引用本文： 曲曉麗, 王敏, 賀健康, 劉亞雄, 周新民, 李滌塵, 靳忠民. 共培養的大塊組織工程肝構建及體內植入研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(3): 325-330. doi: 10.7507/1002-1892.20140073 復制
肝臟移植是治療慢性肝衰竭、肝硬化、肝癌等終末性肝病的常見方法，存在供體緊缺、需長期服用免疫藥物、成活率低等不足[1]，組織工程技術有望解決這些難題。肝臟由多種細胞成分和多種管道系統組成，一般單細胞構建組織技術與傳統生物材料均很難模擬其復雜的結構和功能。
原代肝細胞在一定時間內能保持成熟肝細胞功能，具有高活性與高代謝能力[2]，是目前用于肝組織工程研究的常用種子細胞。但原代肝細胞增殖和生長能力有限，在體外難以長期維持功能表達（如白蛋白和尿素的分泌），往往需要通過促進肝細胞聚團生長[3-5]，或者與其他非實質細胞（如成纖維細胞和內皮細胞）共培養等方式來提高肝細胞的活性和功能[6-8]。大量研究表明，原代肝細胞和成纖維細胞共培養能穩定肝細胞的功能，但多為肝細胞層與成纖維細胞層的共培養，罕見細胞在三維支架中共培養，未實現大塊組織工程肝的體內長期存活[6-8]。因此我們選用SD大鼠肺成纖維細胞和原代肝細胞于三維支架共培養，并同種異體植入肝硬化SD大鼠模型體內，探討共培養的大塊組織工程肝體內長期存活機制，以期為臨床構建可長期存活并具有功能的組織工程肝奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
5～6周齡健康雄性SD大鼠4只，體重150～ 180 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供；標準飼料，自由飲食，室溫18～25℃飼養，術前8 h禁食，2 h禁水。原代SD大鼠肺成纖維細胞購于武漢原生原代生物醫藥科技有限公司，細胞狀態良好時呈扁平或細長狀，取第3～5代細胞用于實驗。
膠原溶液制備方法：參照文獻[9]方法并結合西安交通大學機械系統工程國家重點實驗室條件制備。取健康雄性SD大鼠鼠尾，乙醇浸泡后抽出白色肌腱溶于0.1%有菌醋酸溶液，攪拌后4℃以9 840 × g離心2 h后棄沉淀，凍干后得到膠原泡沫。將膠原泡沫用0.1%有菌醋酸溶液攪拌溶解至14 mg/mL，置于透析袋中。先后用0.1%有菌醋酸溶液、1%有菌氯仿溶液各透析1 h，然后用0.1%無菌醋酸溶液透析7 d，得到無菌膠原溶液。取5 mL膠原溶液烘干后稱取膠原薄膜質量，除以5 mL即獲得膠原溶液濃度，用0.1%無菌醋酸溶液調整膠原溶液濃度，得到12 mg/ mL膠原溶液置于無菌容器中，4℃保 存。
前灌注液：NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，KCl 0.40 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.078 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.151 g/L，HEPES（WOLSEN公司，美國）2.38 g/L，葡萄糖 1.0 g/L。膠原酶灌注液：NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，KCl 0.40 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.078 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.151 g/L，CaCl2 0.56 g/L，Ⅳ型膠原酶（Sigma公司，美國）0.5 g/ L，2.38 g/L HEPES。