引用本文： 尚巧利, 蔣海越, 周佳宇, 何樂人, 楊慶華. 擴張包膜對自體移植肋軟骨影響的初步組織學觀察. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 741-744. doi: 10.7507/1002-1892.20140165 復制
目前，臨床已廣泛應用耳后擴張器擴張皮膚進行外耳再造，不僅增加了皮膚量，而且皮瓣血運更穩定、質地變薄，再造耳廓支架的三維立體結構更易于顯現[1-4]。自體肋軟骨因具有彈性好、易雕刻、移植后易成活、排斥反應小等諸多優點，是目前最佳的再造耳支架材料[5-8]。然而在皮膚擴張法聯合自體肋軟骨支架移植再造外耳過程中，擴張器置入后在其周圍會形成擴張包膜，該擴張包膜應如何處理，對移植的自體肋軟骨生長有無影響，尚缺乏報道。為此，本研究以兔為實驗對象，制備背部皮膚擴張后自體肋軟骨植入模型，探討擴張包膜對軟骨生長的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
純品系健康3月齡新西蘭大白兔16只，雌雄不限，體重2.2～2.5 kg，由中國醫學科學院整形外科醫院動物房提供。15 mL長方形軟組織擴張器（余姚市久盛硅橡膠制品廠）。威恒電子天平（精度0.001 g；諸暨超澤衡器有限公司）。
1.2 實驗方法及分組
取新西蘭大白兔16只，肌肉注射（0.5 mL/kg）鹽酸氯胺酮及速眠寧混合液（1∶1）麻醉后，于背部兩側對稱位置各埋置2枚擴張器，共4枚，埋置于肉膜下[9]，注射壺內置。術后分籠飼養，3 d內每天肌肉注射青霉素80萬U。術后7 d開始注水，每周1次，每次15 mL，注水量達30 mL后停止注射，維持擴張1個月。
1個月后同上法麻醉實驗動物，于右側腹部作斜切口，切取第7、8肋軟骨。操作步驟：切開皮膚及皮下，切斷肌肉，可見肋軟骨表面有白色膜狀軟組織覆蓋，小心分離軟組織顯露軟骨膜，沿肋軟骨長軸中線切開軟骨膜，用剝離子沿該切口向軟骨兩端剝離，在肋骨與肋軟骨接合部靠軟骨端切斷肋軟骨，徒手將肋軟骨完整剝離，將軟骨膜完全留在軟骨床上。取長約0.5 cm軟骨置于10%甲醛溶液固定，行HE和Masson染色。將剩余軟骨等長切斷，稱重備用。同時取出背部擴張器，左側去除擴張包膜（實驗組），右側保留擴張包膜（對照組），止血后將自體軟骨分別植入擴張囊腔內，切口分層縫合。術后分籠飼養，3 d內每天肌肉注射青霉素80萬U。
1.3 觀測指標
分別于軟骨移植術后4、8周，同上法麻醉實驗動物后取背側入路，兩組各取16塊軟骨標本，徹底清除軟骨表面軟組織。標本先行大體觀察及稱重，以軟骨移植前后重量差進行比較。然后將標本置于10%甲醛溶液固定，脫鈣液脫鈣，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，行HE和Masson染色，鏡下觀察組織學形態變化。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0軟件統計進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
擴張器埋置術后注水過程中1只實驗動物不明原因死亡，余15只存活至實驗完成，納入研究。
2.2 大體觀察及軟骨重量
術后4、8周，兩組軟骨形態及顏色均未見明顯變化，且與周圍組織貼合；但實驗組軟骨與周圍組織貼合較對照組更緊密，術后8周時需銳性分離。術后4、8周時，實驗組移植前后軟骨重量差分別為（0.003 4 ± 0.002 7）、（0.005 8 ± 0.001 4）g，與對照組（-0.000 3 ± 0.001 9）、（-0.003 9 ± 0.005 3）g相比顯著增加，差異均有統計學意義（t=4.331，P=0.029；t=6.688，P=0.008）。實驗組術后8周軟骨重量差高于4周，但對照組顯著低于4周，差異均有統計學意義（t= -3.098，P=0.001；t=2.491，P=0.009）。
