引用本文： 王永成, 袁雪凌, 汪愛媛, 彭江, 盧世璧. 膝關節骨軟骨損傷的治療策略. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(1): 113-118. doi: 10.7507/1002-1892.20140025 復制
既往數十年中關節軟骨損傷的治療已取得了重要進展，但深達軟骨下骨的骨軟骨損傷未得到足夠重視。骨軟骨損傷是同時累及關節軟骨及其下方軟骨下骨的損傷，臨床中不同病因引起的骨軟骨損傷發生病變的位置、大小、破壞程度有一定差異，病理特征各不相同，主要發生于創傷性骨軟骨損傷、剝脫性骨軟骨炎、骨壞死、骨關節炎等。骨軟骨損傷通常需要外科手術治療，如果形成與天然透明軟骨不同生物力學屬性的纖維軟骨，將導致軟骨下骨進一步退變，并引發相鄰正常軟骨惡化導致的嚴重疼痛、關節畸形及關節活動度喪失。基于不同原因導致的骨軟骨缺損導致了其治療的復雜性。本文對目前膝關節骨軟骨損傷的治療方法及頗具前景的組織工程策略作一綜述。
1 傳統臨床治療策略
臨床治療方法可根據骨軟骨缺損的發病部位及修復方法分類。姑息性治療一般不替換損傷的軟骨和骨，而修復性治療常采用一些生物學物質替換缺損區；然而由于軟骨、骨和軟骨-骨界面的特定性質，再生性治療是較為理想的修復方法，有助于重建天然組織。
1.1 姑息性治療
對軟骨侵害性最小的臨床治療方法是關節鏡下清理術，作為一種姑息性治療方法，其主要去除損壞的軟骨和/或骨，但不進行替換[1]。術中需先灌洗患處，然后清除不穩定的軟骨碎片、增生的滑膜、退化的半月板及韌帶游離體，剔除骨贅等[2]。雖然關節鏡下清理術具有微創的優點，但這種方法對大塊骨軟骨損傷無顯著療效[3]。與關節鏡下清理術類似的關節磨削成形術與軟骨成形術，通常也被認為是微創姑息性治療方法。關節磨削成形術是在損傷區域打磨出一個粗糙面，導致出血凝結，從而形成纖維軟骨，但這種方法不直接穿透軟骨下骨[4]。軟骨成形術是將受損軟骨的鋸齒狀邊緣變得平滑，但此方法有臨床局限性[5]。
1.2 修復性治療
自20世紀80年代開展微骨折技術以來，該方法已成為臨床軟骨修復的常用技術，其主要是在關節鏡下清理損壞的軟骨至正常軟骨邊緣，然后在軟骨下骨上鉆孔使BMSCs通過血液到達軟骨缺損處形成血凝塊，最終形成纖維軟骨充填骨軟骨缺損[6]。該方法操作簡便，對于小面積軟骨損傷治療結果較滿意，因此在臨床上廣泛應用；但不足之處是需進行長時間的術后康復治療[7]。使用異體移植和自體移植技術修復軟骨和骨軟骨缺損是有創操作，兩種骨軟骨移植物均可應用軟骨鑲嵌技術（馬賽克移植技術）治療骨軟骨損傷。自體骨軟骨移植是采用非負重面的骨軟骨填塞移植修復缺損部位，其移植過程可通過關節鏡和關節切開兩種方法實現，因非負重面骨軟骨來源有限，自體骨軟骨移植主要應用于中小面積骨軟骨缺損[8]。而異體骨軟骨移植通過選擇合適供體，進而獲得合適大小和外形的移植物，能夠一次性有效修復較大面積的骨軟骨缺損[9]；但免疫排斥反應是異體骨軟骨移植能否成功的重要問題。
1.3 再生性治療
目前對于軟骨損傷公認的再生性治療方法是自體軟骨細胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI），自1994年被首次報道以來經過了多次改進[10]。第1代ACI技術采用自體軟骨細胞單層體外培養及關節切開兩階段細胞植入，骨膜或膠原膜覆蓋封閉植入軟骨細胞，其生成的軟骨為透明軟骨和纖維軟骨的混合物。第2代ACI技術改進為更簡單的兩階段法，在第一階段進行關節鏡評價和活檢，收集自體軟骨細胞分離擴增；第二階段采用膠原膜覆蓋軟骨細胞-支架復合物，避免骨膜肥大并發癥，也有學者嘗試采用三維支架將細胞分布均勻并防止細胞從軟骨缺損部位流失[11]。基質誘導ACI（matrix-assisted ACI，MACI）技術是將自體軟骨細胞接種于經純化處理的豬Ⅰ/Ⅲ型膠原膜，體外培養4周后，二期采用纖維蛋白膠將細胞-支架復合物移植于缺損區域。但ACI和MACI技術的局限性是需二次手術、術后恢復時間相對較長、植入的軟骨細胞成熟緩慢[12]。
