引用本文： 鄧玖征, 張友樂, 李翔. 低溫凍存同種異體骨膜和骨髓移植免疫原性研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(5): 649-653. doi: 10.7507/1002-1892.20140143 復制
同種異體關節移植用于修復重建創傷、骨軟骨疾病及骨惡性腫瘤術后關節缺損已經歷百余年，應用早期因基礎及臨床研究水平有限效果不佳[1]。20世紀80年代后，隨著低溫凍存技術及免疫抑制藥物的應用，同種異體關節移植取得長足發展，但免疫排斥反應仍是限制其應用的主要因素[2]。關節組織成分復雜，了解不同組織的免疫原性，可指導同種異體關節的制備，以獲得低免疫原性、可長期存活的同種異體關節。本研究采用低溫凍存處理骨膜、骨髓后，將其注入同種異體兔腹腔內，通過檢測血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度和外周靜脈血CD4+ T細胞與CD8+ T細胞比例，以期獲得較為全面的免疫原性數據，為探索同種異體關節合適的制備方法提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡清潔級新西蘭白兔5只作為供體，雌性3只，雄性2只，體重2.6～3.0 kg；6月齡清潔級青紫藍兔18只作為受體，雌雄各半，體重2.1～2.8 kg；均由北京欣綠安實驗動物中心提供。
兔IL-2 ELISA試劑盒、兔IL-6 ELISA試劑盒、兔TNF-α ELISA試劑盒（R&D公司，美國）；FITC標記抗兔CD4抗體、FITC標記抗兔CD8抗體（Antigenix公司，美國）；L-DMEM培養液（GIBCO公司，美國）；FBS（Clark公司，美國）；DMSO（北京優博奧生物科技有限公司）。
紅細胞裂解液配制：去離子水100 mL、NH4Cl 155 mmol（8.219 g）、EDTA 0.1 mmol（0.037 g）、KHCO3 10 mmol（1.012 g）混合后攪拌均勻，調整pH值為7.5，得到10倍濃度紅細胞裂解液100 mL，使用時加入900 mL去離子水定容至1 000 mL。低溫保護劑配制：依據說明書配置DMEM培養液，將DMEM培養液、FBS、DMSO按照7∶2∶1混合[3]。
發光檢測儀（Berthold公司，德國）；離心機（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；FACS Caluber流式細胞儀、Cellquest軟件（BD公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 供體處理
取5只新西蘭白兔，耳緣靜脈注射空氣處死。取雙側膝關節正中切口，分離皮下組織，暴露膝關節及周圍肌肉，自前內側切開并剝離肌肉組織，暴露股骨及脛骨，用線鋸由膝關節上、下端各約2 cm處截骨，取出膝關節。取關節上存留骨膜，紗布過濾、生理鹽水漂洗，漂洗液經0.22 μm過濾器過濾，收集所有骨膜備用；沖洗髓腔，取出骨髓，同法過濾后備用。將收集的骨膜及骨髓分別用低溫保護劑浸泡30 min，置入無菌廣口瓶內，4℃冰箱冷平衡30 min；以1℃/ min速率降至- 20℃，平衡2 h；以1℃/min速率降至- 80℃，平衡1 d后液氮凍存。1個月后取出骨膜、 骨髓組織，無菌條件下37℃水浴復溫2 min，解凍后室溫下生理鹽水漂洗5 min，過濾器收集組織。將骨膜剪碎，放入無菌研磨皿中研磨，稱重；取6 g組織，加入生理鹽水至12 mL，配制成0.5 g/mL懸濁液，分裝至6只 2 mL 無菌注射器備用。同法制備骨髓懸濁液。
1.2.2 受體處理
取18只青紫藍兔隨機分成A、B、C 3組（n=6），分別于兔中下腹旁中線2 cm處注射2 mL生理鹽水、骨膜懸濁液、骨髓懸濁液。注射器穿透腹壁時有突破感，回抽無異物后緩慢注射，觀察注射部位無出血。注射完畢后將兔放回飼養籠內，自由活動。
1.3 檢測指標
1.3.1 血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度檢測
