引用本文： 張復文, 劉德寶, 王剛, 任振華. 微骨折技術聯合IGF-1修復兔關節軟骨缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(5): 591-596. doi: 10.7507/1002-1892.20140132 復制
關節軟骨缺損是膝關節常見損傷類型，因軟骨愈合能力有限，難以自行修復[1]。傳統的理療、藥物治療和外科手術均不能實現關節軟骨修復，因此關節軟骨缺損修復成為近年研究熱點[2]。微骨折技術是在骨面鉆孔使含有MSCs的骨髓血滲出修復軟骨，目前已廣泛用于治療膝、髖、肘及肩關節等軟骨缺損修復[3-5]。但由于新生成的是纖維軟骨而非透明軟骨，該技術也不能完全修復損傷軟骨[6]。有研究表明，生長因子在軟骨缺損修復中發揮了重要作用[7-9]，其中IGF-1參與了軟骨細胞的增殖和分化。為此，本研究采用微骨折技術聯合IGF-1修復兔股骨髁全層創傷性關節軟骨缺損，觀察修復效果，以期為臨床關節軟骨缺損修復提供一種新方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 月齡健康新西蘭大白兔26只，體重2.5～ 3.5 kg，雌雄不限，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。重組人IGF-1（recombinant human IGF-1，rhIGF-1）、鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體（Roche 公司，美國）；鼠/兔通用型SP免疫組織化學檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；羥脯氨酸（hydroxyproline，HPR；上海泛美生物技術有限公司）。透射電鏡、掃描電鏡（日本電子株氏會社）。
1.2 實驗分組及方法
取24只大白兔隨機分為4組（n=6）：微骨折技術聯合rhIGF-1組（A 組）、微骨折技術對照組（B 組）、rhIGF-1對照組（C 組）和空白對照組（D 組）。各組大白兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，于雙后肢膝關節內側作長約3 cm切口，選擇髕股關節股骨側關節面中心，用手術刀片制備8 mm × 6 mm全層關節軟骨缺損，深度以點狀出血為標準（圖 1 a）。 關節軟骨缺損模型制備后，A、B 組用1 mm 克氏針在軟骨缺損區鉆孔，造成軟骨下微骨折，橫向3 孔、縱向5 孔，孔間距基本相等，深度以有骨髓血滲出為標準（約0.7 cm），關閉切口（圖 1 b）。C、D組不作處理，直接拉攏縫合切口。術后各組動物均單籠飼養，活動不限，常規預防性應用抗生素。A、C 組術后每側關節腔內注射0.1 mL rhIGF-1（0.01 μg/μL），每周3次，連續4周；B、D 組對應時間點關節腔內注射等量生理鹽水。
圖1
動物模型制備示意圖 ? 關節軟骨缺損（箭頭） ? 微骨折手術箭頭示鉆孔 ? ?術后4、12、24 周，各組各取2只動物采用空氣栓塞法處死，原切口入路取材進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察實驗動物術后存活、手術切口愈合及后肢活動情況。
1.3.2 大體觀察
各時間點觀察膝關節有無攣縮、粘連和新生物，有無滑液增多、軟骨侵蝕、軟骨贅或骨贅等關節病變，以及修復組織的平整性、光澤度、厚度及其與周圍組織的結合情況。
1.3.3 組織學觀察
