引用本文： 李浙峰, 高偉陽, 陳時益, 李俊杰, 閆合德, 李志杰, 林丁盛. 吡格列酮藥物延遲對大鼠跨區穿支皮瓣成活的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 701-706. doi: 10.7507/1002-1892.20140155 復制
某一源動脈呈樹形分布的所有解剖學區域，包括皮膚、淺筋膜、深筋膜及其深層的各種組織稱為血管體[1]，這些血管體的定位常被外科醫生用于設計皮瓣。Cormack等[2]將皮瓣血管體分為3個區域：來自源動脈的解剖區、緊靠解剖區的動力區以及緊靠動力區的潛在區。choke血管指聯系相鄰血管體區域之間、管徑逐漸變細的血管，是跨區穿支皮瓣獲得血供的必經之路。因此，choke血管對穿支皮瓣，尤其是跨區穿支皮瓣的成活至關重要。目前關于choke血管擴張及形態學變化的了解大多來源于對手術延遲機制的研究[3-5]。隨著皮瓣延遲方法的改進，藥物延遲以安全、創傷小、痛苦小等優點逐漸成為皮瓣延遲的研究熱點[6-7]。但關于藥物延遲對choke血管的影響，目前研究甚少。
過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）激動劑最先應用于糖尿病治療領域，但研究表明這些激動劑對缺血再灌注以及炎癥同樣有效[8-9]。吡格列酮是一種PPAR-γ激動劑，它可同時調控NO生成及VEGF表達，促進血管擴張和血管新生，從而改善組織缺血[10-11]。本研究通過觀察吡格列酮藥物延遲對大鼠背部跨區穿支皮瓣成活及choke血管的影響，探討其作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級健康雄性SD大鼠70只，體重250～ 300 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供。吡格列酮（北京太陽藥業有限公司）；紅色氧化鉛（上海化學試劑總廠）；小鼠抗大鼠VEGF抗體（Santa Cruz公司，美國）；山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）。M2 Image Analysis System軟件（Imaging Research公司，加拿大）；Image-Pro Plus v6.0軟件（Media Cybernetics公司，美國）；Master Prep生物勻漿機（湖州海創生物科技有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
將70只大鼠隨機分為吡格列酮組（實驗組）和生理鹽水組（對照組），每組35只。按照Miyamoto 等[12]的方法，在兩組大鼠背部右側建立以一側旋髂深動脈穿支為蒂的三血管體穿支皮瓣，包括兩個choke血管區域。實驗組術前按照10 mg/（kg·d）劑量取吡格列酮，溶于1.5 mL生理鹽水，連續灌胃5 d，最后1次灌胃于術前2 h完成[13]；對照組同時間點給予等量生理鹽水。所有動物腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，在背部右側以后正中線為內側緣，髂后上棘連線為下界，肩胛下角為上界，設計大小為9.0 cm × 2.5 cm皮瓣；切開皮膚后在深筋膜層完全游離皮瓣，皮瓣掀起后，用4-0慕斯線原位縫合（圖 1）。
圖1
大鼠背部皮瓣模型 ? 皮瓣切取 DCI：旋髂深動脈穿支 IC：肋間后動脈穿支 TD：胸背動脈穿支 ? 皮瓣原位縫合 ? ?1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后肉眼觀察皮瓣成活狀況，包括皮瓣顏色、組織彈性、質地及壞死發生情況等。皮瓣壞死標準[14]：顏色發黑，組織回縮、彈性差，質地堅硬，切割組織不出血。術后7 d兩組實驗動物同上法麻醉后，皮瓣照相并導入M2 Image Analysis System軟件，計算皮瓣成活面積百分比。