肝細胞洗滌液：以Williams’ E培養基（Sigma公司，美國）為基底，加入2.2 g/L NaHCO3、2.38 g/L HEPES 和1%雙抗（青、鏈霉素）溶液。肝細胞培養液：以Williams’ E培養基為基底，加入10%FBS（HyClone公司，美國）、2.2 g/L NaHCO3、500 U/L牛胰島素（Sigma公司，美國）、500 μg/L地塞米松和1%雙抗溶液。SD大鼠肺成纖維細胞培養液：以H-DMEM為基底，加入10%FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）和1%雙抗溶液。白蛋白ELISA試劑盒（R&D公司，美國）；尿素氮試劑盒（南京建成生物工程研究所）。
外科顯微手術器械（上海醫療器械設備廠）；77202-50蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；CO2恒溫培養箱（ThermoFisher公司，美國）；HC-3018R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡Ti-S（Nikon公司，日本）；真空冷凍干燥機VFD2000（北京博醫康實驗儀器有限公司）；真空澆鑄成型機（西安交通大學快速成型中心）；Pro/ENGINEER Wildfire 5軟件（PTC公司，美國）。
1.2 大鼠原代肝細胞分離培養
取4只雄性SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.3 mL麻醉后，四肢固定，腹部大“十”字切開。游離肝門靜脈，留置針插管，近端結扎固定插管。先以37℃預熱的前灌注液以25 mL/min流速原位灌注肝臟，直至呈現米黃色；切除肝臟后，用膠原酶灌注液以10 mL/ min流速循環灌注消化肝臟，直至肝臟變軟、腫脹，出現大理石樣紋理后停止。將肝臟置于4℃預冷的肝細胞洗滌液中，撕破肝包膜，抖落肝細胞，經200目篩網過濾后洗滌3次，用4℃肝細胞培養液重懸。行錐蟲藍染色，倒置相差顯微鏡觀察示細胞成活率＞ 85%。見圖 1。
圖1
倒置相差顯微鏡下原代肝細胞觀察（錐蟲藍染色× 10） 箭頭示死細胞 ? ?1.3 共培養的膠原水凝膠人工肝組織構建及體外培養
1.3.1 硅膠模具制備
使用Pro/ENGINEER Wildfire 5軟件繪制用于制造硅膠模具的模型，每個小方塊邊長10 mm、厚2 mm。將設計完成后的STL文件交由西安交通大學國家科學技術園恒通公司，使用SPS 450型光固化快速成型機完成樹脂模具的3-D打印。將樹脂模具清洗干凈后進行硅膠模具的澆鑄。稱重約100 g硅膠和1.5%（質量比）的固化劑；將樹脂模具卡入有機玻璃制造的套殼中，將混入了固化劑的硅膠導入其中，并在真空澆鑄成型機中抽真空約3 min；完成后平置24 h，剝下硅膠模具（圖 2）。
1.3.2 膠原水凝膠人工肝組織構建
實驗分為兩組，A組為單純原代肝細胞（密度為5 ×106個/ mL），B組為原代肝細胞和成纖維細胞共培養（比例為1∶0.4）[10]，原代肝細胞密度與A組相同。預先將硅膠模具和20 mL小燒杯分別在醫用乙醇中浸泡過夜。將20 mL小燒杯置于超凈臺的冰袋上預先降溫；向小燒杯中加入10 × DMEM培養基和適量NaOH溶液，調整pH值至7.8左右，然后加入12 mg/mL膠原溶液，逐滴加入NaOH溶液晃動，調節pH值至中性；分別倒入兩組細胞懸液，調節pH值至7.4；其中膠原溶液∶細胞懸液∶10 × DMEM比例為5∶4∶1；以上操作均在冰袋上進行，保持溫度為0℃。每個硅膠模具中加入200 μL上述混合液，水凝膠支架尺寸為1 cm × 1 cm × 2 mm，然后室溫下成膠（圖 3）；2 h后成膠脫模，置于24孔板中，每孔加入1 mL肝細胞培養液，每天換 液。