各時間點取修復組織，置于10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，0.4 μm厚切片，常規行HE 染色、甲苯胺藍染色、番紅 O染色和Van Gieson染色。光鏡下觀察軟骨細胞形態和排列情況，以及細胞外基質蛋白多糖和膠原生成情況。綜合以上染色結果，按照Wakitani 等[10]評分標準進行組織學評分。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
取1.3.3中制備的各組術后24周石蠟切片，脫蠟水化，微波修復，H2O2阻斷，羊血清封閉，加入一抗（鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體），4℃過夜，加入二抗（鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液），DAB 顯色，脫水透明，樹膠封片。光鏡下觀察修復組織中的Ⅱ型膠原染色情況。
1.3.5 電鏡觀察
術后24 周，取A、B 組修復組織，切成1 mm × 1 mm × 1 mm的小塊，加入1.5%多聚甲醛-戊二醛混合液，4℃下固定6 h，PBS浸泡3 h × 3 次，梯度乙醇脫水，環氧丙烷和環氧樹脂包埋，置于烤箱60℃48 h，70 nm厚超薄切片，5%醋酸雙氧鈾染色5 min，雙蒸水沖洗，枸櫞酸鉛染色5 min，雙蒸水沖洗。透射電鏡下觀察軟骨細胞的超微結構及細胞外膠原分泌情況。
取A、B 組修復組織，切成2 mm × 1 mm × 1 mm的小塊，加入1.5%多聚甲醛-戊二醛混合液，4℃下固定6 h，PBS沖洗3次，凍干脫水，鍍導電膜，掃描電鏡觀察其軟骨面平整性及軟骨陷窩分布情況。
1.3.6 膠原含量測定
術后24周，采用改良HPR法測定各組修復組織和正常兔后肢膝關節軟骨的膠原含量。取各組修復組織和剩余2只正常兔后肢膝關節軟骨切成0.4 μm薄片，按順序加入丙酮和乙醚脫脂。剪碎軟骨，置于50℃恒溫箱中干燥4 h，用三氯醋酸提取膠原，提取液置于烤箱中120℃蒸干，加入6 mol/L HCl溶液，充分溶解后，120℃水浴中10 h，加蒸餾水振蕩稀釋，配成待測樣品。參照文獻[11]方法測定HPR：取待測樣品1 mL，氧化顯色，調節波長至560 nm，測量吸光度（A）值。以HPR 標準品作標準曲線，按以下公式計算膠原含量，膠原含量百分比=樣品HPR濃度/組織質量（g）× 7.46 ×100%；樣品HPR濃度=標準HPR濃度×所測樣品A值/標準HPR濃度A值。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成，切口愈合良好。術后24 h，各組動物一般狀態較差，后肢無活動，少量進食、飲水；2 d，各組動物活動較前增加，飲水、進食已基本接近正常，后肢活動受限；4周，A組動物后肢活動基本恢復正常，B、C、D組仍有一定程度受限；A、B組動物12周時后肢活動已基本正常，但C、D組部分動物24周時后肢活動仍受限。
2.2 大體觀察
術后各時間點各組動物膝關節均無攣縮、粘連和新生物，無滑液增多、滑膜肥厚、軟骨侵蝕及軟骨贅、骨贅形成等骨關節病變。
術后4周，各組軟骨區均有不同程度白色修復組織生成。A 組修復組織大部分區域表面較平整，有光澤及彈性，但未達正常軟骨厚度，與正常軟骨界線模糊；B 組修復組織部分區域較平整，有一定光澤，但厚度及彈性較A組差，可見與正常軟骨界線；C、D 組修復組織均不平整，無光澤，與正常軟骨界線清晰。
術后12周，A 組修復組織平整，有光澤，已完全充填缺損區，與正常軟骨界線消失；B 組修復組織部分區域平整，有光澤，厚度較鄰近正常軟骨組織薄，彈性差，與正常軟骨界線模糊；C、D 組修復組織不平整，呈白色，無光澤，無明顯彈性，與正常軟骨界線清晰。
術后24周，A 組觀察情況與12周時一致；B組修復組織較平整，部分有光澤，呈白色，有彈性，與正常軟骨界線模糊；C、D 組修復組織不平整，呈白色，無光澤，彈性差，修復組織未填滿缺損區，與正常軟骨界線清晰。見圖 2。