分別于注射前及注射后1、2周耳緣靜脈取血4 mL，靜置20 min，以485 × g離心20 min，取上清，- 20℃恒溫凍存，統一送檢。按兔IL-2、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明書方法檢測血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度。
1.3.2 T細胞亞群測定
分別于注射前及注射后1、2 周耳緣靜脈取血4 mL，EDTA抗凝，4℃冰水浴中檢測T細胞亞群。取2 mL靜脈血，盛入離心管中，加入紅細胞裂解液，混勻，靜置5 min。以485 × g離心5 min。棄上清，PBS緩沖液沖洗2次，再加入適量PBS緩沖液，將細胞吹吸均勻（重懸）。顯微鏡下計數細胞，調整細胞混懸液濃度至1 ×107 個 / mL。取細胞混懸液100 μL，加入1 μL FITC標記抗體（CD4或CD8），4℃下靜置染色30 min。以不加FITC標記抗體的細胞混懸液作為陰性對照。同上法離心并重懸至400 mL，轉移至流式管內上機檢測。采用Cellquest軟件計數染色細胞數，分別得到CD4+ T細胞及CD8+ T細胞占有核細胞的百分比，再計算CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值。
1.4 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，采用重復測量方差分析，球形檢驗水準P=0.05，當P＜ 0.05時，認為重復測量數據之間存在相關性，采用Greenhouse-Geisser校正結果。
2 結果
2.1 血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度檢測
IL-2：球形檢驗P=0.039，不符合球形數據，采用Greenhouse-Geisser校正結果：采用時間為單一因素考慮時，F=1.492，P=0.241，說明IL-2濃度無時間變化趨勢；時間和組別交互作用分析結果顯示，F=1.726，P=0.192，說明時間因素的作用不隨分組變化而發生變化；組間比較結果，F=3.552，P=0.055，說明各組間血清IL-2濃度變化差異無統計學意義。見表 1。
表1
各組各時間點血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度及CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值測定（n=6，IL-6：球形檢驗P=0.004，不符合球形數據，采用Greenhouse-Geisser校正結果：采用時間為單一因素考慮時，F=4.422，P=0.040，說明IL-6濃度變化存在時間變化趨勢，注射后1周各組均值下降，2周時A、B組略回升；時間和組別交互作用分析結果顯示，F=0.670，P=0.561，說明時間因素的作用不隨分組變化而變化；組間比較結果，F=1.106，P=0.357，說明各組間血清IL-6濃度變化差異無統計學意義。見表 1。
TNF-α：球形檢驗P=0.338，符合球形數據，采用單變量方差分析結果：采用時間為單一因素考慮時，F=0.078，P=0.925，說明TNF-α濃度無時間變化趨勢；時間和組別交互作用分析結果顯示，F=1.343，P=0.277，說明時間因素的作用不隨分組變化而變化；組間比較結果顯示，F=5.381，P=0.017，說明各組間血清TNF-α變化差異有統計學意義，兩兩比較采用LSD法，結果顯示B組顯著高于A、C組（P＜ 0.05），A、C組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1。
2.2 CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值測定