2 組織工程治療策略
組織工程學研究領域涉及材料學、工程學及生命科學，只有將其發展的最新策略應用于骨軟骨組織工程范疇，并聯合支架、細胞、生長因子等相關要素的協同作用，才可能充分恢復軟骨及軟骨下骨的正常功能和力學特性。
2.1 骨軟骨組織工程傳導支架
為了模擬體內細胞外基質的三維環境，組織工程需要構建一個組織傳導體系，為周圍再生組織提供結構支撐，為細胞遷移、黏附和分化提供空間[13]。骨軟骨支架材料的性質一直被廣泛研究。天然材料具有良好的生物相容性和可降解性，可模仿細胞外基質的某些特性，促進細胞黏附、遷移、分化和細胞外基質沉積；但天然材料也存在缺點，如免疫原性、加工困難和傳播動物病原體的潛在風險。此外，如果不進行適當的化學試劑交聯，材料植入后將快速降解導致機械強度減弱[14]。合成材料因具有易成型、生產便利和可控降解能力，已被廣泛用于組織工程的體內、外研究[13]。最常用的可生物降解合成聚合物包括聚α-羥基酸，如聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）以及二者聚合物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA），聚已酸內酯、聚丙烯富馬酸鹽、聚二惡烷酮等[15]。雖然合成材料具有生物相容性，但其體內降解時的水解反應可能會導致局部pH值降低和炎性反應發生[16]。此外，由于天然軟骨和骨具有完全不同的機械剛度和材料結構屬性[17]，導致了組織工程策略修復骨軟骨缺損的復雜性。目前基于骨軟骨支架的研究已從單相設計逐漸趨于雙相或多相分層的仿生設計和成分優化。
2.1.1 單相支架
單相支架是應用單一材料根據缺損區形態先預制成型再填充的技術，是組織工程最早應用于骨軟骨缺損修復的支架。制備單相支架的常用材料包括羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）及一些聚合物，如PLGA和聚已酸內酯[18-19]，這些材料制備的支架具有良好的降解率、不同強度和孔隙率，可供模擬周圍組織的特性，從而促進與宿主組織的充分整合。早在1995年Chu等[20]即應用聚左旋乳酸顆粒制備骨軟骨支架，并進行了體內、外實驗研究，結果表明雖然聚合物支架可為細胞的黏附和存活提供良好支持，但體內移植后基質分泌大部分為Ⅰ型膠原。此外，單相支架也可由多種材料混合組成，比如將凝膠混合添加于聚合物支架的孔隙中[21]。
支架的設計與制備也會影響實驗結果。在一項支架結構的研究中，Malda等[22]采用兩種不同加工方法（壓縮塑形與三維纖維沉積），制備出可生物降解且具有不同孔隙結構的聚合物支架（聚對苯二甲酸乙二醇酯 /聚對苯二甲酸丁二醇酯）。其中，采用壓縮塑形法制備支架平均孔徑為182 μm，而三維纖維沉積法制備支架為525 μm；支架復合軟骨細胞后的體、內外研究顯示，二者的DNA含量、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量、力學性能均有顯著差異。也有學者采用聚乙烯異丁烯酸復合硫酸軟骨素以低密度電紡絲納米纖維技術制作單相支架[23]，復合羊MSCs并向軟骨誘導，體外培養后發現其具有與透明軟骨相似性狀并更具力學彈性；細胞增殖能力和細胞外GAG含量顯著增加，并可見軟骨細胞陷窩形成；免疫組織化學染色示，硫酸軟骨素可促進Ⅱ型膠原生成，但對Ⅰ型膠原無作 用。
目前研究較多的單相支架是膠原蛋白支架[24]，Zhou等[25]曾進行了單相膠原支架和雙相膠原/HA支架體外對比研究，發現兩種支架復合人BMSCs后，在成軟骨培養基中培養3周后阿爾新藍和Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性，而在成骨培養基中培養3周后茜素紅和Ⅰ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性；但單相膠原支架在成軟骨方面表現更好，而雙相膠原/HA支架在成骨方面更具優勢。
