國）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；大鼠淋巴細胞分離液（天津灝洋生物科技有限公司）；RPMI1640培養基（GIBCO公司，美國）。
IX71型倒置顯微鏡、FSX100型倒置相差熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2細胞培養箱（Shellab公司，美國）；FACSAria型流式細胞儀（BD公司，美國）；HS1300型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；高速離心機（Sigma公司，美國）；Model680型酶標儀、IQ5TM熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；DU800型分光光度計（Beckman Counlter公司，美國）。
1.2 BMSCs分離培養及鑒定
1.2.1 BMSCs分離培養
取1只BN大鼠注射過量麻醉劑處死，75%乙醇浸泡10 min。于超凈工作臺內取雙側股骨，0.02%呋喃西林溶液浸泡5 min。剪去骨干兩端，1 mL注射器抽取預冷PBS沖洗骨髓腔，收集骨髓并用200目濾網過濾，收集單細胞懸液。室溫下以173 × g離心5 min；棄上清，用含10%FBS的BMSCs專用培養基重懸并稀釋至10 mL，接種于75 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。48 h后首次更換培養基，以后每72小時換液1次，每次換液時倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態；待細胞生長至80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。
1.2.2 BMSCs鑒定
① 流式細胞儀表面抗原鑒定：取第3代BMSCs，棄上清，調整細胞懸液密度為1 ×106 個/ mL；分別加入熒光標記的抗體Anti-CD45-PE、Anti-CD29-PE及Anti-CD90-PerCP，避光4℃孵育30 min；4℃同上法離心5 min，PBS漂洗、同上法離心3次，流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達。② 誘導分化潛能鑒定：取第3代BMSCs以1 ×104 個 / 孔密度接種于24孔板，待細胞達60%融合時，分別進行成骨和成脂誘導培養，每組6孔。于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，隔日換液。成脂誘導2周后油紅O染色鑒定，成骨誘導3周后ALP染色鑒定。以BMSCs專用培養基培養細胞作為陰性對照。
1.3 BMSCs慢病毒轉染及相關檢測
1.3.1 BMSCs慢病毒轉染
實驗前1 d，取第3代BMSCs以（3～5）×104個/孔接種于6孔板，實驗當天保證細胞融合達30%～40%，此時細胞密度約為1 ×105個/孔。每孔加入900 μL BMSCs專用培養基后分為3組（每組2孔），分別加入10 μL IDO過表達慢病毒IDO（GFP）-Lenti（IDO-BMSCs，實驗組）、10 μL慢病毒陰性對照GFP-Lenti（GFP-BMSCs，空載體對照組）和10 μL BMSCs專用培養基（空白對照組），其中實驗組和空載體對照組病毒原液滴度為1 ×108 TU/ mL，根據預實驗結果及慢病毒載體操作手冊提供數據和相關文獻[4]，選擇大鼠BMSCs轉染指數為10。再在每孔中加入90 μL聚凝胺，總反應體系1 mL。混勻后培養，8～12 h觀察細胞狀態，并更換新鮮BMSCs專用培養基。轉染3～4 d后熒光顯微鏡下觀察實驗組和空載體對照組熒光表達情況。
1.3.2 RT-PCR檢測基因修飾前后BMSCs中IDO
mRNA表達待慢病毒轉染后的BMSCs融合達 80%～90%時，收集上清液，以0.25%胰蛋白酶消化3 組細胞。按照Trizol一步法RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA 1 μg，逆轉錄獲取cDNA，加入特定引物及熒光標記的堿基，用IQ5TM熒光定量PCR儀進行擴增，以GAPDH為內參，測定基因修飾前后IDO mRNA表達情況。引物序列：IDO上游5'-AGACCCGAAAGC-ACTGGAGA-3'，下游5'-TGCCCTTCCAACCAGACAA-3'；GAPDH上游5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。