1.3.2 皮瓣血管造影觀察
術后7 d兩組各取5只實驗動物進行皮瓣血管造影術。同上法麻醉后，取仰臥位固定，分離一側頸動脈，將留置針穿入頸動脈，排盡大鼠體內血液，同時注入1%肝素1.5 mL；將配置的明膠-氧化鉛混合物（40～50 L/ kg）注入頸動脈，待大鼠鞏膜及四肢末端出現點狀、斑片狀灌注液顏色時，停止灌注。然后置于4℃冰箱冷藏過夜，以便明膠凝結。隔日解剖分離皮瓣，平鋪攝X線片（40 kV、5 mA、0.1 s 曝光時間）。觀察皮瓣成活區與壞死區的血管結構以及相連血管體之間choke血管擴張情況的變化，計數choke Ⅰ、Ⅱ區真性吻合數。
1.3.3 組織學觀察
術后7 d兩組各取5只實驗動物，過量麻醉處死后，取chokeⅡ區中央區域的皮瓣組織，大小約2.0 cm × 0.5 cm，置于10%甲醛溶液固定，常規脫水包埋，3～4 μm厚切片，取部分切片行HE染色。光鏡下觀察肉芽組織層厚度、組織水腫、壞死、炎性細胞浸潤等情況。在低倍鏡下找到微血管密集區，然后在20 × 10倍鏡下隨意選取5個視野，計數血管數，取均值，計算單位面積微血管數目（個/mm2），作為評價微血管密度（microvessel density，MVD）的指標。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
取其余部分切片采用二步法行免疫組織化學染色，檢測VEGF表達及分布情況。呈棕黃色顆粒為陽性表達，選擇染色均勻的區域，于40 × 10倍光鏡下進行觀察，每張切片取5個視野照相。將圖片導入Image-Pro Plus v6.0軟件，測量圖片陽性表達的積分吸光度（IA）值，作為評價VEGF表達的指標。
1.3.5 NO表達測定
分別于術后即刻（術后1 h內）及1、3、5、7 d，兩組各取5只實驗動物，過量麻醉處死后，取chokeⅠ區及Ⅱ區中央區域皮瓣組織（大小為0.5 cm × 0.5 cm），采用生物勻漿機勻漿組織。按照NO試劑盒說明書，采用硝酸酶還原法測定組織NO含量。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；組內比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
兩組大鼠均存活至實驗完成。術后兩組皮瓣大體變化相似，1 d時皮瓣均出現不同程度腫脹，皮瓣遠端呈暗紫色，但無明顯壞死；3 d時皮瓣遠端出現局部灶狀、小片狀壞死，壞死部分多呈紅褐色，有瘀血；7 d時皮瓣遠端壞死部分均趨于融合，有黑色痂殼，質硬，呈干性壞死，界線清晰（圖 2）。掀起皮瓣觀察，壞死組織位于潛在區。術后7 d實驗組皮瓣成活面積百分比為87.73% ± 3.25%，顯著高于對照組的76.07% ± 2.92%，差異有統計學意義（t= -10.338，P=0.000）。
2.2 皮瓣血管造影觀察
對照組：皮瓣蒂部穿支與肋間后動脈穿支之間相連的chokeⅠ區choke血管出現部分擴張，部分管徑逐漸減小的choke血管吻合變成管徑不減小的真性吻合；而chokeⅡ區的choke血管擴張不明顯，潛在區血管結構較紊亂，遠端壞死區顯示胸背動脈穿支在入皮點附近及遠端部分血管結構紊亂或消失。實驗組：各供區血管結構較完整，chokeⅡ區血管結構清晰；chokeⅠ、Ⅱ區出現了大量真性吻合；遠端壞死區顯示胸背動脈穿支入皮點以遠血管結構僅部分紊亂或消失（圖 3）。實驗組chokeⅠ、Ⅱ區真性吻合數分別為（5.40 ± 1.14）、（3.00 ± 0.71）個，顯著高于對照組的（3.20 ± 0.84）、（0.80 ± 0.84）個，比較差異均有統計學意義（t= -3.479，P=0.008；t= -4.491，P=0.002）。