1.3.3 觀測指標
① 肝細胞形態觀察：于3、7、14、21 d于倒置相差顯微鏡下觀察兩組肝細胞形態。② 肝功能檢測：以1、3、7、11、14、21 d為檢測時間點，于檢測前1天更換無血清肝細胞培養液培養。各時間點吸取培養上清液，以556 × g離心5 min后，取上清，分別采用大鼠白蛋白ELISA試劑盒檢測白蛋白分泌量，尿素氮試劑盒檢測尿素分泌量。
1.4 動物體內植入實驗
肝硬化大鼠模型制備由第四軍醫大學西京消化病醫院完成。取24只SPF級雌性SD大鼠（體重200～250 g），按500 mg/（kg·d）劑量腹部皮下注射含50%四氯化碳的橄欖油溶液，每周2次，同時每周按1 mL/100 g劑量灌服30%乙醇溶液2次，持續12周后采血測定肝功能，并行肝臟切片，確定肝硬化模型建立成功。分別于肝硬化大鼠腹腔大網膜包裹1片1.3.2中兩組共培養1 d的膠原水凝膠人工肝組織，將肝臟翻起放入近脾門部位（n=12）。分別于植入后3、7、14、28 d處死兩組大鼠各3只，收集植入的膠原水凝膠人工肝組織，置于甲醛固定，常規石蠟包埋，切片，行 HE染色、細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）染色和ALB染色。
1.5 統計學方法
采用SPSS統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用two-way ANOVA檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 肝細胞形態觀察
共培養3 d，B組肝細胞開始呈現2～3個聚團生長；而A組肝細胞無明顯聚團現象。7 d，兩組肝細胞聚團生長較3 d時明顯，B組多于A組，有多細胞聚團出現，細胞呈透亮的多邊形，細胞核清晰可見。14 d，兩組水凝膠中開始出現細胞碎片，細胞邊緣不平整，A組較B組更突出。21 d，水凝膠中碎片增多，細胞邊緣不平整，兩組間無明顯差異。見圖 4。
2.2 肝功能檢測
A組白蛋白分泌量僅于共培養3 d內呈上升趨勢，之后均急劇下降；B組白蛋白分泌量于共培養3 d內明顯少于A組，前7 d內呈上升趨勢，并于7 d時高于A組且達峰值，之后急劇下降，但仍高于A組。各時間點兩組白蛋白分泌量比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。B組尿素分泌量與A組比較，培養1、3 d時差異無統計學意義（P＞ 0.05）；3 d后開始高于A組，兩組均于7 d時達峰值，之后逐漸下降，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。
2.3 動物體內植入實驗
2.3.1 HE染色
植入后3 d，A組肝細胞呈多面體，核大而圓且居中，部分有雙核或多核，核仁明顯，核膜清楚，肝細胞在水凝膠支架中生長狀況良好，部分細胞間出現連接，只有少量炎性細胞附著于水凝膠表面，中心尚無炎性細胞浸潤，對細胞狀態影響小；7 d時開始出現凋亡無核的細胞，細胞邊緣模糊；14 d時肝細胞結構尚完整，但逐漸有凋亡趨勢，核膜、核仁破碎，核膜色不清，水凝膠中心也出現少量炎性細胞浸潤；28 d時未見肝細胞。植入后3、7、14 d時，B組肝細胞生長狀況良好并有聚集或排列生長表現，偶見炎性細胞浸潤；28 d時細胞生長狀態尚可，呈多邊形，細胞核清晰可見，部分為多核，但密度明顯減少。見圖 6。
圖6
植入后兩組HE染色觀察（× 20） ? A組3 d ? B組3 d ? A組7 d ? B組7 d ? A組14 d ? B組14 d ? A組28 d ? B組28 d ? ?2.3.2 ALB染色