2.3 組織學觀察
2.3.1 鏡下觀察
術后4周，A 組見大量圓形、橢圓形細胞及類軟骨細胞；B 組見少量橢圓形細胞，大量小梭形細胞，細胞核深染；C、D 組均為無序纖維組織。
術后12、24周，A 組見軟骨細胞增生明顯，位于陷窩，分化良好，排列較規則，其形態、分化排列與正常軟骨細胞難以區分；基質較多，修復的軟骨形態與正常關節軟骨形態相似，與周圍軟骨結合緊密；修復組織含有大量基質和膠原纖維。B 組見大量梭形纖維細胞，并含有較多橢圓形類軟骨細胞；與A 組相比，基質染色程度淺，膠原和蛋白多糖少。C、D 組為無序纖維組織，見少許小梭形纖維細胞，基質染色淺。見圖 3～6。
圖5
術后24周各組番紅O染色觀察（× 400） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?2.3.2 組織學評分
按照Wakitani 等[10]評分標準，術后各時間點A組組織學評分明顯優于其他各組，B組優于C、D組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。各組組內12、24周組織學評分均優于4周，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；A、B組24周評分優于12周，差異有統計學意義（P＜ 0.05），C、D組12、24周比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組組織學評分比較（n=4，2.4 免疫組織化學染色觀察
術后24周，A組見大量Ⅱ型膠原強陽性染色，B 組僅有少量Ⅱ型膠原陽性染色，C、D 組Ⅱ型膠原染色呈陰性。見圖 7。
2.5 電鏡觀察
術后24 周，透射電鏡觀察示A 組軟骨細胞位于陷窩內，細胞核均呈圓形，核染色質分布均一，有大量粗面內質網均勻分布，并呈擴張狀，細胞質內含有糖原顆粒，游離核糖體豐富，高爾基復合體較發達，線粒體數量眾多，軟骨細胞周圍可見細小的膠原纖維；B 組以幼稚軟骨細胞為主，僅見少量成熟軟骨細胞。見圖 8。
掃描電鏡觀察示，A 組修復組織軟骨面平整，軟骨陷窩分布均勻，并有較豐富的細小膠原纖維；B組修復組織軟骨面不平整，軟骨陷窩數量較少，分布不均勻。見圖 9。
2.6 膠原含量測定
術后24 周，A、B、C、D組修復組織膠原含量分別為48.52% ± 2.83%、41.52% ± 3.78%、36.52% ± 2.65%及37.52% ± 4.54%，均低于正常軟骨組織的51.21% ± 0.39%，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；但A 組膠原含量明顯高于其余各組，B組高于C、D組，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）。C、D組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）
3 討論
研究顯示，骨髓基質細胞中含有少許具有多向分化潛能的BMSCs，可定向誘導分化成骨或成軟骨[12]，當骨與軟骨損傷后其周圍環境誘導干細胞定向分化，修復損傷組織。關節軟骨部分缺損或全層缺損直徑＞ 4 mm 時不能自行愈合[13]；直徑＜ 4 mm的全層軟骨損傷以纖維軟骨修復為主，可能是因軟骨損傷后，軟骨下骨板仍存在，影響了BMSCs向缺損處集中[14]。Shapiro 等[15]應用放射自顯影方法證實，對于累及軟骨下骨的軟骨缺損，其周圍軟骨細胞不參與細胞再生，修復組織主要來源于髓腔內的基質細胞。之后Steadman 等[16]提出了微骨折技術，通過在軟骨下骨板打孔，使骨髓基質細胞參與軟骨修復。關節腔的缺氧環境和滑液中的各種活性因子促使骨髓基質細胞向軟骨細胞方向分化，而缺損底部鄰近髓腔較高的氧分壓又促使骨髓基質細胞向成骨細胞轉化，形成骨小梁，以利于修復組織與鄰近組織的結合。本研究結果顯示，與單純軟骨缺損的C、D組比較，微骨折術后A、B組修復組織表面較平整，有光澤，與鄰近正常軟骨無明顯區別，提示軟骨缺損后采用微骨折技術治療能提高軟骨組織的修復質量。