1.3.3 Western
blot檢測基因修飾前后BMSCs中IDO蛋白表達收集慢病毒轉染72 h后3組細胞，用PBS沖洗2次，預冷RIPA細胞裂解液裂解細胞提取蛋白質，提取的蛋白質經變性、電泳、轉膜及封閉，分別以兔抗鼠IDO單抗和辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，以化學熒光法顯色。用Quantity One軟件分析條帶灰度。
1.3.4 基因修飾前后BMSCs中IDO活性檢測
通過測定色氨酸降解產物犬尿氨酸生成量檢測IDO生物學活性。參照文獻[5-6]方法收集3組細胞培養基上清各100 μL，加至25 μL 30%三氯乙酸中，50℃培養30 min，以9 000 × g離心5 min，取100 μL上清與等量愛爾希試劑室溫下孵育10 min。用分光光度計測量波長492 nm處的吸光度（A）值。條件培養基中犬尿氨酸生成量通過犬尿氨酸標準曲線計算[7]。
1.4 BMSCs對異基因T淋巴細胞增殖的影響
從1只受體LEWIS大鼠尾靜脈抽取外周血2 mL，以PBS稀釋為4 mL，加至4 mL大鼠淋巴細胞分離液表面，25℃以560 × g離心20 min；吸取單核細胞層，在5 mL PBS中重懸，25℃以250 × g離心12 min；棄上清，細胞沉淀以5 mL RPMI1640培養基重懸，計數后再次于25℃以250 × g離心8 min，此時獲得的細胞為大鼠外周血單個核細胞，作為反應細胞。同法獲得1 只供體BN大鼠來源外周血單個核細胞，以50 μg/mL絲裂霉素C處理30 min去增殖，PBS沖洗，25℃以250 × g離心8 min，作為刺激細胞。
實驗分為4組：實驗組將反應細胞和刺激細胞各5 ×105個分別加至預先鋪有1 ×105、5 ×104、1 ×104、5 ×103個IDO-BMSCs的U型96孔培養板中培養，使IDO-BMSCs、反應細胞和刺激細胞比例分別為1∶5∶5、1∶10∶10、1∶50∶50及1∶100∶100，設為實驗組1、2、3、4，建立混合淋巴細胞培養體系。每個反應體系另設IDO阻斷孔，即加入1 mmol/L IDO特異性抑制劑1-MT。以1 ×105 個IDO-BMSCs與5 ×105個反應細胞（1∶5）培養為陰性對照組，5 ×105個刺激細胞與5 ×105個反應細胞（1∶1）培養作為陽性對照組，1 ×105個IDO-BMSCs在RPMI1640培養基中單獨培養作為空白對照組。每組設3個復孔，均于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養5 d，培養結束前5 h加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，將培養板于25℃以250 × g離心5 min，棄上清加入等量DMSO，震蕩5 min，酶標儀測定490 nm波長處A值。按以下公式計算T淋巴細胞增殖率。T淋巴細胞增殖率=（實驗組A值－陰性對照組A值）/（陽性對照組A值－陰性對照組A值）×100%。其中實驗組A值=實驗組每孔A值－空白對照組平均A值。
1.5 IDO-BMSCs對大鼠同種異體復合組織移植排斥反應的影響
取供體BN大鼠、受體LEWIS大鼠各24只，根據本課題組前期研究內容及動物模型建立方法[8]建立大鼠同種異基因肢體移植模型。根據移植后處理方式不同，將實驗分為A、B、C 3組（n=8）。取5 ×105個GFP-BMSCs、IDO-BMSCs，各用1 mL生理鹽水重懸，移植術后30 min，經尾靜脈分別輸入A、B組移植模型；C組輸入1 mL生理鹽水作為對照。
術后觀察各組移植排斥反應，根據移植排斥標準[9-10]確定移植物存活時間。于移植后第7天切取移植肢體標本，大小約1.0 cm × 0.5 cm，深度達肌肉層[11]，行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察B組攜帶GFP熒光的IDO-BMSCs在移植物內的定植情況；HE染色后光鏡下觀察各組移植排斥反應情況。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，培養48 h時原代BMSCs已貼壁，細胞輪廓清晰，呈長梭形；3～5 d后呈集落樣生長，并逐漸伸展，呈單核的小多角形或短梭形；7 d左右即可達80%融合，細胞聚集成群；傳代后細胞生長變快，3～4 d即可形成單層融合，呈束狀或漩渦狀。見圖 1。