植入后3 d，A組肝細胞形態模糊，但已經開始表達白蛋白；7 d時肝細胞狀態良好，白蛋白分泌更為旺盛；14 d時肝細胞數量和白蛋白分泌量均下降；28 d未見肝細胞。植入后3、7、14 d，B組肝細胞數量和狀態均較穩定，白蛋白分泌也處于較高水平；28 d時，雖然細胞數量明顯減少，但白蛋白分泌依舊旺盛。見圖 7。
2.3.3 CK18染色
植入后各時間點A、B組的肝細胞均維持了成熟肝細胞表型。見圖 8。
3 討論
原代肝細胞在體外易失去表性特征和生物功能，增殖潛力受限，與肝臟非實質細胞混合共培養能有效改善該問題，既往已有很多相關報道。Nishikawa等[11]使用NIH/3T3成纖維細胞與肝細胞在共價固定了膠原的聚二甲基硅氧烷硅膠膜上共培養，能夠形成雙層結構，肝細胞的各項功能表達均維持在較高水平，尤其是白蛋白分泌量是空白組（硅膠膜上只種植肝細胞）的20倍左右。Sakai等[12]通過一層肝細胞和一層成纖維細胞疊加的方法構建了片層組織，發現兩層細胞間相互交聯，且肝細胞功能良好。雖然兩種方法中成纖維細胞均有效提高了肝細胞功能表達，并與肝細胞交聯形成片層，但細胞均無支架支撐，只能在二維空間內鋪展生長，與構建三維組織工程肝尚有一定距離。而且成纖維細胞和肝細胞之間的相互作用和影響也不是三維空間式的相互作用，降低了成纖維細胞對肝細胞的穩定作用。
結合3-D打印技術，能夠快速制造所需的結構模型，并通過負型方法制造模具，為支架細胞復合體提供成膠空間。然后采用SD大鼠同系的肺成纖維細胞與原代肝細胞混勻后配成膠原細胞懸液，成膠過程中肝細胞和成纖維細胞在支架內部被空間立體化，膠原水凝膠為它們提供了三維空間內的支撐，使得它們能在三維空間內建立相互作用和影響，比平面效果更強。
團聚生長是細胞的特性之一，團聚生長可使細胞間建立相互聯系，促進彼此生長。倒置相差顯微鏡觀察示，B組體外共培養及體內植入實驗均顯示肝細胞團聚現象，而A組少見，提示成纖維細胞對肝細胞具有支持和促團聚作用。Kim等[13]采用內皮細胞和肝細胞共培養，肝細胞的團聚生長產生了膽小管功能性結構。提示我們構建的共培養體系中，肝細胞的團聚生長也產生了類似膽小管的功能性結構，但是否具有膽小管功能尚需進一步驗證。除了細胞團聚現象，在體內植入實驗中，我們還觀察到團聚的細胞呈條索狀排列。正常肝臟的肝細胞彼此相互接觸，按不同平面沿中央靜脈呈輻射狀排列，形成肝細胞索。我們的結果也呈現此排列規律，提示肝細胞在共培養和水凝膠微環境下，植入至大鼠腹腔大網膜區域，可向類正常肝臟方向生長，表明我們構建的組織工程肝在體內有形成肝臟的潛力。但由于水凝膠降解過快，28 d樣本已完全降解，故缺乏后期觀測。
體外培養和體內植入結果的共同點在于，共培養組均比單純肝細胞組細胞團聚生長多，肝功能表達良好，主要原因是：① 膠原水凝膠生物相容性好，免疫排斥反應小，為肝細胞生存提供了良好的結構支持。② 成纖維細胞分泌肝細胞生長因子為肝細胞提供營養支持，有效穩定了其生長狀態。A組體外培養14 d時，細胞凋亡、產生碎片，肝功能表達也急劇下降。B組共培養細胞可存活至28 d，體內植入14 d和28 d還可見一些雙核肝細胞，說明細胞生長狀態依然旺盛。ALB染色結果也表明肝細胞在14 d和28 d能夠穩定分泌白蛋 白。
體內共培養肝細胞狀態明顯好于體外培養的可能原因是：支架移植部位為肝臟下、靠近脾門附近，此處有較多腹腔營養物質及促肝細胞生長因子分泌；另外，肝硬化大鼠肝功能衰竭，自身修復功能也間接刺激植入的組織工程肝表達肝臟功能，刺激植入肝細胞生長旺盛。雖然可能由于植入的肝細胞數量遠小于整個肝臟細胞數量，所發揮的肝臟功能并不足以修復整個肝臟，但也啟發我們在后續體內植入實驗時，給大鼠人為制造一些損傷，如肝切除、肝衰竭、肝硬化等，可能會刺激植入的組織工程肝肝細胞生長和功能表達。