以上研究表明，單相支架可為軟骨細胞或骨細胞的黏附和擴增提供良好支持，但單相支架缺點是缺乏再生骨軟骨組織的內在物理結構。
2.1.2 雙相或多相支架
有學者提出，為更好地完成對軟骨和軟骨下骨的同時重建，應使用雙相或多相支架修復骨軟骨缺損[26]。構建雙相支架通常采用兩種不同材料，一種構建軟骨層，另一種構建軟骨下骨/骨層；多相支架則需加入第3種材料來構建界面層，以模擬天然骨軟骨組織兩層間過渡區（潮線周圍）的特性[27-28]。由于雙相或多相支架包含兩個獨立部分，如果不考慮過渡區的必要性，支架植入體內后可能發生分離，導致骨軟骨重建失敗[29]，所以恰當構建含有過渡區的雙相或多相支架，可能提供一種合理的組織修復方法。常用于構建雙相支架的材料很多，有學者[30]進行了一項不同材料構建的雙相支架體內對比實驗研究，將Ⅰ型膠原/GAG雙相支架與PLGA/PGA雙相支架分別用于修復山羊骨軟骨缺損模型，12周后Ⅰ型膠原/GAG支架更為堅強并可提供牢固的力學支撐；26周后Ⅰ型膠原/GAG支架組的修復缺損區內可見大部分為透明軟骨填充，組織學評分優于PLGA/PGA支架組。Chen等[31]也研發了一種雙相支架，上層為膠原蛋白海綿，下層由PLGA與Ⅱ型膠原按75∶25比例復合材料構成。他們將BMSCs種植至該雙相支架上體外培養1 周后植入體內修復股骨髁骨軟骨缺損，4個月后結果顯示缺損區表面修復光滑，與周圍組織整合良好，組織學染色示有軟骨樣組織生成和軟骨下骨重建完成。Deng 等[32]也構建了一種雙相支架，上層由明膠、硫酸軟骨素和透明質酸鈉組成，下層由明膠和脫鈣小牛骨組成；將兔軟骨細胞和BMSCs成骨誘導培養5 d后復合于雙相支架植入體內修復兔膝關節股骨遠端大塊缺損，組織學結果顯示軟骨層有透明軟骨形成，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色陽性，軟骨下骨層骨生成良好，茜素紅和ALP染色陽性；力學結果示修復組織的軟骨和骨層均具有良好的抗壓縮強度，與天然骨軟骨組織的數量級相當。在最近的一項研究中，Da等[33]采用三維打印技術構建了一種含中間致密層的雙相骨軟骨支架，于骨層和軟骨層分別種植自體成骨細胞和成軟骨誘導的BMSCs后植入兔膝關節骨軟骨缺損處，結果顯示這一致密層能顯著提高雙相支架的生物力學性能，且骨軟骨組織再生良好。
2.2 骨軟骨組織工程生長因子
通常情況下，單獨應用支架材料并不能為骨和軟骨再生提供足夠支持。因此，采用各種方法適當添加不同濃度生長因子對缺損組織的再生是非常必要的，生長因子的種類和濃度選擇不當可能引發軟骨細胞的“終末分化”現象，繼而發生軟骨內骨化導致新生軟骨退變[34-36]。目前發現許多生長因子對骨/軟骨細胞的生長和遷移有特定影響。研究表明BMPs對刺激新骨 /軟骨形成有強大作用[15, 37]；此外，EGF、PDGF、FGF、甲狀旁腺激素相關肽、IGF、TGF-β、VEGF等因子也具有不同程度的促進功能[16, 35]。生長因子在病變部位的空間分布以及不同時間內的釋放濃度對骨軟骨再生的療效也有顯著影響。常規給藥方法包括全身用藥、缺損部位注射[14]，但由于生長因子蛋白半衰期較短，無法長期維持有效藥物濃度，常需要高劑量注射才能彌補該缺點[38]。最近有大量研究[39-41]應用絲素蛋白微球、多孔PLGA及殼聚糖三維支架等作為載體，包被多種生長因子制作成梯度濃度釋放的緩釋系統，可為種子細胞提供長期有效的生長因子微環境。
2.3 骨軟骨組織工程種子細胞