球形檢驗P=0.013，不符合球形數據，采用Greenhouse-Geisser校正結果：采用時間為單一因素考慮時，F=1.471，P=0.248，說明CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值無時間變化趨勢；時間與組別交互作用分析結果顯示，F=1.987，P=0.151，說明時間因素的作用不隨分組變化而發生變化；組間比較結果顯示，F=0.450，P=0.646，說明各組間CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值差異無統計學意義。見表 1。
3 討論
同種異體關節因具有供體來源廣泛、大小形狀不受限制、有生物活性、與受體部位能產生生物結合等優點，經過多年發展與完善，成為修復嚴重關節缺損的可行技術，并取得一定療效[4-5]。低溫凍存技術的發展在提高軟骨細胞成活率基礎上，降低了同種異體材料的免疫原性，使移植后材料更易成活[6-8]。關節周圍組織成分主要包括骨骼、韌帶、骨膜、骨髓、纖維囊、滑膜等，其中同種異體骨、肌腱移植已廣泛應用于臨床，其免疫原性也得到比較充分的認識。滑膜及纖維囊結構多位于關節腔內，剔除操作需切開關節，會損傷關節囊及周圍軟組織，在小關節移植中影響關節穩定[9]，因而制備過程中難以剔除，故未納入研究。目前，針對低溫凍存后同種異體骨膜及骨髓的免疫原性研究較少。通過確定同種異體骨膜、骨髓免疫原性強度，可明確高免疫原性的軟組織成分，改進制備過程，以獲得低免疫原性、易于成活的同種異體關節。為此，我們進行了本次研究。
青紫藍兔和新西蘭白兔屬于哺乳綱、兔形目、兔科、真兔屬、家兔下的兩個不同品系，采用不同品系作為供體與受體，可避免因近親造成的同種異體移植免疫排斥反應較弱的問題[10]。骨膜、骨髓凍存采用的低溫保護劑浸泡、程序降溫方法，利于保存細胞的生物活性，并降低移植物的免疫原性，便于存儲和運輸，是目前成熟并廣泛采用的同種異體移植材料處理方法[11-12]。通過腹腔注射組織懸濁液制作動物模型，可分別針對骨膜、骨髓進行研究，便于探索單一成分的免疫原性特點，并可統一注射劑量，增強各組數據間的可比性。采用靜脈血IL-2、IL-6、TNF-α濃度及T細胞亞群作為檢測指標，對受體損傷小，進而對兔免疫系統干擾小，利于對同一實驗個體進行多次重復測量，達到動態觀測指標變化的目的。
同種異體移植免疫排斥反應的靶抗原主要是共顯性表達于移植物細胞表面的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子，其基因位于第6號染色體。免疫排斥反應的本質是T細胞介導的免疫應答過程。同種異體移植免疫排斥反應效應機制主要包括：① CD4+ T細胞（Th細胞）活化和巨噬細胞動員，引起遲發型超敏反應；② CD8+ T細胞的直接殺傷作用；③ 抗原抗體復合物形成，激活補體系統，損害移植物血管。當移植物植入受體體內后，通過直接和間接途徑刺激CD4+ T細胞，產生多種細胞因子，成為Th0細胞，Th0細胞在不同細胞因子作用下向Th1和Th2細胞分化。Th1細胞主要分泌IL-2、INF-g等細胞因子，促進細胞毒性T細胞和遲發型超敏反應T細胞成熟，促進細胞介導的免疫應答。而IL-1、IL-2又對淋巴細胞進行自分泌或旁分泌調節，與抗原的特異性刺激一起，共同激活T細胞，從而介導移植物的排斥反應。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，促進B細胞成熟及抗體生成，其中IL-6主要刺激B細胞產生IgG抗體，增強抗體介導的免疫應答。CD4+ T細胞識別MHCⅡ類分子，主要是Th細胞，誘導免疫應答；CD8+ T細胞識別MHCⅠ類分子，主要為細胞毒性T細胞和抑制T細胞，對同種異體細胞造成直接殺傷，并可下調免疫應答水平。CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值的變化反映了家兔細胞免疫系統的穩定水平及細胞免疫的強度[13-14]。對于初次進入體內的同種異體組織，急性免疫排斥反應一般發生在植入后10～13 d，且在2～3周達峰值，采集該時間段的數據可以比較敏感反映急性免疫排斥反應[15-17]。