圖1
BMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代培養3 d ? 原代培養7 d ? ?流式細胞儀分析顯示，第3代BMSCs高表達CD29、CD90，低表達CD45，符合BMSCs細胞表型。見圖 2。油紅O及ALP染色示，第3代BMSCs經成脂誘導2周及成骨誘導3周，可分化為富含脂滴的脂肪細胞和成骨細胞。見圖 3。
2.2 BMSCs慢病毒轉染及相關檢測
熒光顯微鏡下見，經慢病毒轉染后實驗組IDO-BMSCs高表達GFP（＞ 90%），且細胞狀態及活力與空載體對照組比較無明顯變化。見圖 4。
RT-PCR檢測示，實驗組IDO mRNA表達量為10.7 ± 1.4，顯著高于空載體對照組（1.0 ± 0.2）及空白對照組（0.9 ± 0.1），差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。Western blot檢測示，實驗組IDO蛋白表達量為8.1 ± 0.3，顯著高于空載體對照組（1.2 ± 0.1）及空白對照組（0.9 ± 0.1），差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 6。IDO活性檢測示，實驗組犬尿氨酸生成量為（61.3 ± 5.4） μmol/ L，明顯高于空載體對照組的（5.0 ± 0.9）μmol/L和空白對照組的（5.3 ± 0.6）μmol/L，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.3 BMSCs對異基因T淋巴細胞增殖的影響
加入1-MT前，實驗組1、2、3的T淋巴細胞增殖率分別為26.8% ± 2.1%、36.3% ± 2.7%及59.1% ± 4.6%，隨IDO-BMSCs與反應細胞比例逐漸減少，T淋巴細胞增殖率不斷增加，組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；實驗組4 T淋巴細胞增殖率為80.8% ± 5.2%，與陽性對照組的84.3% ± 6.2%比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。
加入1-MT后，T淋巴細胞增殖能力恢復，除實驗組4與加入前比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各實驗組T淋巴細胞增殖率均高于加入前，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 7。
圖7
各組加入1-MT前后T淋巴細胞增殖率比較
Figure7.
Comparison of T lymphocytes proliferation rate between groups before and after adding 1-MT
2.4 IDO-BMSCs對大鼠異體復合組織移植免疫排斥反應的影響
A、B、C組移植物存活時間分別為（11.5 ± 0.6）、（14.5 ± 0.8）、（9.0 ± 0.3）d，B組存活時間明顯長于A、C組，A組長于C組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。標本觀察示，A組移植肢體肌肉腫脹、肌纖維溶解明顯，血管內炎性細胞浸潤明顯；B組移植肢體腫脹程度及皮膚壞死范圍明顯較A組輕，肌肉、血管結構完整，炎性細胞浸潤輕，移植物內可見GFP標記細胞。C組移植肢體腫脹壞死最為明顯，肌纖維崩解，組織結構模糊，大量炎性細胞浸潤。見圖 8、9。
圖8
各組移植術后7 d組織學觀察（HE × 40） ? A組 ? B組 ? C組 ? ?3 討論