大量研究表明，應用軟骨細胞體外修復骨軟骨缺損更有益于功能性軟骨組織的再生[42-44]。但機體內軟骨細胞來源較少（＜ 5%軟骨體積），不僅取材困難，且分離時采用膠原酶消化對軟骨細胞有破壞性作用[45]，導致體外培養和擴增時引起表型缺失而發生去分化現象[46]。已有研究試圖尋找膠原酶消化的最佳濃度和孵育時間，以便提供更多解決方案[47]。基于干細胞在細胞治療和組織工程中的重要作用，目前已有多種干細胞應用于骨軟骨組織工程。BMSCs是一種可自我更新、向不同譜系分化的多功能祖細胞，是治療骨軟骨缺損很有前景的種子細胞來源[48]，已有大量研究表明，BMSCs在體外（通過使用生長因子）可促進軟骨形成[49]。滑膜MSCs具有較大的成軟骨分化潛能，因其取材方便，且不同年齡捐獻者的細胞在體外培養擴增超過10代仍可保持多譜系分化潛能而倍受關注[50]；有研究者將滑膜MSCs接種至瓊脂糖凝膠支架上，構建出的組織工程組織具有與天然組織相當的力學和生化特性[51]。脂肪組織中也含有大量MSCs，可廣泛用于骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經再生醫學領域[52-53]，比BMSCs更具遺傳穩定性[54]。臍帶血已成為MSCs的另一重要來源，臍帶血干細胞在體外更具成軟骨細胞分化潛能，與不同材料結合可形成軟骨和/或骨組織，成為軟骨組織工程更具吸引力的種子細胞來源[55-58]。
2.4 生物反應器的應用
即使有支架、生長因子和細胞的完美結合，要成功地再生骨軟骨組織，還需要特殊的力學生物學環境。體外研究需盡可能模擬體內真實環境，為細胞-支架復合物提供必要的力學和生物學條件[59]。生物反應器可充分復制體內生物環境，為種子細胞在生物支架內提供均勻的營養支持，促進細胞與周圍環境的物質傳遞，提供物理和化學信號刺激，有助于組織再生[60]。培養骨軟骨移植物的生物反應器是基于影響軟骨形成、骨生成和骨軟骨界面形成的力學參數而設計的。研究表明，在適當條件下，生物反應器提供的直接壓縮應力刺激軟骨細胞，可增加蛋白多糖和膠原的合成，并提高力學性能[61]。然而，關節軟骨在機體內的受力環境非常復雜，軟骨細胞在關節液中所受的力學刺激還包括張力、剪切力及靜水壓等[62]。流體剪切力是關節液流動而產生的骨軟骨結構之間的剪切力，可促進廢物代謝和營養傳遞，基于此觀點，有學者應用旋轉式生物反應器培養BMSCs已成功構建出骨軟骨移植物[63]。Wagner等[64]研究發現靜水壓產生的直接力學刺激能促進人BMSCs的多向分化功能。直接灌注式生物反應器在骨組織工程中已有很多研究，有學者認為其應用于軟骨組織工程中也同樣可行[59, 65]。總之，骨軟骨組織工程生物反應器的設計有待于進一步完善，未來研究應致力于設計一種獨立的生物反應器，對骨軟骨移植物的雙相培養同時達到最佳效果。
2.5 適宜的固定
支架固定在組織再生中是關鍵的一步，復雜的組織界面再生過程中，移植物穩定性失效將影響長期臨床結果，因此修復組織的生物固定或一體化仍是重要臨床挑戰[66]。向臨床轉化的一個重大障礙是如何實現生物固定與功能整合，以及如何防止骨骼、韌帶或軟骨組織工程移植物的界面與宿主環境之間微動[67]。目前治療小面積骨軟骨病變時，大多數外科醫生不使用任何固定系統，僅依靠纖維蛋白凝塊黏附及支架與病變處理部位之間的壓配獲得支架穩定，或使用生物相容性膠水（如纖維蛋白膠）作為輔助治療，以獲得支架穩定[68-69]。而纖維蛋白凝塊易吸收脫落，支架幾何形狀常與病變部位不匹配，纖維蛋白膠雖保留了支架的完整性，但支架與軟骨或軟骨下骨附著力很弱。若采用有創固定方法如軟骨移植物縫合，可能會導致軟骨骨折及術后移植物吸收[70]。因此，為了獲得最佳的支架固定同時減少對支架的損壞，穩定可靠的移植物固定方法是未來研究的熱點。
3 總結和展望
臨床治療膝關節骨軟骨損傷患者時，進行整體和個性化評估以及全面檢查，對確定治療方案非常必要。軟骨-骨界面是維持骨軟骨復合單元結構和功能完整性的重要組成部分，隨著對軟骨下骨的基礎科學和病理生理學機制研究的深入，以及大量動物實驗和臨床試驗的開展，對骨軟骨損傷修復策略不再局限于單一成分，而應側重于骨軟骨單元“一體化”的整體研究。