綜上述，在膠原水凝膠中共培養大鼠原代肝細胞和成纖維細胞，可以更好地模擬體內細胞微環境及細胞間的構架關系，為組織工程肝提供了更理想的細胞培養體系模型，也為構建可移植的長期存活的組織工程肝奠定了實驗基礎。
肝臟移植是治療慢性肝衰竭、肝硬化、肝癌等終末性肝病的常見方法，存在供體緊缺、需長期服用免疫藥物、成活率低等不足[1]，組織工程技術有望解決這些難題。肝臟由多種細胞成分和多種管道系統組成，一般單細胞構建組織技術與傳統生物材料均很難模擬其復雜的結構和功能。
原代肝細胞在一定時間內能保持成熟肝細胞功能，具有高活性與高代謝能力[2]，是目前用于肝組織工程研究的常用種子細胞。但原代肝細胞增殖和生長能力有限，在體外難以長期維持功能表達（如白蛋白和尿素的分泌），往往需要通過促進肝細胞聚團生長[3-5]，或者與其他非實質細胞（如成纖維細胞和內皮細胞）共培養等方式來提高肝細胞的活性和功能[6-8]。大量研究表明，原代肝細胞和成纖維細胞共培養能穩定肝細胞的功能，但多為肝細胞層與成纖維細胞層的共培養，罕見細胞在三維支架中共培養，未實現大塊組織工程肝的體內長期存活[6-8]。因此我們選用SD大鼠肺成纖維細胞和原代肝細胞于三維支架共培養，并同種異體植入肝硬化SD大鼠模型體內，探討共培養的大塊組織工程肝體內長期存活機制，以期為臨床構建可長期存活并具有功能的組織工程肝奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
5～6周齡健康雄性SD大鼠4只，體重150～ 180 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供；標準飼料，自由飲食，室溫18～25℃飼養，術前8 h禁食，2 h禁水。原代SD大鼠肺成纖維細胞購于武漢原生原代生物醫藥科技有限公司，細胞狀態良好時呈扁平或細長狀，取第3～5代細胞用于實驗。
膠原溶液制備方法：參照文獻[9]方法并結合西安交通大學機械系統工程國家重點實驗室條件制備。取健康雄性SD大鼠鼠尾，乙醇浸泡后抽出白色肌腱溶于0.1%有菌醋酸溶液，攪拌后4℃以9 840 × g離心2 h后棄沉淀，凍干后得到膠原泡沫。將膠原泡沫用0.1%有菌醋酸溶液攪拌溶解至14 mg/mL，置于透析袋中。先后用0.1%有菌醋酸溶液、1%有菌氯仿溶液各透析1 h，然后用0.1%無菌醋酸溶液透析7 d，得到無菌膠原溶液。取5 mL膠原溶液烘干后稱取膠原薄膜質量，除以5 mL即獲得膠原溶液濃度，用0.1%無菌醋酸溶液調整膠原溶液濃度，得到12 mg/ mL膠原溶液置于無菌容器中，4℃保 存。
前灌注液：NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，KCl 0.40 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.078 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.151 g/L，HEPES（WOLSEN公司，美國）2.38 g/L，葡萄糖 1.0 g/L。膠原酶灌注液：NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，KCl 0.40 g/L，NaH2PO4·2H2O 0.078 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.151 g/L，CaCl2 0.56 g/L，Ⅳ型膠原酶（Sigma公司，美國）0.5 g/ L，2.38 g/L HEPES。肝細胞洗滌液：以Williams’ E培養基（Sigma公司，美國）為基底，加入2.2 g/L NaHCO3、2.38 g/L HEPES 和1%雙抗（青、鏈霉素）溶液。