嚴重的組織缺損或肢體缺失由于自體組織不足，患者常經受著不同程度的軀體障礙及心理負擔[12]。同種異體復合組織移植因可提供良好的外形、功能修復，在國內外受到越來越多認可[13]；然而，同種異體復合組織移植后因長期應用免疫抑制劑會導致各種副作用以及慢性排斥反應，無法作為一種常規修復手段[14]。因此，探索新的抗移植物排斥方案，減少免疫抑制劑的應用是亟待解決的重大臨床問題。本課題組前期研究結果提示，大劑量BMSCs可誘導小鼠同種異體骨髓移植成功[15]。然而同種異體移植BMSCs仍會引起一定程度免疫排斥反應，導致移植后的BMSCs逐步被受體免疫系統清除，其免疫調節作用不能長期保持[16]。因此，同時提高BMSCs免疫調節能力及移植后的自我保護能力對推廣BMSCs治療移植免疫排斥具有重要意義。
IDO是一種含亞鐵血紅素的單體酶，是體內色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑的限速酶。研究表明，IDO在腫瘤逃逸、自身免疫性疾病、母嬰免疫耐受及移植免疫耐受等方面均具有重要意義[17]。長期以來，研究者普遍認為IDO只是一種具有誘導T淋巴細胞凋亡的免疫抑制性作用的酶。近年研究表明[18]，樹突狀細胞可通過提高IDO表達，活化色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑對其接觸的T淋巴細胞發揮抑增殖、促凋亡的作用；另一方面，IDO可作為一種信號分子，參與樹突狀細胞調控初始T淋巴細胞向Treg細胞分化的過程。IDO是BMSCs發揮免疫調節作用的重要機制之一，但正常情況下，IDO在BMSCs中表達較少，使得BMSCs的免疫調節能力受限[19]。提示提高IDO表達水平可以增強BMSCs對移植排斥反應的抑制作用。本研究體外實驗結果提示，IDO-BMSCs（5 ×103～1 ×105個）可明顯提高BMSCs對T淋巴細胞增殖的抑制作用，這一作用可被其特異性抑制劑1-MT阻斷。體內實驗也提示IDO-BMSCs可抑制移植排斥反應強度，延長移植物的存活時間。另外，本實驗發現IDO-BMSCs向移植物內的定植能力增強。這一現象可能是由于高表達IDO的BMSCs可通過旁分泌機制對與之接觸或鄰近的T淋巴細胞發揮抑增殖、促凋亡的作用，避免BMSCs被T淋巴細胞殺傷清除，進一步增強其體內免疫調節作用，促進其存活。
上述實驗結果提示，BMSCs經IDO（GFP）-Lenti基因感染修飾后穩定表達IDO并產生生物活性，通過降解細胞微環境中的色氨酸發揮抑制T淋巴細胞增殖的作用，并隨著IDO-BMSCs數量增加其IDO活性逐漸增強，對T淋巴細胞增殖的抑制作用增強，從而減輕T淋巴細胞介導的同種異體復合組織移植后的免疫排斥反應，延長移植物存活時間。綜上述，IDO基因修飾BMSCs在移植物局部微環境下能發揮免疫抑制作用，從而為同種異體復合組織移植后免疫耐受形成的研究提供一種新的實驗依據。
BMSCs 是一群骨髓來源的具有多向分化潛能的MSCs，因具備低免疫原性及負性免疫調節特性，已被用于自身免疫性疾病、移植物抗宿主病治療等臨床試驗[1]。然而，BMSCs 自身的免疫調節能力尚不足以完全抑制免疫排斥反應[2]。研究表明，吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）可抑制效應性T淋巴細胞增殖、促進其凋亡，同時可誘導調節性T淋巴細胞產生而抑制其排斥效應[3]。本實驗中，我們通過基因轉染使BMSCs 穩定高表達IDO，體外研究其對異基因T淋巴細胞增殖的抑制作用，體內觀察其對同種異體大鼠復合組織移植排斥反應的影響，探索IDO 轉染的BMSCs 應用于同種異體復合組織移植排斥反應中的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級4～6周齡BN大鼠30只作為供體，遺傳背景為RT1n，雌雄不限，體重180～220 g；SPF級4～6周齡LEWIS大鼠30只作為受體，遺傳背景為RT11，雌雄不限，體重180～220 g；均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物實驗方案由第四軍醫大學動物倫理委員會批準并監督，符合國家技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。