但隨著微骨折技術的廣泛開展，也出現了一系列問題。研究顯示，對于老年、肥胖以及軟骨缺損直徑＞ 2.5 cm的患者，微骨折技術治療效果較差[17]。此外，微骨折技術不能完全修復軟骨損傷，新生成的是纖維軟骨而非正常透明軟骨，術后隨著纖維軟骨磨損，關節疼痛、活動受限等臨床癥狀會復發，患者需再次接受關節軟骨修復術。因此，在微骨折技術基礎上尋找改進方案，以獲得更好療效成為學者們研究熱點。
IGF-1由骨、軟骨等多種組織分泌，對多種細胞具有促增殖作用，也是軟骨合成代謝的主要因子[18-19]。研究顯示，軟骨組織受損后會刺激軟骨細胞分泌IGF-1[20] ，軟骨缺損自然修復過程中伴隨著IGF-1基因表達增強[21]。IGF-1不僅能刺激軟骨細胞增殖，也能促進蛋白多糖及Ⅱ型膠原合成[22]。本研究結果顯示，A組通過微骨折技術聯合關節腔內注射rhIGF-1治療后，軟骨缺損區修復組織與鄰近正常軟骨無明顯區別；組織學及免疫組織化學染色示修復組織的軟骨細胞均位于陷窩中，其形態、分化、排列與正常軟骨細胞相似，且軟骨細胞間基質較多，含有大量膠原纖維；組織學評分及修復組織膠原含量均顯著高于其他各組。B組單純微骨折技術治療后，修復組織為不成熟的類透明軟骨，細胞間基質較Ａ組少。表明采用微骨折技術聯合IGF-1修復后，軟骨組織更成熟，蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量明顯增加。
綜上述，微骨折技術聯合關節腔內注射IGF-1具有協同作用，能顯著促進兔關節軟骨缺損修復。但將其應用于臨床仍需進一步研究，包括IGF-1注射劑量、注射次數等。
關節軟骨缺損是膝關節常見損傷類型，因軟骨愈合能力有限，難以自行修復[1]。傳統的理療、藥物治療和外科手術均不能實現關節軟骨修復，因此關節軟骨缺損修復成為近年研究熱點[2]。微骨折技術是在骨面鉆孔使含有MSCs的骨髓血滲出修復軟骨，目前已廣泛用于治療膝、髖、肘及肩關節等軟骨缺損修復[3-5]。但由于新生成的是纖維軟骨而非透明軟骨，該技術也不能完全修復損傷軟骨[6]。有研究表明，生長因子在軟骨缺損修復中發揮了重要作用[7-9]，其中IGF-1參與了軟骨細胞的增殖和分化。為此，本研究采用微骨折技術聯合IGF-1修復兔股骨髁全層創傷性關節軟骨缺損，觀察修復效果，以期為臨床關節軟骨缺損修復提供一種新方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 月齡健康新西蘭大白兔26只，體重2.5～ 3.5 kg，雌雄不限，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。重組人IGF-1（recombinant human IGF-1，rhIGF-1）、鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體（Roche 公司，美國）；鼠/兔通用型SP免疫組織化學檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；羥脯氨酸（hydroxyproline，HPR；上海泛美生物技術有限公司）。透射電鏡、掃描電鏡（日本電子株氏會社）。
1.2 實驗分組及方法