如何重建一個類似天然骨軟骨組織的無縫連接的骨軟骨界面，仍是再生醫學的一個重大挑戰。在骨軟骨組織工程領域，未來應廣泛結合材料學、工程學、化學和細胞生物學等多學科最新發展，共同恢復正常軟骨和軟骨下骨的功能和力學特性，為骨軟骨損傷的治療提供最佳解決方案。
既往數十年中關節軟骨損傷的治療已取得了重要進展，但深達軟骨下骨的骨軟骨損傷未得到足夠重視。骨軟骨損傷是同時累及關節軟骨及其下方軟骨下骨的損傷，臨床中不同病因引起的骨軟骨損傷發生病變的位置、大小、破壞程度有一定差異，病理特征各不相同，主要發生于創傷性骨軟骨損傷、剝脫性骨軟骨炎、骨壞死、骨關節炎等。骨軟骨損傷通常需要外科手術治療，如果形成與天然透明軟骨不同生物力學屬性的纖維軟骨，將導致軟骨下骨進一步退變，并引發相鄰正常軟骨惡化導致的嚴重疼痛、關節畸形及關節活動度喪失。基于不同原因導致的骨軟骨缺損導致了其治療的復雜性。本文對目前膝關節骨軟骨損傷的治療方法及頗具前景的組織工程策略作一綜述。
1 傳統臨床治療策略
臨床治療方法可根據骨軟骨缺損的發病部位及修復方法分類。姑息性治療一般不替換損傷的軟骨和骨，而修復性治療常采用一些生物學物質替換缺損區；然而由于軟骨、骨和軟骨-骨界面的特定性質，再生性治療是較為理想的修復方法，有助于重建天然組織。
1.1 姑息性治療
對軟骨侵害性最小的臨床治療方法是關節鏡下清理術，作為一種姑息性治療方法，其主要去除損壞的軟骨和/或骨，但不進行替換[1]。術中需先灌洗患處，然后清除不穩定的軟骨碎片、增生的滑膜、退化的半月板及韌帶游離體，剔除骨贅等[2]。雖然關節鏡下清理術具有微創的優點，但這種方法對大塊骨軟骨損傷無顯著療效[3]。與關節鏡下清理術類似的關節磨削成形術與軟骨成形術，通常也被認為是微創姑息性治療方法。關節磨削成形術是在損傷區域打磨出一個粗糙面，導致出血凝結，從而形成纖維軟骨，但這種方法不直接穿透軟骨下骨[4]。軟骨成形術是將受損軟骨的鋸齒狀邊緣變得平滑，但此方法有臨床局限性[5]。
1.2 修復性治療
自20世紀80年代開展微骨折技術以來，該方法已成為臨床軟骨修復的常用技術，其主要是在關節鏡下清理損壞的軟骨至正常軟骨邊緣，然后在軟骨下骨上鉆孔使BMSCs通過血液到達軟骨缺損處形成血凝塊，最終形成纖維軟骨充填骨軟骨缺損[6]。該方法操作簡便，對于小面積軟骨損傷治療結果較滿意，因此在臨床上廣泛應用；但不足之處是需進行長時間的術后康復治療[7]。使用異體移植和自體移植技術修復軟骨和骨軟骨缺損是有創操作，兩種骨軟骨移植物均可應用軟骨鑲嵌技術（馬賽克移植技術）治療骨軟骨損傷。自體骨軟骨移植是采用非負重面的骨軟骨填塞移植修復缺損部位，其移植過程可通過關節鏡和關節切開兩種方法實現，因非負重面骨軟骨來源有限，自體骨軟骨移植主要應用于中小面積骨軟骨缺損[8]。而異體骨軟骨移植通過選擇合適供體，進而獲得合適大小和外形的移植物，能夠一次性有效修復較大面積的骨軟骨缺損[9]；但免疫排斥反應是異體骨軟骨移植能否成功的重要問題。
1.3 再生性治療
目前對于軟骨損傷公認的再生性治療方法是自體軟骨細胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI），自1994年被首次報道以來經過了多次改進[10]。第1代ACI技術采用自體軟骨細胞單層體外培養及關節切開兩階段細胞植入，骨膜或膠原膜覆蓋封閉植入軟骨細胞，其生成的軟骨為透明軟骨和纖維軟骨的混合物。第2代ACI技術改進為更簡單的兩階段法，在第一階段進行關節鏡評價和活檢，收集自體軟骨細胞分離擴增；第二階段采用膠原膜覆蓋軟骨細胞-支架復合物，避免骨膜肥大并發癥，也有學者嘗試采用三維支架將細胞分布均勻并防止細胞從軟骨缺損部位流失[11]。基質誘導ACI（matrix-assisted ACI，MACI）技術是將自體軟骨細胞接種于經純化處理的豬Ⅰ/Ⅲ型膠原膜，體外培養4周后，二期采用纖維蛋白膠將細胞-支架復合物移植于缺損區域。但ACI和MACI技術的局限性是需二次手術、術后恢復時間相對較長、植入的軟骨細胞成熟緩慢[12]。