2.3 組織學觀察
鏡下觀察示，與對照組相比，實驗組chokeⅡ區組織輕度水腫，炎性細胞浸潤較輕，肉芽組織較少，皮膚附屬器存在，并見大量新生血管（圖 4）。實驗組和對照組MVD分別為（33.16 ± 7.73）、（23.29 ± 5.91） 個 / mm2，比較差異有統計學意義（t=5.073，P=0.000）。
圖4
術后7 d兩組皮瓣HE染色觀察 ? 實驗組（× 40） ? 實驗組（× 200） ? 對照組（× 40） ? 對照組（× 200） ? ?2.4 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察示實驗組chokeⅡ區的VEGF表達較強，對照組表達相對較弱，見圖 5。實驗組和對照組chokeⅡ區IA值分別為4 368.80 ± 458.23和2 241.24 ± 554.43，比較差異有統計學意義（t= -14.789，P=0.000）。
2.5 NO含量檢測
除術后即刻外，其余各時間點實驗組chokeⅠ、Ⅱ區NO含量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。兩組chokeⅠ區NO含量變化趨勢一致，術后即刻開始逐漸升高，至3 d達峰值，之后逐漸下降，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組chokeⅡ區NO含量變化趨勢與Ⅰ區一致，除術后即刻外，組內各時間點間比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；對照組chokeⅡ區術后即刻NO含量即開始升高，1 d時達峰值，之后逐漸下降，組內各時間點間比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 6。
圖6
術后各時間點兩組NO含量 chokeⅠ區 chokeⅡ區
Figure6.
The content of NO in 2 groups after operation choke zone Ⅰ choke zone Ⅱ
3 討論
藥物延遲的目的是在皮瓣暴露于缺血時可誘導其反應，提高皮瓣成活率。choke血管是連接相連穿支血管體的橋梁，但其并未閉塞，而是管徑逐漸減小的吻合血管。解剖學研究顯示[12]，將皮瓣由解剖區向動力區乃至潛在區延伸，有望獲取較大面積甚至巨大皮瓣的可能。但是，其必要前提是采取某種有效方法使這3 個不同供區之間的吻合血管開放、擴張及血管新生，進而建立新的血液循環體系，使3個不同的小供區變成1 個大供區。
NO在擴張血管、改善微循環及缺血再灌注損傷中起重要作用[15-16]。并且，皮瓣遠端低血流量及壞死部分更依賴NO擴張血管的效應[17]。McDonald等[18]研究發現，NO在延遲皮瓣微循環中發揮了重要作用，它可以擴張choke血管，主要通過擴張血管和增加血流量來提高皮瓣成活率。而PPAR-γ激動劑可以直接改善血管內皮細胞功能及調控NO的產生[19]。本研究結果顯示，除術后即刻外，其余各時間點實驗組NO含量均較對照組明顯提高；皮瓣血管造影顯示在choke區，實驗組較對照組出現了大量的真性吻合，而這種choke血管的擴張可能同樣來自NO的作用。