本研究中，IL-2檢測結果顯示B、C組注射后1周血清IL-2水平均有所升高，C組于2周時降至注射前水平，但與A組比較差異無統計學意義，說明經低溫冷凍處理后，骨膜、骨髓未引起明顯特異性細胞免疫應答，這與文獻報道結果一致[18]。因為經低溫凍存處理后，骨膜成為一個可供吸收的生物膜，主要保存了膠原成分，本實驗中采用利于細胞成活的凍存方法，即使同種異體細胞成活較多，仍未誘發顯著細胞免疫應答。C組也未發生預期的明顯免疫反應[19-20]，考慮原因主要是收集的是成年兔長管狀骨髓腔內骨髓（也是通常材料處理時去除的部分），以黃骨髓為主，主要包含BMSCs及脂肪細胞，脂肪細胞相對于造血細胞、血管內皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等[21]免疫原性弱，加之低溫凍存處理，使其未產生更加明顯的促進T細胞活化的作用。IL-6為誘導B細胞活化的重要細胞因子。各組間血清IL-6變化趨勢差異無統計學意義，提示所注射的骨膜、骨髓未誘導明顯的免疫應答；IL-6濃度存在時間變化趨勢，表明同種異體骨關節移植中的排斥反應主要是細胞免疫過程，尤其在反應早期更為明顯，這與文獻報道[22-23]一致。TNF-α主要由活化的單核-巨噬細胞產生，因可誘導腫瘤細胞凋亡而得名，在人體內作為前炎性細胞因子，是啟動炎性反應的關鍵因子，引起白細胞在炎性部位聚集[24]。各組間TNF-α變化趨勢示，A組與C組無顯著性差異，而B組與其余兩組差異顯著，其血清TNF-α濃度升高，說明同種異體骨膜經低溫凍存處理后仍存在一定免疫原性，主要表現為可引起局部非特異性炎性反應。CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值在各組間未見明顯差異，整體存在升高趨勢，但增長并不明顯。提示各組實驗動物的細胞免疫水平處于穩定狀態，外源性異物雖然激活了細胞免疫，但未造成其細胞免疫系統的強烈反應[25]。
綜上述，經低溫凍存處理的骨膜、骨髓總體無顯著免疫原性。考慮到骨膜組織中成骨細胞成分較多，更利于骨愈合，而骨髓中成骨細胞成分較少，建議保留骨膜組織，去除骨髓，徹底沖洗紅骨髓，以降低同種異體關節的免疫原性。
作為初步研究，本研究僅檢測了血清免疫學指標，優點在于可多次重復測量，但缺乏同一時間點大體及組織學觀察結果；同時由于樣本量有限，也存在一定假陰性可能。在進一步研究中，可通過擴大樣本量、分組、分期取材離體觀察等方法，獲得更加詳細的研究數據，以優化同種異體關節的制備方法。
同種異體關節移植用于修復重建創傷、骨軟骨疾病及骨惡性腫瘤術后關節缺損已經歷百余年，應用早期因基礎及臨床研究水平有限效果不佳[1]。20世紀80年代后，隨著低溫凍存技術及免疫抑制藥物的應用，同種異體關節移植取得長足發展，但免疫排斥反應仍是限制其應用的主要因素[2]。關節組織成分復雜，了解不同組織的免疫原性，可指導同種異體關節的制備，以獲得低免疫原性、可長期存活的同種異體關節。本研究采用低溫凍存處理骨膜、骨髓后，將其注入同種異體兔腹腔內，通過檢測血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度和外周靜脈血CD4+ T細胞與CD8+ T細胞比例，以期獲得較為全面的免疫原性數據，為探索同種異體關節合適的制備方法提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡清潔級新西蘭白兔5只作為供體，雌性3只，雄性2只，體重2.6～3.0 kg；6月齡清潔級青紫藍兔18只作為受體，雌雄各半，體重2.1～2.8 kg；均由北京欣綠安實驗動物中心提供。
兔IL-2 ELISA試劑盒、兔IL-6 ELISA試劑盒、兔TNF-α ELISA試劑盒（R&D公司，美國）；FITC標記抗兔CD4抗體、FITC標記抗兔CD8抗體（Antigenix公司，美國）；L-DMEM培養液（GIBCO公司，美國）；FBS（Clark公司，美國）；DMSO（北京優博奧生物科技有限公司）。
紅細胞裂解液配制：去離子水100 mL、NH4Cl 155 mmol（8.219 g）、EDTA 0.1 mmol（0.037 g）、KHCO3 10 mmol（1.012 g）混合后攪拌均勻，調整pH值為7.5，得到10倍濃度紅細胞裂解液100 mL，使用時加入900 mL去離子水定容至1 000 mL。低溫保護劑配制：依據說明書配置DMEM培養液，將DMEM培養液、FBS、DMSO按照7∶2∶1混合[3]。