BMSCs專用培養基、成脂誘導培養基（含10%FBS、1 μmol/L地塞米松、200 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L異丁基黃嘌呤、10 μg/mL胰島素的BMSCs專用培養基）、成骨誘導培養基（含10%FBS、1 μmol/ L地塞米松、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的BMSCs專用培養基）（廣州賽業生物科技有限公司）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；0.25%胰蛋白酶[康成生物科技（廣州）有限公司]； IDO過表達慢病毒載體GV287：IDO[綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）]-Lenti、慢病毒陰性對照GFP-Lenti、聚凝胺（上海吉凱基因化學技術有限公司）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；RIPA細胞裂解液（Bio Legend公司，美國）；兔抗鼠IDO單抗、30%三氯乙酸、愛爾希試劑、犬尿氨酸標準曲線、1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT）、絲裂霉素C（Sigma公司，美國）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；大鼠淋巴細胞分離液（天津灝洋生物科技有限公司）；RPMI1640培養基（GIBCO公司，美國）。
IX71型倒置顯微鏡、FSX100型倒置相差熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2細胞培養箱（Shellab公司，美國）；FACSAria型流式細胞儀（BD公司，美國）；HS1300型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；高速離心機（Sigma公司，美國）；Model680型酶標儀、IQ5TM熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；DU800型分光光度計（Beckman Counlter公司，美國）。
1.2 BMSCs分離培養及鑒定
1.2.1 BMSCs分離培養
取1只BN大鼠注射過量麻醉劑處死，75%乙醇浸泡10 min。于超凈工作臺內取雙側股骨，0.02%呋喃西林溶液浸泡5 min。剪去骨干兩端，1 mL注射器抽取預冷PBS沖洗骨髓腔，收集骨髓并用200目濾網過濾，收集單細胞懸液。室溫下以173 × g離心5 min；棄上清，用含10%FBS的BMSCs專用培養基重懸并稀釋至10 mL，接種于75 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。48 h后首次更換培養基，以后每72小時換液1次，每次換液時倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態；待細胞生長至80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。
1.2.2 BMSCs鑒定
① 流式細胞儀表面抗原鑒定：取第3代BMSCs，棄上清，調整細胞懸液密度為1 ×106 個/ mL；分別加入熒光標記的抗體Anti-CD45-PE、Anti-CD29-PE及Anti-CD90-PerCP，避光4℃孵育30 min；4℃同上法離心5 min，PBS漂洗、同上法離心3次，流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達。② 誘導分化潛能鑒定：取第3代BMSCs以1 ×104 個 / 孔密度接種于24孔板，待細胞達60%融合時，分別進行成骨和成脂誘導培養，每組6孔。于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，隔日換液。成脂誘導2周后油紅O染色鑒定，成骨誘導3周后ALP染色鑒定。以BMSCs專用培養基培養細胞作為陰性對照。
1.3 BMSCs慢病毒轉染及相關檢測
1.3.1 BMSCs慢病毒轉染