2 組織工程治療策略
組織工程學研究領域涉及材料學、工程學及生命科學，只有將其發展的最新策略應用于骨軟骨組織工程范疇，并聯合支架、細胞、生長因子等相關要素的協同作用，才可能充分恢復軟骨及軟骨下骨的正常功能和力學特性。
2.1 骨軟骨組織工程傳導支架
為了模擬體內細胞外基質的三維環境，組織工程需要構建一個組織傳導體系，為周圍再生組織提供結構支撐，為細胞遷移、黏附和分化提供空間[13]。骨軟骨支架材料的性質一直被廣泛研究。天然材料具有良好的生物相容性和可降解性，可模仿細胞外基質的某些特性，促進細胞黏附、遷移、分化和細胞外基質沉積；但天然材料也存在缺點，如免疫原性、加工困難和傳播動物病原體的潛在風險。此外，如果不進行適當的化學試劑交聯，材料植入后將快速降解導致機械強度減弱[14]。合成材料因具有易成型、生產便利和可控降解能力，已被廣泛用于組織工程的體內、外研究[13]。最常用的可生物降解合成聚合物包括聚α-羥基酸，如聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）以及二者聚合物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA），聚已酸內酯、聚丙烯富馬酸鹽、聚二惡烷酮等[15]。雖然合成材料具有生物相容性，但其體內降解時的水解反應可能會導致局部pH值降低和炎性反應發生[16]。此外，由于天然軟骨和骨具有完全不同的機械剛度和材料結構屬性[17]，導致了組織工程策略修復骨軟骨缺損的復雜性。目前基于骨軟骨支架的研究已從單相設計逐漸趨于雙相或多相分層的仿生設計和成分優化。
2.1.1 單相支架
單相支架是應用單一材料根據缺損區形態先預制成型再填充的技術，是組織工程最早應用于骨軟骨缺損修復的支架。制備單相支架的常用材料包括羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）及一些聚合物，如PLGA和聚已酸內酯[18-19]，這些材料制備的支架具有良好的降解率、不同強度和孔隙率，可供模擬周圍組織的特性，從而促進與宿主組織的充分整合。早在1995年Chu等[20]即應用聚左旋乳酸顆粒制備骨軟骨支架，并進行了體內、外實驗研究，結果表明雖然聚合物支架可為細胞的黏附和存活提供良好支持，但體內移植后基質分泌大部分為Ⅰ型膠原。此外，單相支架也可由多種材料混合組成，比如將凝膠混合添加于聚合物支架的孔隙中[21]。
支架的設計與制備也會影響實驗結果。在一項支架結構的研究中，Malda等[22]采用兩種不同加工方法（壓縮塑形與三維纖維沉積），制備出可生物降解且具有不同孔隙結構的聚合物支架（聚對苯二甲酸乙二醇酯 /聚對苯二甲酸丁二醇酯）。其中，采用壓縮塑形法制備支架平均孔徑為182 μm，而三維纖維沉積法制備支架為525 μm；支架復合軟骨細胞后的體、內外研究顯示，二者的DNA含量、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量、力學性能均有顯著差異。也有學者采用聚乙烯異丁烯酸復合硫酸軟骨素以低密度電紡絲納米纖維技術制作單相支架[23]，復合羊MSCs并向軟骨誘導，體外培養后發現其具有與透明軟骨相似性狀并更具力學彈性；細胞增殖能力和細胞外GAG含量顯著增加，并可見軟骨細胞陷窩形成；免疫組織化學染色示，硫酸軟骨素可促進Ⅱ型膠原生成，但對Ⅰ型膠原無作 用。
目前研究較多的單相支架是膠原蛋白支架[24]，Zhou等[25]曾進行了單相膠原支架和雙相膠原/HA支架體外對比研究，發現兩種支架復合人BMSCs后，在成軟骨培養基中培養3周后阿爾新藍和Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性，而在成骨培養基中培養3周后茜素紅和Ⅰ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性；但單相膠原支架在成軟骨方面表現更好，而雙相膠原/HA支架在成骨方面更具優勢。