Dhar等[3]報道choke血管的擴張主要在術后早期發生，皮瓣掀起后choke血管首先是短暫的血管痙攣，然后血管管徑逐漸擴張，2～3 d時擴張最明顯，3～7 d趨于平穩。2012年，Zhuang等[20]通過皮窗技術在活體下動態觀察chokeⅠ區choke血管形態學變化，發現choke血管于術后（60 ± 12）h發生管徑擴張，之后持續擴張，（5.0 ± 0.5）d時管徑達峰值，之后趨于平穩。以上研究結果表明，術后choke血管管徑變化是一連續過程。為探討NO對choke血管擴張的作用，本研究選擇術后連續時間點測量NO含量。結果表明，實驗組及對照組chokeⅠ區的NO含量均在術后即刻開始升高，3 d時達峰值；而在chokeⅡ區，對照組術后1 d達高峰后即下降，經吡格列酮藥物延遲處理后的實驗組NO高水平則維持在1～3 d。提示吡格列酮對皮瓣的延遲作用主要是在早期通過提高NO含量擴張choke血管，從而改善潛在區的血流灌注完成。
VEGF是調節血管新生的關鍵因子[21]，皮瓣移植術后VEGF表達水平與MVD成正相關，VEGF的表達可間接反映血供重建情況[22]。研究表明，體外應用VEGF局部促血管新生或應用藥物促進內源性VEGF釋放，均可改善皮瓣的成活 [23-24]。近年來，越來越多研究顯示，PPAR-γ激動劑可促進VEGF表達而參與調節血管新生[11, 25]。跨區穿支皮瓣壞死常發生在潛在區[4, 26]，從而限制了該皮瓣的擴大切取。而chokeⅡ區正是聯系動力區及潛在區之間的choke血管吻合區，其變化可能直接影響潛在區的成活。本研究中實驗組chokeⅡ區血管新生及VEGF的表達較對照組有明顯提高，提示吡格列酮可能是通過促進內源性VEGF釋放，有效刺激了choke Ⅱ區的血管新生，從而改善了潛在區的成活。
綜上述，本研究結果提示應用吡格列酮藥物延遲能有效刺激大鼠背部跨區穿支皮瓣新生血管增生，擴張choke血管改善皮瓣血供，從而促進了跨區穿支皮瓣潛在區的成活。但本研究僅探討了吡格列酮藥物延遲后皮瓣NO、VEGF的表達情況，以及NO對choke血管變化的影響，對于PPAR-γ表達與NO、VEGF表達的關系有待進一步明確。此外，本研究僅觀察了術后7 d chokeⅡ區VEGF表達情況，但術后VEGF表達也應是動態表達過程，因此下一步研究需要采用Western blot法或PCR法進行多時間點VEGF、NO、 PPAR-γ動態表達定量檢測，進一步闡述吡格列酮藥物延遲后PPAR-γ表達與NO、VEGF的關系。
某一源動脈呈樹形分布的所有解剖學區域，包括皮膚、淺筋膜、深筋膜及其深層的各種組織稱為血管體[1]，這些血管體的定位常被外科醫生用于設計皮瓣。Cormack等[2]將皮瓣血管體分為3個區域：來自源動脈的解剖區、緊靠解剖區的動力區以及緊靠動力區的潛在區。choke血管指聯系相鄰血管體區域之間、管徑逐漸變細的血管，是跨區穿支皮瓣獲得血供的必經之路。因此，choke血管對穿支皮瓣，尤其是跨區穿支皮瓣的成活至關重要。目前關于choke血管擴張及形態學變化的了解大多來源于對手術延遲機制的研究[3-5]。隨著皮瓣延遲方法的改進，藥物延遲以安全、創傷小、痛苦小等優點逐漸成為皮瓣延遲的研究熱點[6-7]。但關于藥物延遲對choke血管的影響，目前研究甚少。
過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）激動劑最先應用于糖尿病治療領域，但研究表明這些激動劑對缺血再灌注以及炎癥同樣有效[8-9]。吡格列酮是一種PPAR-γ激動劑，它可同時調控NO生成及VEGF表達，促進血管擴張和血管新生，從而改善組織缺血[10-11]。本研究通過觀察吡格列酮藥物延遲對大鼠背部跨區穿支皮瓣成活及choke血管的影響，探討其作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級健康雄性SD大鼠70只，體重250～ 300 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供。