2.3 組織學觀察
鏡下觀察示，正常軟骨HE染色見軟骨細胞包埋于軟骨陷窩內，軟骨基質呈紫藍色均質狀，邊緣軟骨細胞呈單個分布，靠近軟骨中央常見多個細胞聚集形成一個同源細胞群；Masson染色見軟骨細胞分泌的膠原纖維呈藍染，且軟骨邊緣藍染較軟骨中央深。實驗組：術后4周軟骨活性較正常軟骨顯著增強，表現為軟骨細胞增多且密集，細胞間距縮小，2～6個軟骨細胞聚集形成一個同源細胞群，以4個居多，細胞層數增加，軟骨基質藍染加深；8周時軟骨活性較4周稍增強，未見明顯無細胞區。對照組：術后4周軟骨活力較正常軟骨有一定程度增強，但不及實驗組，軟骨細胞數目及細胞層數略增多，2～4個軟骨細胞聚集形成一個同源細胞群，以2個居多，軟骨基質藍染程度較實驗組淺；8 周時大部分軟骨細胞生長良好，軟骨細胞常單個存在，同源細胞群數量減少，軟骨陷窩存在，可見軟骨中央有局灶性無細胞區。見圖 1、2。
圖1
軟骨HE染色觀察（× 200） ? 正常軟骨 ? 實驗組術后4周 ? 實驗組術后8周 ? 對照組術后4周 ? 對照組術后8周 ? ?3 討論
3.1 擴張包膜的取舍
擴張包膜是皮膚軟組織擴張器置于機體后，由于機體存在異物反應以及持續擴張所產生的張力等因素，在擴張器周圍形成厚薄不均的纖維包膜，它是機體對異物侵入的一種自然保護性反應[10]，可隨擴張器的擴張而擴張。有學者對擴張包膜的組織結構進行了詳細研究，并將其結構分為4層[11]。研究發現[12-13]，通過改變注水方式、局部應用藥物等，對擴張包膜的形成及結構有一定影響。關于擴張包膜在手術時的取舍，目前意見尚不一致。安波等[14]在擴張包膜上植皮發現皮片成活良好；張志宏等[15]研究發現擴張包膜增加了擴張后動脈筋膜皮瓣的血供，認為應予以保留。劉學軍等[16]通過動物實驗發現，去除擴張包膜后，擴張皮膚的在體張力和即時回縮率均明顯減小。劉巖等[17]發現在面部擴張手術中利用擴張的纖維包膜可起到減張和保持口角及下瞼位置的作用。
3.2 移植軟骨的生長
肋軟骨是一種自身不含血管、淋巴管，營養主要靠周圍組織液滲透的組織，因此軟骨移植后周圍組織的血供對其成活與生長有著重要作用。有關軟骨移植后能否生長，目前文獻報道結果不一。Walia等[18]將幼兔耳軟骨移植后未見增長，保持了移植前的組織情況及大小。Gibson等[19]用同位素實驗證明9例成人軟骨移植后軟骨細胞均成活。李太穎等[20]發現，皮瓣下移植軟骨后其細胞結構首先發生退行性變，之后迅速恢復正常結構，并有新的軟骨組織形成。陳琦等[21]則發現將幼兔耳廓軟骨移植于擴張皮膚下可以存活并能生長。這些差異可能與軟骨移植位置、周圍血運情況及選擇的研究對象年齡有關。
3.3 實驗結果分析
本實驗將3月齡新西蘭大白兔肋軟骨去除軟骨膜后移植于擴張皮瓣下，實驗組軟骨隨時間延長，重量逐漸增加，4、8周間比較差異有統計學意義，提示去除包膜后，隨時間推移，軟骨能從周圍組織間獲得充足營養維持不斷生長狀態。而對照組軟骨重量呈減小趨勢，且4、8周時與實驗組比較差異均有統計學意義，提示保留包膜不利于軟骨從周圍組織獲得生長所需的營養，隨時間延長軟骨重量逐漸減輕。組織學觀察示，實驗組軟骨細胞數目增多，同源細胞群增加，膠原纖維藍染加深。軟骨生長方式有兩種，一種為軟骨內生長，依靠軟骨細胞分化增殖及分泌基質完成；另一種為軟骨膜下生長，來自軟骨膜下軟骨細胞的增生，與軟骨呈平行性生長[22]。本實驗中移植的軟骨均去除了軟骨膜，因此實驗組軟骨重量增加可能與軟骨細胞數目的增多及細胞分泌基質增加有關，而這些變化依賴于軟骨充分的營養供應。本實驗中形成的擴張皮瓣面積小，血運豐富，去除擴張包膜不僅不影響皮瓣的血運，同時軟骨還能與皮瓣更加緊密貼合，營養物質更易獲得。