以上研究表明，單相支架可為軟骨細胞或骨細胞的黏附和擴增提供良好支持，但單相支架缺點是缺乏再生骨軟骨組織的內在物理結構。
2.1.2 雙相或多相支架
有學者提出，為更好地完成對軟骨和軟骨下骨的同時重建，應使用雙相或多相支架修復骨軟骨缺損[26]。構建雙相支架通常采用兩種不同材料，一種構建軟骨層，另一種構建軟骨下骨/骨層；多相支架則需加入第3種材料來構建界面層，以模擬天然骨軟骨組織兩層間過渡區（潮線周圍）的特性[27-28]。由于雙相或多相支架包含兩個獨立部分，如果不考慮過渡區的必要性，支架植入體內后可能發生分離，導致骨軟骨重建失敗[29]，所以恰當構建含有過渡區的雙相或多相支架，可能提供一種合理的組織修復方法。常用于構建雙相支架的材料很多，有學者[30]進行了一項不同材料構建的雙相支架體內對比實驗研究，將Ⅰ型膠原/GAG雙相支架與PLGA/PGA雙相支架分別用于修復山羊骨軟骨缺損模型，12周后Ⅰ型膠原/GAG支架更為堅強并可提供牢固的力學支撐；26周后Ⅰ型膠原/GAG支架組的修復缺損區內可見大部分為透明軟骨填充，組織學評分優于PLGA/PGA支架組。Chen等[31]也研發了一種雙相支架，上層為膠原蛋白海綿，下層由PLGA與Ⅱ型膠原按75∶25比例復合材料構成。他們將BMSCs種植至該雙相支架上體外培養1 周后植入體內修復股骨髁骨軟骨缺損，4個月后結果顯示缺損區表面修復光滑，與周圍組織整合良好，組織學染色示有軟骨樣組織生成和軟骨下骨重建完成。Deng 等[32]也構建了一種雙相支架，上層由明膠、硫酸軟骨素和透明質酸鈉組成，下層由明膠和脫鈣小牛骨組成；將兔軟骨細胞和BMSCs成骨誘導培養5 d后復合于雙相支架植入體內修復兔膝關節股骨遠端大塊缺損，組織學結果顯示軟骨層有透明軟骨形成，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色陽性，軟骨下骨層骨生成良好，茜素紅和ALP染色陽性；力學結果示修復組織的軟骨和骨層均具有良好的抗壓縮強度，與天然骨軟骨組織的數量級相當。在最近的一項研究中，Da等[33]采用三維打印技術構建了一種含中間致密層的雙相骨軟骨支架，于骨層和軟骨層分別種植自體成骨細胞和成軟骨誘導的BMSCs后植入兔膝關節骨軟骨缺損處，結果顯示這一致密層能顯著提高雙相支架的生物力學性能，且骨軟骨組織再生良好。
2.2 骨軟骨組織工程生長因子
通常情況下，單獨應用支架材料并不能為骨和軟骨再生提供足夠支持。因此，采用各種方法適當添加不同濃度生長因子對缺損組織的再生是非常必要的，生長因子的種類和濃度選擇不當可能引發軟骨細胞的“終末分化”現象，繼而發生軟骨內骨化導致新生軟骨退變[34-36]。目前發現許多生長因子對骨/軟骨細胞的生長和遷移有特定影響。研究表明BMPs對刺激新骨 /軟骨形成有強大作用[15, 37]；此外，EGF、PDGF、FGF、甲狀旁腺激素相關肽、IGF、TGF-β、VEGF等因子也具有不同程度的促進功能[16, 35]。生長因子在病變部位的空間分布以及不同時間內的釋放濃度對骨軟骨再生的療效也有顯著影響。常規給藥方法包括全身用藥、缺損部位注射[14]，但由于生長因子蛋白半衰期較短，無法長期維持有效藥物濃度，常需要高劑量注射才能彌補該缺點[38]。最近有大量研究[39-41]應用絲素蛋白微球、多孔PLGA及殼聚糖三維支架等作為載體，包被多種生長因子制作成梯度濃度釋放的緩釋系統，可為種子細胞提供長期有效的生長因子微環境。
2.3 骨軟骨組織工程種子細胞