肝細胞培養液：以Williams’ E培養基為基底，加入10%FBS（HyClone公司，美國）、2.2 g/L NaHCO3、500 U/L牛胰島素（Sigma公司，美國）、500 μg/L地塞米松和1%雙抗溶液。SD大鼠肺成纖維細胞培養液：以H-DMEM為基底，加入10%FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）和1%雙抗溶液。白蛋白ELISA試劑盒（R&D公司，美國）；尿素氮試劑盒（南京建成生物工程研究所）。
外科顯微手術器械（上海醫療器械設備廠）；77202-50蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；CO2恒溫培養箱（ThermoFisher公司，美國）；HC-3018R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡Ti-S（Nikon公司，日本）；真空冷凍干燥機VFD2000（北京博醫康實驗儀器有限公司）；真空澆鑄成型機（西安交通大學快速成型中心）；Pro/ENGINEER Wildfire 5軟件（PTC公司，美國）。
1.2 大鼠原代肝細胞分離培養
取4只雄性SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.3 mL麻醉后，四肢固定，腹部大“十”字切開。游離肝門靜脈，留置針插管，近端結扎固定插管。先以37℃預熱的前灌注液以25 mL/min流速原位灌注肝臟，直至呈現米黃色；切除肝臟后，用膠原酶灌注液以10 mL/ min流速循環灌注消化肝臟，直至肝臟變軟、腫脹，出現大理石樣紋理后停止。將肝臟置于4℃預冷的肝細胞洗滌液中，撕破肝包膜，抖落肝細胞，經200目篩網過濾后洗滌3次，用4℃肝細胞培養液重懸。行錐蟲藍染色，倒置相差顯微鏡觀察示細胞成活率＞ 85%。見圖 1。
圖1
倒置相差顯微鏡下原代肝細胞觀察（錐蟲藍染色× 10） 箭頭示死細胞 ? ?1.3 共培養的膠原水凝膠人工肝組織構建及體外培養
1.3.1 硅膠模具制備
使用Pro/ENGINEER Wildfire 5軟件繪制用于制造硅膠模具的模型，每個小方塊邊長10 mm、厚2 mm。將設計完成后的STL文件交由西安交通大學國家科學技術園恒通公司，使用SPS 450型光固化快速成型機完成樹脂模具的3-D打印。將樹脂模具清洗干凈后進行硅膠模具的澆鑄。稱重約100 g硅膠和1.5%（質量比）的固化劑；將樹脂模具卡入有機玻璃制造的套殼中，將混入了固化劑的硅膠導入其中，并在真空澆鑄成型機中抽真空約3 min；完成后平置24 h，剝下硅膠模具（圖 2）。
1.3.2 膠原水凝膠人工肝組織構建
實驗分為兩組，A組為單純原代肝細胞（密度為5 ×106個/ mL），B組為原代肝細胞和成纖維細胞共培養（比例為1∶0.4）[10]，原代肝細胞密度與A組相同。預先將硅膠模具和20 mL小燒杯分別在醫用乙醇中浸泡過夜。將20 mL小燒杯置于超凈臺的冰袋上預先降溫；向小燒杯中加入10 × DMEM培養基和適量NaOH溶液，調整pH值至7.8左右，然后加入12 mg/mL膠原溶液，逐滴加入NaOH溶液晃動，調節pH值至中性；分別倒入兩組細胞懸液，調節pH值至7.4；其中膠原溶液∶細胞懸液∶10 × DMEM比例為5∶4∶1；以上操作均在冰袋上進行，保持溫度為0℃。每個硅膠模具中加入200 μL上述混合液，水凝膠支架尺寸為1 cm × 1 cm × 2 mm，然后室溫下成膠（圖 3）；2 h后成膠脫模，置于24孔板中，每孔加入1 mL肝細胞培養液，每天換 液。
1.3.3 觀測指標