實驗前1 d，取第3代BMSCs以（3～5）×104個/孔接種于6孔板，實驗當天保證細胞融合達30%～40%，此時細胞密度約為1 ×105個/孔。每孔加入900 μL BMSCs專用培養基后分為3組（每組2孔），分別加入10 μL IDO過表達慢病毒IDO（GFP）-Lenti（IDO-BMSCs，實驗組）、10 μL慢病毒陰性對照GFP-Lenti（GFP-BMSCs，空載體對照組）和10 μL BMSCs專用培養基（空白對照組），其中實驗組和空載體對照組病毒原液滴度為1 ×108 TU/ mL，根據預實驗結果及慢病毒載體操作手冊提供數據和相關文獻[4]，選擇大鼠BMSCs轉染指數為10。再在每孔中加入90 μL聚凝胺，總反應體系1 mL。混勻后培養，8～12 h觀察細胞狀態，并更換新鮮BMSCs專用培養基。轉染3～4 d后熒光顯微鏡下觀察實驗組和空載體對照組熒光表達情況。
1.3.2 RT-PCR檢測基因修飾前后BMSCs中IDO
mRNA表達待慢病毒轉染后的BMSCs融合達 80%～90%時，收集上清液，以0.25%胰蛋白酶消化3 組細胞。按照Trizol一步法RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA 1 μg，逆轉錄獲取cDNA，加入特定引物及熒光標記的堿基，用IQ5TM熒光定量PCR儀進行擴增，以GAPDH為內參，測定基因修飾前后IDO mRNA表達情況。引物序列：IDO上游5'-AGACCCGAAAGC-ACTGGAGA-3'，下游5'-TGCCCTTCCAACCAGACAA-3'；GAPDH上游5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，下游5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。
1.3.3 Western
blot檢測基因修飾前后BMSCs中IDO蛋白表達收集慢病毒轉染72 h后3組細胞，用PBS沖洗2次，預冷RIPA細胞裂解液裂解細胞提取蛋白質，提取的蛋白質經變性、電泳、轉膜及封閉，分別以兔抗鼠IDO單抗和辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，以化學熒光法顯色。用Quantity One軟件分析條帶灰度。
1.3.4 基因修飾前后BMSCs中IDO活性檢測
通過測定色氨酸降解產物犬尿氨酸生成量檢測IDO生物學活性。參照文獻[5-6]方法收集3組細胞培養基上清各100 μL，加至25 μL 30%三氯乙酸中，50℃培養30 min，以9 000 × g離心5 min，取100 μL上清與等量愛爾希試劑室溫下孵育10 min。用分光光度計測量波長492 nm處的吸光度（A）值。條件培養基中犬尿氨酸生成量通過犬尿氨酸標準曲線計算[7]。
1.4 BMSCs對異基因T淋巴細胞增殖的影響
從1只受體LEWIS大鼠尾靜脈抽取外周血2 mL，以PBS稀釋為4 mL，加至4 mL大鼠淋巴細胞分離液表面，25℃以560 × g離心20 min；吸取單核細胞層，在5 mL PBS中重懸，25℃以250 × g離心12 min；棄上清，細胞沉淀以5 mL RPMI1640培養基重懸，計數后再次于25℃以250 × g離心8 min，此時獲得的細胞為大鼠外周血單個核細胞，作為反應細胞。同法獲得1 只供體BN大鼠來源外周血單個核細胞，以50 μg/mL絲裂霉素C處理30 min去增殖，PBS沖洗，25℃以250 × g離心8 min，作為刺激細胞。
實驗分為4組：實驗組將反應細胞和刺激細胞各5 ×105個分別加至預先鋪有1 ×105、5 ×104、1 ×104、5 ×103個IDO-BMSCs的U型96孔培養板中培養，使IDO-BMSCs、反應細胞和刺激細胞比例分別為1∶5∶5、1∶10∶10、1∶50∶50及1∶100∶100，設為實驗組1、2、3、4，建立混合淋巴細胞培養體系。每個反應體系另設IDO阻斷孔，即加入1 mmol/L IDO特異性抑制劑1-MT。以1 ×105 個IDO-BMSCs與5 ×105個反應細胞（1∶5）培養為陰性對照組，5 ×105個刺激細胞與5 ×105個反應細胞（1∶1）培養作為陽性對照組，1 ×105個IDO-BMSCs在RPMI1640培養基中單獨培養作為空白對照組。每組設3個復孔，均于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養5 d，培養結束前5 h加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，將培養板于25℃以250 × g離心5 min，棄上清加入等量DMSO，震蕩5 min，酶標儀測定490 nm波長處A值。按以下公式計算T淋巴細胞增殖率。T淋巴細胞增殖率=（實驗組A值－陰性對照組A值）/（陽性對照組A值－陰性對照組A值）×100%。其中實驗組A值=實驗組每孔A值－空白對照組平均A值。