發光檢測儀（Berthold公司，德國）；離心機（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；FACS Caluber流式細胞儀、Cellquest軟件（BD公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 供體處理
取5只新西蘭白兔，耳緣靜脈注射空氣處死。取雙側膝關節正中切口，分離皮下組織，暴露膝關節及周圍肌肉，自前內側切開并剝離肌肉組織，暴露股骨及脛骨，用線鋸由膝關節上、下端各約2 cm處截骨，取出膝關節。取關節上存留骨膜，紗布過濾、生理鹽水漂洗，漂洗液經0.22 μm過濾器過濾，收集所有骨膜備用；沖洗髓腔，取出骨髓，同法過濾后備用。將收集的骨膜及骨髓分別用低溫保護劑浸泡30 min，置入無菌廣口瓶內，4℃冰箱冷平衡30 min；以1℃/ min速率降至- 20℃，平衡2 h；以1℃/min速率降至- 80℃，平衡1 d后液氮凍存。1個月后取出骨膜、 骨髓組織，無菌條件下37℃水浴復溫2 min，解凍后室溫下生理鹽水漂洗5 min，過濾器收集組織。將骨膜剪碎，放入無菌研磨皿中研磨，稱重；取6 g組織，加入生理鹽水至12 mL，配制成0.5 g/mL懸濁液，分裝至6只 2 mL 無菌注射器備用。同法制備骨髓懸濁液。
1.2.2 受體處理
取18只青紫藍兔隨機分成A、B、C 3組（n=6），分別于兔中下腹旁中線2 cm處注射2 mL生理鹽水、骨膜懸濁液、骨髓懸濁液。注射器穿透腹壁時有突破感，回抽無異物后緩慢注射，觀察注射部位無出血。注射完畢后將兔放回飼養籠內，自由活動。
1.3 檢測指標
1.3.1 血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度檢測
分別于注射前及注射后1、2周耳緣靜脈取血4 mL，靜置20 min，以485 × g離心20 min，取上清，- 20℃恒溫凍存，統一送檢。按兔IL-2、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明書方法檢測血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度。
1.3.2 T細胞亞群測定
分別于注射前及注射后1、2 周耳緣靜脈取血4 mL，EDTA抗凝，4℃冰水浴中檢測T細胞亞群。取2 mL靜脈血，盛入離心管中，加入紅細胞裂解液，混勻，靜置5 min。以485 × g離心5 min。棄上清，PBS緩沖液沖洗2次，再加入適量PBS緩沖液，將細胞吹吸均勻（重懸）。顯微鏡下計數細胞，調整細胞混懸液濃度至1 ×107 個 / mL。取細胞混懸液100 μL，加入1 μL FITC標記抗體（CD4或CD8），4℃下靜置染色30 min。以不加FITC標記抗體的細胞混懸液作為陰性對照。同上法離心并重懸至400 mL，轉移至流式管內上機檢測。采用Cellquest軟件計數染色細胞數，分別得到CD4+ T細胞及CD8+ T細胞占有核細胞的百分比，再計算CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值。
1.4 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，采用重復測量方差分析，球形檢驗水準P=0.05，當P＜ 0.05時，認為重復測量數據之間存在相關性，采用Greenhouse-Geisser校正結果。
2 結果
2.1 血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度檢測
IL-2：球形檢驗P=0.039，不符合球形數據，采用Greenhouse-Geisser校正結果：采用時間為單一因素考慮時，F=1.492，P=0.241，說明IL-2濃度無時間變化趨勢；時間和組別交互作用分析結果顯示，F=1.726，P=0.192，說明時間因素的作用不隨分組變化而發生變化；組間比較結果，F=3.552，P=0.055，說明各組間血清IL-2濃度變化差異無統計學意義。見表 1。