① 肝細胞形態觀察：于3、7、14、21 d于倒置相差顯微鏡下觀察兩組肝細胞形態。② 肝功能檢測：以1、3、7、11、14、21 d為檢測時間點，于檢測前1天更換無血清肝細胞培養液培養。各時間點吸取培養上清液，以556 × g離心5 min后，取上清，分別采用大鼠白蛋白ELISA試劑盒檢測白蛋白分泌量，尿素氮試劑盒檢測尿素分泌量。
1.4 動物體內植入實驗
肝硬化大鼠模型制備由第四軍醫大學西京消化病醫院完成。取24只SPF級雌性SD大鼠（體重200～250 g），按500 mg/（kg·d）劑量腹部皮下注射含50%四氯化碳的橄欖油溶液，每周2次，同時每周按1 mL/100 g劑量灌服30%乙醇溶液2次，持續12周后采血測定肝功能，并行肝臟切片，確定肝硬化模型建立成功。分別于肝硬化大鼠腹腔大網膜包裹1片1.3.2中兩組共培養1 d的膠原水凝膠人工肝組織，將肝臟翻起放入近脾門部位（n=12）。分別于植入后3、7、14、28 d處死兩組大鼠各3只，收集植入的膠原水凝膠人工肝組織，置于甲醛固定，常規石蠟包埋，切片，行 HE染色、細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）染色和ALB染色。
1.5 統計學方法
采用SPSS統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用two-way ANOVA檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 肝細胞形態觀察
共培養3 d，B組肝細胞開始呈現2～3個聚團生長；而A組肝細胞無明顯聚團現象。7 d，兩組肝細胞聚團生長較3 d時明顯，B組多于A組，有多細胞聚團出現，細胞呈透亮的多邊形，細胞核清晰可見。14 d，兩組水凝膠中開始出現細胞碎片，細胞邊緣不平整，A組較B組更突出。21 d，水凝膠中碎片增多，細胞邊緣不平整，兩組間無明顯差異。見圖 4。
2.2 肝功能檢測
A組白蛋白分泌量僅于共培養3 d內呈上升趨勢，之后均急劇下降；B組白蛋白分泌量于共培養3 d內明顯少于A組，前7 d內呈上升趨勢，并于7 d時高于A組且達峰值，之后急劇下降，但仍高于A組。各時間點兩組白蛋白分泌量比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。B組尿素分泌量與A組比較，培養1、3 d時差異無統計學意義（P＞ 0.05）；3 d后開始高于A組，兩組均于7 d時達峰值，之后逐漸下降，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。
2.3 動物體內植入實驗
2.3.1 HE染色
植入后3 d，A組肝細胞呈多面體，核大而圓且居中，部分有雙核或多核，核仁明顯，核膜清楚，肝細胞在水凝膠支架中生長狀況良好，部分細胞間出現連接，只有少量炎性細胞附著于水凝膠表面，中心尚無炎性細胞浸潤，對細胞狀態影響小；7 d時開始出現凋亡無核的細胞，細胞邊緣模糊；14 d時肝細胞結構尚完整，但逐漸有凋亡趨勢，核膜、核仁破碎，核膜色不清，水凝膠中心也出現少量炎性細胞浸潤；28 d時未見肝細胞。植入后3、7、14 d時，B組肝細胞生長狀況良好并有聚集或排列生長表現，偶見炎性細胞浸潤；28 d時細胞生長狀態尚可，呈多邊形，細胞核清晰可見，部分為多核，但密度明顯減少。見圖 6。
圖6
植入后兩組HE染色觀察（× 20） ? A組3 d ? B組3 d ? A組7 d ? B組7 d ? A組14 d ? B組14 d ? A組28 d ? B組28 d ? ?2.3.2 ALB染色
植入后3 d，A組肝細胞形態模糊，但已經開始表達白蛋白；7 d時肝細胞狀態良好，白蛋白分泌更為旺盛；14 d時肝細胞數量和白蛋白分泌量均下降；28 d未見肝細胞。植入后3、7、14 d，B組肝細胞數量和狀態均較穩定，白蛋白分泌也處于較高水平；28 d時，雖然細胞數量明顯減少，但白蛋白分泌依舊旺盛。見圖 7。