綜上述，本實驗結果表明，去除擴張包膜有利于移植肋軟骨的生長及活力的保持。提示臨床行皮膚擴張法聯合自體肋軟骨支架移植再造外耳時，可去除擴張包膜以利于支架成活及生長，且切取肋軟骨時可以保留軟骨膜在原位，以減少術后患者胸廓畸形的發生。
目前，臨床已廣泛應用耳后擴張器擴張皮膚進行外耳再造，不僅增加了皮膚量，而且皮瓣血運更穩定、質地變薄，再造耳廓支架的三維立體結構更易于顯現[1-4]。自體肋軟骨因具有彈性好、易雕刻、移植后易成活、排斥反應小等諸多優點，是目前最佳的再造耳支架材料[5-8]。然而在皮膚擴張法聯合自體肋軟骨支架移植再造外耳過程中，擴張器置入后在其周圍會形成擴張包膜，該擴張包膜應如何處理，對移植的自體肋軟骨生長有無影響，尚缺乏報道。為此，本研究以兔為實驗對象，制備背部皮膚擴張后自體肋軟骨植入模型，探討擴張包膜對軟骨生長的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
純品系健康3月齡新西蘭大白兔16只，雌雄不限，體重2.2～2.5 kg，由中國醫學科學院整形外科醫院動物房提供。15 mL長方形軟組織擴張器（余姚市久盛硅橡膠制品廠）。威恒電子天平（精度0.001 g；諸暨超澤衡器有限公司）。
1.2 實驗方法及分組
取新西蘭大白兔16只，肌肉注射（0.5 mL/kg）鹽酸氯胺酮及速眠寧混合液（1∶1）麻醉后，于背部兩側對稱位置各埋置2枚擴張器，共4枚，埋置于肉膜下[9]，注射壺內置。術后分籠飼養，3 d內每天肌肉注射青霉素80萬U。術后7 d開始注水，每周1次，每次15 mL，注水量達30 mL后停止注射，維持擴張1個月。
1個月后同上法麻醉實驗動物，于右側腹部作斜切口，切取第7、8肋軟骨。操作步驟：切開皮膚及皮下，切斷肌肉，可見肋軟骨表面有白色膜狀軟組織覆蓋，小心分離軟組織顯露軟骨膜，沿肋軟骨長軸中線切開軟骨膜，用剝離子沿該切口向軟骨兩端剝離，在肋骨與肋軟骨接合部靠軟骨端切斷肋軟骨，徒手將肋軟骨完整剝離，將軟骨膜完全留在軟骨床上。取長約0.5 cm軟骨置于10%甲醛溶液固定，行HE和Masson染色。將剩余軟骨等長切斷，稱重備用。同時取出背部擴張器，左側去除擴張包膜（實驗組），右側保留擴張包膜（對照組），止血后將自體軟骨分別植入擴張囊腔內，切口分層縫合。術后分籠飼養，3 d內每天肌肉注射青霉素80萬U。
1.3 觀測指標
分別于軟骨移植術后4、8周，同上法麻醉實驗動物后取背側入路，兩組各取16塊軟骨標本，徹底清除軟骨表面軟組織。標本先行大體觀察及稱重，以軟骨移植前后重量差進行比較。然后將標本置于10%甲醛溶液固定，脫鈣液脫鈣，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，行HE和Masson染色，鏡下觀察組織學形態變化。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0軟件統計進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
擴張器埋置術后注水過程中1只實驗動物不明原因死亡，余15只存活至實驗完成，納入研究。
2.2 大體觀察及軟骨重量
術后4、8周，兩組軟骨形態及顏色均未見明顯變化，且與周圍組織貼合；但實驗組軟骨與周圍組織貼合較對照組更緊密，術后8周時需銳性分離。術后4、8周時，實驗組移植前后軟骨重量差分別為（0.003 4 ± 0.002 7）、（0.005 8 ± 0.001 4）g，與對照組（-0.000 3 ± 0.001 9）、（-0.003 9 ± 0.005 3）g相比顯著增加，差異均有統計學意義（t=4.331，P=0.029；t=6.688，P=0.008）。實驗組術后8周軟骨重量差高于4周，但對照組顯著低于4周，差異均有統計學意義（t= -3.098，P=0.001；t=2.491，P=0.009）。
2.3 組織學觀察