取24只大白兔隨機分為4組（n=6）：微骨折技術聯合rhIGF-1組（A 組）、微骨折技術對照組（B 組）、rhIGF-1對照組（C 組）和空白對照組（D 組）。各組大白兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，于雙后肢膝關節內側作長約3 cm切口，選擇髕股關節股骨側關節面中心，用手術刀片制備8 mm × 6 mm全層關節軟骨缺損，深度以點狀出血為標準（圖 1 a）。 關節軟骨缺損模型制備后，A、B 組用1 mm 克氏針在軟骨缺損區鉆孔，造成軟骨下微骨折，橫向3 孔、縱向5 孔，孔間距基本相等，深度以有骨髓血滲出為標準（約0.7 cm），關閉切口（圖 1 b）。C、D組不作處理，直接拉攏縫合切口。術后各組動物均單籠飼養，活動不限，常規預防性應用抗生素。A、C 組術后每側關節腔內注射0.1 mL rhIGF-1（0.01 μg/μL），每周3次，連續4周；B、D 組對應時間點關節腔內注射等量生理鹽水。
圖1
動物模型制備示意圖 ? 關節軟骨缺損（箭頭） ? 微骨折手術箭頭示鉆孔 ? ?術后4、12、24 周，各組各取2只動物采用空氣栓塞法處死，原切口入路取材進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察實驗動物術后存活、手術切口愈合及后肢活動情況。
1.3.2 大體觀察
各時間點觀察膝關節有無攣縮、粘連和新生物，有無滑液增多、軟骨侵蝕、軟骨贅或骨贅等關節病變，以及修復組織的平整性、光澤度、厚度及其與周圍組織的結合情況。
1.3.3 組織學觀察
各時間點取修復組織，置于10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，0.4 μm厚切片，常規行HE 染色、甲苯胺藍染色、番紅 O染色和Van Gieson染色。光鏡下觀察軟骨細胞形態和排列情況，以及細胞外基質蛋白多糖和膠原生成情況。綜合以上染色結果，按照Wakitani 等[10]評分標準進行組織學評分。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
取1.3.3中制備的各組術后24周石蠟切片，脫蠟水化，微波修復，H2O2阻斷，羊血清封閉，加入一抗（鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體），4℃過夜，加入二抗（鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液），DAB 顯色，脫水透明，樹膠封片。光鏡下觀察修復組織中的Ⅱ型膠原染色情況。
1.3.5 電鏡觀察
術后24 周，取A、B 組修復組織，切成1 mm × 1 mm × 1 mm的小塊，加入1.5%多聚甲醛-戊二醛混合液，4℃下固定6 h，PBS浸泡3 h × 3 次，梯度乙醇脫水，環氧丙烷和環氧樹脂包埋，置于烤箱60℃48 h，70 nm厚超薄切片，5%醋酸雙氧鈾染色5 min，雙蒸水沖洗，枸櫞酸鉛染色5 min，雙蒸水沖洗。透射電鏡下觀察軟骨細胞的超微結構及細胞外膠原分泌情況。
取A、B 組修復組織，切成2 mm × 1 mm × 1 mm的小塊，加入1.5%多聚甲醛-戊二醛混合液，4℃下固定6 h，PBS沖洗3次，凍干脫水，鍍導電膜，掃描電鏡觀察其軟骨面平整性及軟骨陷窩分布情況。
1.3.6 膠原含量測定