2.3.3 CK18染色
植入后各時間點A、B組的肝細胞均維持了成熟肝細胞表型。見圖 8。
3 討論
原代肝細胞在體外易失去表性特征和生物功能，增殖潛力受限，與肝臟非實質細胞混合共培養能有效改善該問題，既往已有很多相關報道。Nishikawa等[11]使用NIH/3T3成纖維細胞與肝細胞在共價固定了膠原的聚二甲基硅氧烷硅膠膜上共培養，能夠形成雙層結構，肝細胞的各項功能表達均維持在較高水平，尤其是白蛋白分泌量是空白組（硅膠膜上只種植肝細胞）的20倍左右。Sakai等[12]通過一層肝細胞和一層成纖維細胞疊加的方法構建了片層組織，發現兩層細胞間相互交聯，且肝細胞功能良好。雖然兩種方法中成纖維細胞均有效提高了肝細胞功能表達，并與肝細胞交聯形成片層，但細胞均無支架支撐，只能在二維空間內鋪展生長，與構建三維組織工程肝尚有一定距離。而且成纖維細胞和肝細胞之間的相互作用和影響也不是三維空間式的相互作用，降低了成纖維細胞對肝細胞的穩定作用。
結合3-D打印技術，能夠快速制造所需的結構模型，并通過負型方法制造模具，為支架細胞復合體提供成膠空間。然后采用SD大鼠同系的肺成纖維細胞與原代肝細胞混勻后配成膠原細胞懸液，成膠過程中肝細胞和成纖維細胞在支架內部被空間立體化，膠原水凝膠為它們提供了三維空間內的支撐，使得它們能在三維空間內建立相互作用和影響，比平面效果更強。
團聚生長是細胞的特性之一，團聚生長可使細胞間建立相互聯系，促進彼此生長。倒置相差顯微鏡觀察示，B組體外共培養及體內植入實驗均顯示肝細胞團聚現象，而A組少見，提示成纖維細胞對肝細胞具有支持和促團聚作用。Kim等[13]采用內皮細胞和肝細胞共培養，肝細胞的團聚生長產生了膽小管功能性結構。提示我們構建的共培養體系中，肝細胞的團聚生長也產生了類似膽小管的功能性結構，但是否具有膽小管功能尚需進一步驗證。除了細胞團聚現象，在體內植入實驗中，我們還觀察到團聚的細胞呈條索狀排列。正常肝臟的肝細胞彼此相互接觸，按不同平面沿中央靜脈呈輻射狀排列，形成肝細胞索。我們的結果也呈現此排列規律，提示肝細胞在共培養和水凝膠微環境下，植入至大鼠腹腔大網膜區域，可向類正常肝臟方向生長，表明我們構建的組織工程肝在體內有形成肝臟的潛力。但由于水凝膠降解過快，28 d樣本已完全降解，故缺乏后期觀測。
體外培養和體內植入結果的共同點在于，共培養組均比單純肝細胞組細胞團聚生長多，肝功能表達良好，主要原因是：① 膠原水凝膠生物相容性好，免疫排斥反應小，為肝細胞生存提供了良好的結構支持。② 成纖維細胞分泌肝細胞生長因子為肝細胞提供營養支持，有效穩定了其生長狀態。A組體外培養14 d時，細胞凋亡、產生碎片，肝功能表達也急劇下降。B組共培養細胞可存活至28 d，體內植入14 d和28 d還可見一些雙核肝細胞，說明細胞生長狀態依然旺盛。ALB染色結果也表明肝細胞在14 d和28 d能夠穩定分泌白蛋 白。
體內共培養肝細胞狀態明顯好于體外培養的可能原因是：支架移植部位為肝臟下、靠近脾門附近，此處有較多腹腔營養物質及促肝細胞生長因子分泌；另外，肝硬化大鼠肝功能衰竭，自身修復功能也間接刺激植入的組織工程肝表達肝臟功能，刺激植入肝細胞生長旺盛。雖然可能由于植入的肝細胞數量遠小于整個肝臟細胞數量，所發揮的肝臟功能并不足以修復整個肝臟，但也啟發我們在后續體內植入實驗時，給大鼠人為制造一些損傷，如肝切除、肝衰竭、肝硬化等，可能會刺激植入的組織工程肝肝細胞生長和功能表達。
綜上述，在膠原水凝膠中共培養大鼠原代肝細胞和成纖維細胞，可以更好地模擬體內細胞微環境及細胞間的構架關系，為組織工程肝提供了更理想的細胞培養體系模型，也為構建可移植的長期存活的組織工程肝奠定了實驗基礎。