吡格列酮（北京太陽藥業有限公司）；紅色氧化鉛（上海化學試劑總廠）；小鼠抗大鼠VEGF抗體（Santa Cruz公司，美國）；山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）。M2 Image Analysis System軟件（Imaging Research公司，加拿大）；Image-Pro Plus v6.0軟件（Media Cybernetics公司，美國）；Master Prep生物勻漿機（湖州海創生物科技有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
將70只大鼠隨機分為吡格列酮組（實驗組）和生理鹽水組（對照組），每組35只。按照Miyamoto 等[12]的方法，在兩組大鼠背部右側建立以一側旋髂深動脈穿支為蒂的三血管體穿支皮瓣，包括兩個choke血管區域。實驗組術前按照10 mg/（kg·d）劑量取吡格列酮，溶于1.5 mL生理鹽水，連續灌胃5 d，最后1次灌胃于術前2 h完成[13]；對照組同時間點給予等量生理鹽水。所有動物腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，在背部右側以后正中線為內側緣，髂后上棘連線為下界，肩胛下角為上界，設計大小為9.0 cm × 2.5 cm皮瓣；切開皮膚后在深筋膜層完全游離皮瓣，皮瓣掀起后，用4-0慕斯線原位縫合（圖 1）。
圖1
大鼠背部皮瓣模型 ? 皮瓣切取 DCI：旋髂深動脈穿支 IC：肋間后動脈穿支 TD：胸背動脈穿支 ? 皮瓣原位縫合 ? ?1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后肉眼觀察皮瓣成活狀況，包括皮瓣顏色、組織彈性、質地及壞死發生情況等。皮瓣壞死標準[14]：顏色發黑，組織回縮、彈性差，質地堅硬，切割組織不出血。術后7 d兩組實驗動物同上法麻醉后，皮瓣照相并導入M2 Image Analysis System軟件，計算皮瓣成活面積百分比。
1.3.2 皮瓣血管造影觀察
術后7 d兩組各取5只實驗動物進行皮瓣血管造影術。同上法麻醉后，取仰臥位固定，分離一側頸動脈，將留置針穿入頸動脈，排盡大鼠體內血液，同時注入1%肝素1.5 mL；將配置的明膠-氧化鉛混合物（40～50 L/ kg）注入頸動脈，待大鼠鞏膜及四肢末端出現點狀、斑片狀灌注液顏色時，停止灌注。然后置于4℃冰箱冷藏過夜，以便明膠凝結。隔日解剖分離皮瓣，平鋪攝X線片（40 kV、5 mA、0.1 s 曝光時間）。觀察皮瓣成活區與壞死區的血管結構以及相連血管體之間choke血管擴張情況的變化，計數choke Ⅰ、Ⅱ區真性吻合數。
1.3.3 組織學觀察
術后7 d兩組各取5只實驗動物，過量麻醉處死后，取chokeⅡ區中央區域的皮瓣組織，大小約2.0 cm × 0.5 cm，置于10%甲醛溶液固定，常規脫水包埋，3～4 μm厚切片，取部分切片行HE染色。光鏡下觀察肉芽組織層厚度、組織水腫、壞死、炎性細胞浸潤等情況。在低倍鏡下找到微血管密集區，然后在20 × 10倍鏡下隨意選取5個視野，計數血管數，取均值，計算單位面積微血管數目（個/mm2），作為評價微血管密度（microvessel density，MVD）的指標。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
取其余部分切片采用二步法行免疫組織化學染色，檢測VEGF表達及分布情況。呈棕黃色顆粒為陽性表達，選擇染色均勻的區域，于40 × 10倍光鏡下進行觀察，每張切片取5個視野照相。將圖片導入Image-Pro Plus v6.0軟件，測量圖片陽性表達的積分吸光度（IA）值，作為評價VEGF表達的指標。
1.3.5 NO表達測定