1.5 IDO-BMSCs對大鼠同種異體復合組織移植排斥反應的影響
取供體BN大鼠、受體LEWIS大鼠各24只，根據本課題組前期研究內容及動物模型建立方法[8]建立大鼠同種異基因肢體移植模型。根據移植后處理方式不同，將實驗分為A、B、C 3組（n=8）。取5 ×105個GFP-BMSCs、IDO-BMSCs，各用1 mL生理鹽水重懸，移植術后30 min，經尾靜脈分別輸入A、B組移植模型；C組輸入1 mL生理鹽水作為對照。
術后觀察各組移植排斥反應，根據移植排斥標準[9-10]確定移植物存活時間。于移植后第7天切取移植肢體標本，大小約1.0 cm × 0.5 cm，深度達肌肉層[11]，行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察B組攜帶GFP熒光的IDO-BMSCs在移植物內的定植情況；HE染色后光鏡下觀察各組移植排斥反應情況。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，培養48 h時原代BMSCs已貼壁，細胞輪廓清晰，呈長梭形；3～5 d后呈集落樣生長，并逐漸伸展，呈單核的小多角形或短梭形；7 d左右即可達80%融合，細胞聚集成群；傳代后細胞生長變快，3～4 d即可形成單層融合，呈束狀或漩渦狀。見圖 1。
圖1
BMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代培養3 d ? 原代培養7 d ? ?流式細胞儀分析顯示，第3代BMSCs高表達CD29、CD90，低表達CD45，符合BMSCs細胞表型。見圖 2。油紅O及ALP染色示，第3代BMSCs經成脂誘導2周及成骨誘導3周，可分化為富含脂滴的脂肪細胞和成骨細胞。見圖 3。
2.2 BMSCs慢病毒轉染及相關檢測
熒光顯微鏡下見，經慢病毒轉染后實驗組IDO-BMSCs高表達GFP（＞ 90%），且細胞狀態及活力與空載體對照組比較無明顯變化。見圖 4。
RT-PCR檢測示，實驗組IDO mRNA表達量為10.7 ± 1.4，顯著高于空載體對照組（1.0 ± 0.2）及空白對照組（0.9 ± 0.1），差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。Western blot檢測示，實驗組IDO蛋白表達量為8.1 ± 0.3，顯著高于空載體對照組（1.2 ± 0.1）及空白對照組（0.9 ± 0.1），差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 6。IDO活性檢測示，實驗組犬尿氨酸生成量為（61.3 ± 5.4） μmol/ L，明顯高于空載體對照組的（5.0 ± 0.9）μmol/L和空白對照組的（5.3 ± 0.6）μmol/L，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.3 BMSCs對異基因T淋巴細胞增殖的影響
加入1-MT前，實驗組1、2、3的T淋巴細胞增殖率分別為26.8% ± 2.1%、36.3% ± 2.7%及59.1% ± 4.6%，隨IDO-BMSCs與反應細胞比例逐漸減少，T淋巴細胞增殖率不斷增加，組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；實驗組4 T淋巴細胞增殖率為80.8% ± 5.2%，與陽性對照組的84.3% ± 6.2%比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。
加入1-MT后，T淋巴細胞增殖能力恢復，除實驗組4與加入前比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各實驗組T淋巴細胞增殖率均高于加入前，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 7。
圖7
各組加入1-MT前后T淋巴細胞增殖率比較
Figure7.