術后24周，采用改良HPR法測定各組修復組織和正常兔后肢膝關節軟骨的膠原含量。取各組修復組織和剩余2只正常兔后肢膝關節軟骨切成0.4 μm薄片，按順序加入丙酮和乙醚脫脂。剪碎軟骨，置于50℃恒溫箱中干燥4 h，用三氯醋酸提取膠原，提取液置于烤箱中120℃蒸干，加入6 mol/L HCl溶液，充分溶解后，120℃水浴中10 h，加蒸餾水振蕩稀釋，配成待測樣品。參照文獻[11]方法測定HPR：取待測樣品1 mL，氧化顯色，調節波長至560 nm，測量吸光度（A）值。以HPR 標準品作標準曲線，按以下公式計算膠原含量，膠原含量百分比=樣品HPR濃度/組織質量（g）× 7.46 ×100%；樣品HPR濃度=標準HPR濃度×所測樣品A值/標準HPR濃度A值。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成，切口愈合良好。術后24 h，各組動物一般狀態較差，后肢無活動，少量進食、飲水；2 d，各組動物活動較前增加，飲水、進食已基本接近正常，后肢活動受限；4周，A組動物后肢活動基本恢復正常，B、C、D組仍有一定程度受限；A、B組動物12周時后肢活動已基本正常，但C、D組部分動物24周時后肢活動仍受限。
2.2 大體觀察
術后各時間點各組動物膝關節均無攣縮、粘連和新生物，無滑液增多、滑膜肥厚、軟骨侵蝕及軟骨贅、骨贅形成等骨關節病變。
術后4周，各組軟骨區均有不同程度白色修復組織生成。A 組修復組織大部分區域表面較平整，有光澤及彈性，但未達正常軟骨厚度，與正常軟骨界線模糊；B 組修復組織部分區域較平整，有一定光澤，但厚度及彈性較A組差，可見與正常軟骨界線；C、D 組修復組織均不平整，無光澤，與正常軟骨界線清晰。
術后12周，A 組修復組織平整，有光澤，已完全充填缺損區，與正常軟骨界線消失；B 組修復組織部分區域平整，有光澤，厚度較鄰近正常軟骨組織薄，彈性差，與正常軟骨界線模糊；C、D 組修復組織不平整，呈白色，無光澤，無明顯彈性，與正常軟骨界線清晰。
術后24周，A 組觀察情況與12周時一致；B組修復組織較平整，部分有光澤，呈白色，有彈性，與正常軟骨界線模糊；C、D 組修復組織不平整，呈白色，無光澤，彈性差，修復組織未填滿缺損區，與正常軟骨界線清晰。見圖 2。
2.3 組織學觀察
2.3.1 鏡下觀察
術后4周，A 組見大量圓形、橢圓形細胞及類軟骨細胞；B 組見少量橢圓形細胞，大量小梭形細胞，細胞核深染；C、D 組均為無序纖維組織。
術后12、24周，A 組見軟骨細胞增生明顯，位于陷窩，分化良好，排列較規則，其形態、分化排列與正常軟骨細胞難以區分；基質較多，修復的軟骨形態與正常關節軟骨形態相似，與周圍軟骨結合緊密；修復組織含有大量基質和膠原纖維。B 組見大量梭形纖維細胞，并含有較多橢圓形類軟骨細胞；與A 組相比，基質染色程度淺，膠原和蛋白多糖少。C、D 組為無序纖維組織，見少許小梭形纖維細胞，基質染色淺。見圖 3～6。
圖5
術后24周各組番紅O染色觀察（× 400） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?2.3.2 組織學評分
按照Wakitani 等[10]評分標準，術后各時間點A組組織學評分明顯優于其他各組，B組優于C、D組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。各組組內12、24周組織學評分均優于4周，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；A、B組24周評分優于12周，差異有統計學意義（P＜ 0.05），C、D組12、24周比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組組織學評分比較（n=4，2.4 免疫組織化學染色觀察
術后24周，A組見大量Ⅱ型膠原強陽性染色，B 組僅有少量Ⅱ型膠原陽性染色，C、D 組Ⅱ型膠原染色呈陰性。見圖 7。
2.5 電鏡觀察