分別于術后即刻（術后1 h內）及1、3、5、7 d，兩組各取5只實驗動物，過量麻醉處死后，取chokeⅠ區及Ⅱ區中央區域皮瓣組織（大小為0.5 cm × 0.5 cm），采用生物勻漿機勻漿組織。按照NO試劑盒說明書，采用硝酸酶還原法測定組織NO含量。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；組內比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
兩組大鼠均存活至實驗完成。術后兩組皮瓣大體變化相似，1 d時皮瓣均出現不同程度腫脹，皮瓣遠端呈暗紫色，但無明顯壞死；3 d時皮瓣遠端出現局部灶狀、小片狀壞死，壞死部分多呈紅褐色，有瘀血；7 d時皮瓣遠端壞死部分均趨于融合，有黑色痂殼，質硬，呈干性壞死，界線清晰（圖 2）。掀起皮瓣觀察，壞死組織位于潛在區。術后7 d實驗組皮瓣成活面積百分比為87.73% ± 3.25%，顯著高于對照組的76.07% ± 2.92%，差異有統計學意義（t= -10.338，P=0.000）。
2.2 皮瓣血管造影觀察
對照組：皮瓣蒂部穿支與肋間后動脈穿支之間相連的chokeⅠ區choke血管出現部分擴張，部分管徑逐漸減小的choke血管吻合變成管徑不減小的真性吻合；而chokeⅡ區的choke血管擴張不明顯，潛在區血管結構較紊亂，遠端壞死區顯示胸背動脈穿支在入皮點附近及遠端部分血管結構紊亂或消失。實驗組：各供區血管結構較完整，chokeⅡ區血管結構清晰；chokeⅠ、Ⅱ區出現了大量真性吻合；遠端壞死區顯示胸背動脈穿支入皮點以遠血管結構僅部分紊亂或消失（圖 3）。實驗組chokeⅠ、Ⅱ區真性吻合數分別為（5.40 ± 1.14）、（3.00 ± 0.71）個，顯著高于對照組的（3.20 ± 0.84）、（0.80 ± 0.84）個，比較差異均有統計學意義（t= -3.479，P=0.008；t= -4.491，P=0.002）。
2.3 組織學觀察
鏡下觀察示，與對照組相比，實驗組chokeⅡ區組織輕度水腫，炎性細胞浸潤較輕，肉芽組織較少，皮膚附屬器存在，并見大量新生血管（圖 4）。實驗組和對照組MVD分別為（33.16 ± 7.73）、（23.29 ± 5.91） 個 / mm2，比較差異有統計學意義（t=5.073，P=0.000）。
圖4
術后7 d兩組皮瓣HE染色觀察 ? 實驗組（× 40） ? 實驗組（× 200） ? 對照組（× 40） ? 對照組（× 200） ? ?2.4 免疫組織化學染色觀察
鏡下觀察示實驗組chokeⅡ區的VEGF表達較強，對照組表達相對較弱，見圖 5。實驗組和對照組chokeⅡ區IA值分別為4 368.80 ± 458.23和2 241.24 ± 554.43，比較差異有統計學意義（t= -14.789，P=0.000）。
2.5 NO含量檢測
除術后即刻外，其余各時間點實驗組chokeⅠ、Ⅱ區NO含量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。兩組chokeⅠ區NO含量變化趨勢一致，術后即刻開始逐漸升高，至3 d達峰值，之后逐漸下降，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組chokeⅡ區NO含量變化趨勢與Ⅰ區一致，除術后即刻外，組內各時間點間比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；對照組chokeⅡ區術后即刻NO含量即開始升高，1 d時達峰值，之后逐漸下降，組內各時間點間比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 6。
圖6
術后各時間點兩組NO含量 chokeⅠ區 chokeⅡ區
Figure6.