鏡下觀察示，正常軟骨HE染色見軟骨細胞包埋于軟骨陷窩內，軟骨基質呈紫藍色均質狀，邊緣軟骨細胞呈單個分布，靠近軟骨中央常見多個細胞聚集形成一個同源細胞群；Masson染色見軟骨細胞分泌的膠原纖維呈藍染，且軟骨邊緣藍染較軟骨中央深。實驗組：術后4周軟骨活性較正常軟骨顯著增強，表現為軟骨細胞增多且密集，細胞間距縮小，2～6個軟骨細胞聚集形成一個同源細胞群，以4個居多，細胞層數增加，軟骨基質藍染加深；8周時軟骨活性較4周稍增強，未見明顯無細胞區。對照組：術后4周軟骨活力較正常軟骨有一定程度增強，但不及實驗組，軟骨細胞數目及細胞層數略增多，2～4個軟骨細胞聚集形成一個同源細胞群，以2個居多，軟骨基質藍染程度較實驗組淺；8 周時大部分軟骨細胞生長良好，軟骨細胞常單個存在，同源細胞群數量減少，軟骨陷窩存在，可見軟骨中央有局灶性無細胞區。見圖 1、2。
圖1
軟骨HE染色觀察（× 200） ? 正常軟骨 ? 實驗組術后4周 ? 實驗組術后8周 ? 對照組術后4周 ? 對照組術后8周 ? ?3 討論
3.1 擴張包膜的取舍
擴張包膜是皮膚軟組織擴張器置于機體后，由于機體存在異物反應以及持續擴張所產生的張力等因素，在擴張器周圍形成厚薄不均的纖維包膜，它是機體對異物侵入的一種自然保護性反應[10]，可隨擴張器的擴張而擴張。有學者對擴張包膜的組織結構進行了詳細研究，并將其結構分為4層[11]。研究發現[12-13]，通過改變注水方式、局部應用藥物等，對擴張包膜的形成及結構有一定影響。關于擴張包膜在手術時的取舍，目前意見尚不一致。安波等[14]在擴張包膜上植皮發現皮片成活良好；張志宏等[15]研究發現擴張包膜增加了擴張后動脈筋膜皮瓣的血供，認為應予以保留。劉學軍等[16]通過動物實驗發現，去除擴張包膜后，擴張皮膚的在體張力和即時回縮率均明顯減小。劉巖等[17]發現在面部擴張手術中利用擴張的纖維包膜可起到減張和保持口角及下瞼位置的作用。
3.2 移植軟骨的生長
肋軟骨是一種自身不含血管、淋巴管，營養主要靠周圍組織液滲透的組織，因此軟骨移植后周圍組織的血供對其成活與生長有著重要作用。有關軟骨移植后能否生長，目前文獻報道結果不一。Walia等[18]將幼兔耳軟骨移植后未見增長，保持了移植前的組織情況及大小。Gibson等[19]用同位素實驗證明9例成人軟骨移植后軟骨細胞均成活。李太穎等[20]發現，皮瓣下移植軟骨后其細胞結構首先發生退行性變，之后迅速恢復正常結構，并有新的軟骨組織形成。陳琦等[21]則發現將幼兔耳廓軟骨移植于擴張皮膚下可以存活并能生長。這些差異可能與軟骨移植位置、周圍血運情況及選擇的研究對象年齡有關。
3.3 實驗結果分析
本實驗將3月齡新西蘭大白兔肋軟骨去除軟骨膜后移植于擴張皮瓣下，實驗組軟骨隨時間延長，重量逐漸增加，4、8周間比較差異有統計學意義，提示去除包膜后，隨時間推移，軟骨能從周圍組織間獲得充足營養維持不斷生長狀態。而對照組軟骨重量呈減小趨勢，且4、8周時與實驗組比較差異均有統計學意義，提示保留包膜不利于軟骨從周圍組織獲得生長所需的營養，隨時間延長軟骨重量逐漸減輕。組織學觀察示，實驗組軟骨細胞數目增多，同源細胞群增加，膠原纖維藍染加深。軟骨生長方式有兩種，一種為軟骨內生長，依靠軟骨細胞分化增殖及分泌基質完成；另一種為軟骨膜下生長，來自軟骨膜下軟骨細胞的增生，與軟骨呈平行性生長[22]。本實驗中移植的軟骨均去除了軟骨膜，因此實驗組軟骨重量增加可能與軟骨細胞數目的增多及細胞分泌基質增加有關，而這些變化依賴于軟骨充分的營養供應。本實驗中形成的擴張皮瓣面積小，血運豐富，去除擴張包膜不僅不影響皮瓣的血運，同時軟骨還能與皮瓣更加緊密貼合，營養物質更易獲得。
綜上述，本實驗結果表明，去除擴張包膜有利于移植肋軟骨的生長及活力的保持。提示臨床行皮膚擴張法聯合自體肋軟骨支架移植再造外耳時，可去除擴張包膜以利于支架成活及生長，且切取肋軟骨時可以保留軟骨膜在原位，以減少術后患者胸廓畸形的發生。