術后24 周，透射電鏡觀察示A 組軟骨細胞位于陷窩內，細胞核均呈圓形，核染色質分布均一，有大量粗面內質網均勻分布，并呈擴張狀，細胞質內含有糖原顆粒，游離核糖體豐富，高爾基復合體較發達，線粒體數量眾多，軟骨細胞周圍可見細小的膠原纖維；B 組以幼稚軟骨細胞為主，僅見少量成熟軟骨細胞。見圖 8。
掃描電鏡觀察示，A 組修復組織軟骨面平整，軟骨陷窩分布均勻，并有較豐富的細小膠原纖維；B組修復組織軟骨面不平整，軟骨陷窩數量較少，分布不均勻。見圖 9。
2.6 膠原含量測定
術后24 周，A、B、C、D組修復組織膠原含量分別為48.52% ± 2.83%、41.52% ± 3.78%、36.52% ± 2.65%及37.52% ± 4.54%，均低于正常軟骨組織的51.21% ± 0.39%，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；但A 組膠原含量明顯高于其余各組，B組高于C、D組，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）。C、D組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）
3 討論
研究顯示，骨髓基質細胞中含有少許具有多向分化潛能的BMSCs，可定向誘導分化成骨或成軟骨[12]，當骨與軟骨損傷后其周圍環境誘導干細胞定向分化，修復損傷組織。關節軟骨部分缺損或全層缺損直徑＞ 4 mm 時不能自行愈合[13]；直徑＜ 4 mm的全層軟骨損傷以纖維軟骨修復為主，可能是因軟骨損傷后，軟骨下骨板仍存在，影響了BMSCs向缺損處集中[14]。Shapiro 等[15]應用放射自顯影方法證實，對于累及軟骨下骨的軟骨缺損，其周圍軟骨細胞不參與細胞再生，修復組織主要來源于髓腔內的基質細胞。之后Steadman 等[16]提出了微骨折技術，通過在軟骨下骨板打孔，使骨髓基質細胞參與軟骨修復。關節腔的缺氧環境和滑液中的各種活性因子促使骨髓基質細胞向軟骨細胞方向分化，而缺損底部鄰近髓腔較高的氧分壓又促使骨髓基質細胞向成骨細胞轉化，形成骨小梁，以利于修復組織與鄰近組織的結合。本研究結果顯示，與單純軟骨缺損的C、D組比較，微骨折術后A、B組修復組織表面較平整，有光澤，與鄰近正常軟骨無明顯區別，提示軟骨缺損后采用微骨折技術治療能提高軟骨組織的修復質量。
但隨著微骨折技術的廣泛開展，也出現了一系列問題。研究顯示，對于老年、肥胖以及軟骨缺損直徑＞ 2.5 cm的患者，微骨折技術治療效果較差[17]。此外，微骨折技術不能完全修復軟骨損傷，新生成的是纖維軟骨而非正常透明軟骨，術后隨著纖維軟骨磨損，關節疼痛、活動受限等臨床癥狀會復發，患者需再次接受關節軟骨修復術。因此，在微骨折技術基礎上尋找改進方案，以獲得更好療效成為學者們研究熱點。
IGF-1由骨、軟骨等多種組織分泌，對多種細胞具有促增殖作用，也是軟骨合成代謝的主要因子[18-19]。研究顯示，軟骨組織受損后會刺激軟骨細胞分泌IGF-1[20] ，軟骨缺損自然修復過程中伴隨著IGF-1基因表達增強[21]。IGF-1不僅能刺激軟骨細胞增殖，也能促進蛋白多糖及Ⅱ型膠原合成[22]。本研究結果顯示，A組通過微骨折技術聯合關節腔內注射rhIGF-1治療后，軟骨缺損區修復組織與鄰近正常軟骨無明顯區別；組織學及免疫組織化學染色示修復組織的軟骨細胞均位于陷窩中，其形態、分化、排列與正常軟骨細胞相似，且軟骨細胞間基質較多，含有大量膠原纖維；組織學評分及修復組織膠原含量均顯著高于其他各組。B組單純微骨折技術治療后，修復組織為不成熟的類透明軟骨，細胞間基質較Ａ組少。表明采用微骨折技術聯合IGF-1修復后，軟骨組織更成熟，蛋白多糖和Ⅱ型膠原含量明顯增加。
綜上述，微骨折技術聯合關節腔內注射IGF-1具有協同作用，能顯著促進兔關節軟骨缺損修復。但將其應用于臨床仍需進一步研究，包括IGF-1注射劑量、注射次數等。