The content of NO in 2 groups after operation choke zone Ⅰ choke zone Ⅱ
3 討論
藥物延遲的目的是在皮瓣暴露于缺血時可誘導其反應，提高皮瓣成活率。choke血管是連接相連穿支血管體的橋梁，但其并未閉塞，而是管徑逐漸減小的吻合血管。解剖學研究顯示[12]，將皮瓣由解剖區向動力區乃至潛在區延伸，有望獲取較大面積甚至巨大皮瓣的可能。但是，其必要前提是采取某種有效方法使這3 個不同供區之間的吻合血管開放、擴張及血管新生，進而建立新的血液循環體系，使3個不同的小供區變成1 個大供區。
NO在擴張血管、改善微循環及缺血再灌注損傷中起重要作用[15-16]。并且，皮瓣遠端低血流量及壞死部分更依賴NO擴張血管的效應[17]。McDonald等[18]研究發現，NO在延遲皮瓣微循環中發揮了重要作用，它可以擴張choke血管，主要通過擴張血管和增加血流量來提高皮瓣成活率。而PPAR-γ激動劑可以直接改善血管內皮細胞功能及調控NO的產生[19]。本研究結果顯示，除術后即刻外，其余各時間點實驗組NO含量均較對照組明顯提高；皮瓣血管造影顯示在choke區，實驗組較對照組出現了大量的真性吻合，而這種choke血管的擴張可能同樣來自NO的作用。
Dhar等[3]報道choke血管的擴張主要在術后早期發生，皮瓣掀起后choke血管首先是短暫的血管痙攣，然后血管管徑逐漸擴張，2～3 d時擴張最明顯，3～7 d趨于平穩。2012年，Zhuang等[20]通過皮窗技術在活體下動態觀察chokeⅠ區choke血管形態學變化，發現choke血管于術后（60 ± 12）h發生管徑擴張，之后持續擴張，（5.0 ± 0.5）d時管徑達峰值，之后趨于平穩。以上研究結果表明，術后choke血管管徑變化是一連續過程。為探討NO對choke血管擴張的作用，本研究選擇術后連續時間點測量NO含量。結果表明，實驗組及對照組chokeⅠ區的NO含量均在術后即刻開始升高，3 d時達峰值；而在chokeⅡ區，對照組術后1 d達高峰后即下降，經吡格列酮藥物延遲處理后的實驗組NO高水平則維持在1～3 d。提示吡格列酮對皮瓣的延遲作用主要是在早期通過提高NO含量擴張choke血管，從而改善潛在區的血流灌注完成。
VEGF是調節血管新生的關鍵因子[21]，皮瓣移植術后VEGF表達水平與MVD成正相關，VEGF的表達可間接反映血供重建情況[22]。研究表明，體外應用VEGF局部促血管新生或應用藥物促進內源性VEGF釋放，均可改善皮瓣的成活 [23-24]。近年來，越來越多研究顯示，PPAR-γ激動劑可促進VEGF表達而參與調節血管新生[11, 25]。跨區穿支皮瓣壞死常發生在潛在區[4, 26]，從而限制了該皮瓣的擴大切取。而chokeⅡ區正是聯系動力區及潛在區之間的choke血管吻合區，其變化可能直接影響潛在區的成活。本研究中實驗組chokeⅡ區血管新生及VEGF的表達較對照組有明顯提高，提示吡格列酮可能是通過促進內源性VEGF釋放，有效刺激了choke Ⅱ區的血管新生，從而改善了潛在區的成活。
綜上述，本研究結果提示應用吡格列酮藥物延遲能有效刺激大鼠背部跨區穿支皮瓣新生血管增生，擴張choke血管改善皮瓣血供，從而促進了跨區穿支皮瓣潛在區的成活。但本研究僅探討了吡格列酮藥物延遲后皮瓣NO、VEGF的表達情況，以及NO對choke血管變化的影響，對于PPAR-γ表達與NO、VEGF表達的關系有待進一步明確。此外，本研究僅觀察了術后7 d chokeⅡ區VEGF表達情況，但術后VEGF表達也應是動態表達過程，因此下一步研究需要采用Western blot法或PCR法進行多時間點VEGF、NO、 PPAR-γ動態表達定量檢測，進一步闡述吡格列酮藥物延遲后PPAR-γ表達與NO、VEGF的關系。