Comparison of T lymphocytes proliferation rate between groups before and after adding 1-MT
2.4 IDO-BMSCs對大鼠異體復合組織移植免疫排斥反應的影響
A、B、C組移植物存活時間分別為（11.5 ± 0.6）、（14.5 ± 0.8）、（9.0 ± 0.3）d，B組存活時間明顯長于A、C組，A組長于C組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。標本觀察示，A組移植肢體肌肉腫脹、肌纖維溶解明顯，血管內炎性細胞浸潤明顯；B組移植肢體腫脹程度及皮膚壞死范圍明顯較A組輕，肌肉、血管結構完整，炎性細胞浸潤輕，移植物內可見GFP標記細胞。C組移植肢體腫脹壞死最為明顯，肌纖維崩解，組織結構模糊，大量炎性細胞浸潤。見圖 8、9。
圖8
各組移植術后7 d組織學觀察（HE × 40） ? A組 ? B組 ? C組 ? ?3 討論
嚴重的組織缺損或肢體缺失由于自體組織不足，患者常經受著不同程度的軀體障礙及心理負擔[12]。同種異體復合組織移植因可提供良好的外形、功能修復，在國內外受到越來越多認可[13]；然而，同種異體復合組織移植后因長期應用免疫抑制劑會導致各種副作用以及慢性排斥反應，無法作為一種常規修復手段[14]。因此，探索新的抗移植物排斥方案，減少免疫抑制劑的應用是亟待解決的重大臨床問題。本課題組前期研究結果提示，大劑量BMSCs可誘導小鼠同種異體骨髓移植成功[15]。然而同種異體移植BMSCs仍會引起一定程度免疫排斥反應，導致移植后的BMSCs逐步被受體免疫系統清除，其免疫調節作用不能長期保持[16]。因此，同時提高BMSCs免疫調節能力及移植后的自我保護能力對推廣BMSCs治療移植免疫排斥具有重要意義。
IDO是一種含亞鐵血紅素的單體酶，是體內色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑的限速酶。研究表明，IDO在腫瘤逃逸、自身免疫性疾病、母嬰免疫耐受及移植免疫耐受等方面均具有重要意義[17]。長期以來，研究者普遍認為IDO只是一種具有誘導T淋巴細胞凋亡的免疫抑制性作用的酶。近年研究表明[18]，樹突狀細胞可通過提高IDO表達，活化色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑對其接觸的T淋巴細胞發揮抑增殖、促凋亡的作用；另一方面，IDO可作為一種信號分子，參與樹突狀細胞調控初始T淋巴細胞向Treg細胞分化的過程。IDO是BMSCs發揮免疫調節作用的重要機制之一，但正常情況下，IDO在BMSCs中表達較少，使得BMSCs的免疫調節能力受限[19]。提示提高IDO表達水平可以增強BMSCs對移植排斥反應的抑制作用。本研究體外實驗結果提示，IDO-BMSCs（5 ×103～1 ×105個）可明顯提高BMSCs對T淋巴細胞增殖的抑制作用，這一作用可被其特異性抑制劑1-MT阻斷。體內實驗也提示IDO-BMSCs可抑制移植排斥反應強度，延長移植物的存活時間。另外，本實驗發現IDO-BMSCs向移植物內的定植能力增強。這一現象可能是由于高表達IDO的BMSCs可通過旁分泌機制對與之接觸或鄰近的T淋巴細胞發揮抑增殖、促凋亡的作用，避免BMSCs被T淋巴細胞殺傷清除，進一步增強其體內免疫調節作用，促進其存活。
上述實驗結果提示，BMSCs經IDO（GFP）-Lenti基因感染修飾后穩定表達IDO并產生生物活性，通過降解細胞微環境中的色氨酸發揮抑制T淋巴細胞增殖的作用，并隨著IDO-BMSCs數量增加其IDO活性逐漸增強，對T淋巴細胞增殖的抑制作用增強，從而減輕T淋巴細胞介導的同種異體復合組織移植后的免疫排斥反應，延長移植物存活時間。綜上述，IDO基因修飾BMSCs在移植物局部微環境下能發揮免疫抑制作用，從而為同種異體復合組織移植后免疫耐受形成的研究提供一種新的實驗依據。