表1
各組各時間點血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度及CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值測定（n=6，IL-6：球形檢驗P=0.004，不符合球形數據，采用Greenhouse-Geisser校正結果：采用時間為單一因素考慮時，F=4.422，P=0.040，說明IL-6濃度變化存在時間變化趨勢，注射后1周各組均值下降，2周時A、B組略回升；時間和組別交互作用分析結果顯示，F=0.670，P=0.561，說明時間因素的作用不隨分組變化而變化；組間比較結果，F=1.106，P=0.357，說明各組間血清IL-6濃度變化差異無統計學意義。見表 1。
TNF-α：球形檢驗P=0.338，符合球形數據，采用單變量方差分析結果：采用時間為單一因素考慮時，F=0.078，P=0.925，說明TNF-α濃度無時間變化趨勢；時間和組別交互作用分析結果顯示，F=1.343，P=0.277，說明時間因素的作用不隨分組變化而變化；組間比較結果顯示，F=5.381，P=0.017，說明各組間血清TNF-α變化差異有統計學意義，兩兩比較采用LSD法，結果顯示B組顯著高于A、C組（P＜ 0.05），A、C組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1。
2.2 CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值測定
球形檢驗P=0.013，不符合球形數據，采用Greenhouse-Geisser校正結果：采用時間為單一因素考慮時，F=1.471，P=0.248，說明CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值無時間變化趨勢；時間與組別交互作用分析結果顯示，F=1.987，P=0.151，說明時間因素的作用不隨分組變化而發生變化；組間比較結果顯示，F=0.450，P=0.646，說明各組間CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值差異無統計學意義。見表 1。
3 討論
同種異體關節因具有供體來源廣泛、大小形狀不受限制、有生物活性、與受體部位能產生生物結合等優點，經過多年發展與完善，成為修復嚴重關節缺損的可行技術，并取得一定療效[4-5]。低溫凍存技術的發展在提高軟骨細胞成活率基礎上，降低了同種異體材料的免疫原性，使移植后材料更易成活[6-8]。關節周圍組織成分主要包括骨骼、韌帶、骨膜、骨髓、纖維囊、滑膜等，其中同種異體骨、肌腱移植已廣泛應用于臨床，其免疫原性也得到比較充分的認識。滑膜及纖維囊結構多位于關節腔內，剔除操作需切開關節，會損傷關節囊及周圍軟組織，在小關節移植中影響關節穩定[9]，因而制備過程中難以剔除，故未納入研究。目前，針對低溫凍存后同種異體骨膜及骨髓的免疫原性研究較少。通過確定同種異體骨膜、骨髓免疫原性強度，可明確高免疫原性的軟組織成分，改進制備過程，以獲得低免疫原性、易于成活的同種異體關節。為此，我們進行了本次研究。
青紫藍兔和新西蘭白兔屬于哺乳綱、兔形目、兔科、真兔屬、家兔下的兩個不同品系，采用不同品系作為供體與受體，可避免因近親造成的同種異體移植免疫排斥反應較弱的問題[10]。骨膜、骨髓凍存采用的低溫保護劑浸泡、程序降溫方法，利于保存細胞的生物活性，并降低移植物的免疫原性，便于存儲和運輸，是目前成熟并廣泛采用的同種異體移植材料處理方法[11-12]。通過腹腔注射組織懸濁液制作動物模型，可分別針對骨膜、骨髓進行研究，便于探索單一成分的免疫原性特點，并可統一注射劑量，增強各組數據間的可比性。采用靜脈血IL-2、IL-6、TNF-α濃度及T細胞亞群作為檢測指標，對受體損傷小，進而對兔免疫系統干擾小，利于對同一實驗個體進行多次重復測量，達到動態觀測指標變化的目的。
同種異體移植免疫排斥反應的靶抗原主要是共顯性表達于移植物細胞表面的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子，其基因位于第6號染色體。免疫排斥反應的本質是T細胞介導的免疫應答過程。同種異體移植免疫排斥反應效應機制主要包括：① CD4+ T細胞（Th細胞）活化和巨噬細胞動員，引起遲發型超敏反應；② CD8+ T細胞的直接殺傷作用；③ 抗原抗體復合物形成，激活補體系統，損害移植物血管。當移植物植入受體體內后，通過直接和間接途徑刺激CD4+ T細胞，產生多種細胞因子，成為Th0細胞，Th0細胞在不同細胞因子作用下向Th1和Th2細胞分化。Th1細胞主要分泌IL-2、INF-g等細胞因子，促進細胞毒性T細胞和遲發型超敏反應T細胞成熟，促進細胞介導的免疫應答。而IL-1、IL-2又對淋巴細胞進行自分泌或旁分泌調節，與抗原的特異性刺激一起，共同激活T細胞，從而介導移植物的排斥反應。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，促進B細胞成熟及抗體生成，其中IL-6主要刺激B細胞產生IgG抗體，增強抗體介導的免疫應答。CD4+ T細胞識別MHCⅡ類分子，主要是Th細胞，誘導免疫應答；CD8+ T細胞識別MHCⅠ類分子，主要為細胞毒性T細胞和抑制T細胞，對同種異體細胞造成直接殺傷，并可下調免疫應答水平。CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值的變化反映了家兔細胞免疫系統的穩定水平及細胞免疫的強度[13-14]。對于初次進入體內的同種異體組織，急性免疫排斥反應一般發生在植入后10～13 d，且在2～3周達峰值，采集該時間段的數據可以比較敏感反映急性免疫排斥反應[15-17]。
本研究中，IL-2檢測結果顯示B、C組注射后1周血清IL-2水平均有所升高，C組于2周時降至注射前水平，但與A組比較差異無統計學意義，說明經低溫冷凍處理后，骨膜、骨髓未引起明顯特異性細胞免疫應答，這與文獻報道結果一致[18]。因為經低溫凍存處理后，骨膜成為一個可供吸收的生物膜，主要保存了膠原成分，本實驗中采用利于細胞成活的凍存方法，即使同種異體細胞成活較多，仍未誘發顯著細胞免疫應答。C組也未發生預期的明顯免疫反應[19-20]，考慮原因主要是收集的是成年兔長管狀骨髓腔內骨髓（也是通常材料處理時去除的部分），以黃骨髓為主，主要包含BMSCs及脂肪細胞，脂肪細胞相對于造血細胞、血管內皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等[21]免疫原性弱，加之低溫凍存處理，使其未產生更加明顯的促進T細胞活化的作用。IL-6為誘導B細胞活化的重要細胞因子。各組間血清IL-6變化趨勢差異無統計學意義，提示所注射的骨膜、骨髓未誘導明顯的免疫應答；IL-6濃度存在時間變化趨勢，表明同種異體骨關節移植中的排斥反應主要是細胞免疫過程，尤其在反應早期更為明顯，這與文獻報道[22-23]一致。TNF-α主要由活化的單核-巨噬細胞產生，因可誘導腫瘤細胞凋亡而得名，在人體內作為前炎性細胞因子，是啟動炎性反應的關鍵因子，引起白細胞在炎性部位聚集[24]。各組間TNF-α變化趨勢示，A組與C組無顯著性差異，而B組與其余兩組差異顯著，其血清TNF-α濃度升高，說明同種異體骨膜經低溫凍存處理后仍存在一定免疫原性，主要表現為可引起局部非特異性炎性反應。CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值在各組間未見明顯差異，整體存在升高趨勢，但增長并不明顯。提示各組實驗動物的細胞免疫水平處于穩定狀態，外源性異物雖然激活了細胞免疫，但未造成其細胞免疫系統的強烈反應[25]。
綜上述，經低溫凍存處理的骨膜、骨髓總體無顯著免疫原性。考慮到骨膜組織中成骨細胞成分較多，更利于骨愈合，而骨髓中成骨細胞成分較少，建議保留骨膜組織，去除骨髓，徹底沖洗紅骨髓，以降低同種異體關節的免疫原性。
作為初步研究，本研究僅檢測了血清免疫學指標，優點在于可多次重復測量，但缺乏同一時間點大體及組織學觀察結果；同時由于樣本量有限，也存在一定假陰性可能。在進一步研究中，可通過擴大樣本量、分組、分期取材離體觀察等方法，獲得更加詳細的研究數據，以優化同種異體關節的制備方法。