大量研究表明，應用軟骨細胞體外修復骨軟骨缺損更有益于功能性軟骨組織的再生[42-44]。但機體內軟骨細胞來源較少（＜ 5%軟骨體積），不僅取材困難，且分離時采用膠原酶消化對軟骨細胞有破壞性作用[45]，導致體外培養和擴增時引起表型缺失而發生去分化現象[46]。已有研究試圖尋找膠原酶消化的最佳濃度和孵育時間，以便提供更多解決方案[47]。基于干細胞在細胞治療和組織工程中的重要作用，目前已有多種干細胞應用于骨軟骨組織工程。BMSCs是一種可自我更新、向不同譜系分化的多功能祖細胞，是治療骨軟骨缺損很有前景的種子細胞來源[48]，已有大量研究表明，BMSCs在體外（通過使用生長因子）可促進軟骨形成[49]。滑膜MSCs具有較大的成軟骨分化潛能，因其取材方便，且不同年齡捐獻者的細胞在體外培養擴增超過10代仍可保持多譜系分化潛能而倍受關注[50]；有研究者將滑膜MSCs接種至瓊脂糖凝膠支架上，構建出的組織工程組織具有與天然組織相當的力學和生化特性[51]。脂肪組織中也含有大量MSCs，可廣泛用于骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經再生醫學領域[52-53]，比BMSCs更具遺傳穩定性[54]。臍帶血已成為MSCs的另一重要來源，臍帶血干細胞在體外更具成軟骨細胞分化潛能，與不同材料結合可形成軟骨和/或骨組織，成為軟骨組織工程更具吸引力的種子細胞來源[55-58]。
2.4 生物反應器的應用
即使有支架、生長因子和細胞的完美結合，要成功地再生骨軟骨組織，還需要特殊的力學生物學環境。體外研究需盡可能模擬體內真實環境，為細胞-支架復合物提供必要的力學和生物學條件[59]。生物反應器可充分復制體內生物環境，為種子細胞在生物支架內提供均勻的營養支持，促進細胞與周圍環境的物質傳遞，提供物理和化學信號刺激，有助于組織再生[60]。培養骨軟骨移植物的生物反應器是基于影響軟骨形成、骨生成和骨軟骨界面形成的力學參數而設計的。研究表明，在適當條件下，生物反應器提供的直接壓縮應力刺激軟骨細胞，可增加蛋白多糖和膠原的合成，并提高力學性能[61]。然而，關節軟骨在機體內的受力環境非常復雜，軟骨細胞在關節液中所受的力學刺激還包括張力、剪切力及靜水壓等[62]。流體剪切力是關節液流動而產生的骨軟骨結構之間的剪切力，可促進廢物代謝和營養傳遞，基于此觀點，有學者應用旋轉式生物反應器培養BMSCs已成功構建出骨軟骨移植物[63]。Wagner等[64]研究發現靜水壓產生的直接力學刺激能促進人BMSCs的多向分化功能。直接灌注式生物反應器在骨組織工程中已有很多研究，有學者認為其應用于軟骨組織工程中也同樣可行[59, 65]。總之，骨軟骨組織工程生物反應器的設計有待于進一步完善，未來研究應致力于設計一種獨立的生物反應器，對骨軟骨移植物的雙相培養同時達到最佳效果。
2.5 適宜的固定
支架固定在組織再生中是關鍵的一步，復雜的組織界面再生過程中，移植物穩定性失效將影響長期臨床結果，因此修復組織的生物固定或一體化仍是重要臨床挑戰[66]。向臨床轉化的一個重大障礙是如何實現生物固定與功能整合，以及如何防止骨骼、韌帶或軟骨組織工程移植物的界面與宿主環境之間微動[67]。目前治療小面積骨軟骨病變時，大多數外科醫生不使用任何固定系統，僅依靠纖維蛋白凝塊黏附及支架與病變處理部位之間的壓配獲得支架穩定，或使用生物相容性膠水（如纖維蛋白膠）作為輔助治療，以獲得支架穩定[68-69]。而纖維蛋白凝塊易吸收脫落，支架幾何形狀常與病變部位不匹配，纖維蛋白膠雖保留了支架的完整性，但支架與軟骨或軟骨下骨附著力很弱。若采用有創固定方法如軟骨移植物縫合，可能會導致軟骨骨折及術后移植物吸收[70]。因此，為了獲得最佳的支架固定同時減少對支架的損壞，穩定可靠的移植物固定方法是未來研究的熱點。
3 總結和展望
臨床治療膝關節骨軟骨損傷患者時，進行整體和個性化評估以及全面檢查，對確定治療方案非常必要。軟骨-骨界面是維持骨軟骨復合單元結構和功能完整性的重要組成部分，隨著對軟骨下骨的基礎科學和病理生理學機制研究的深入，以及大量動物實驗和臨床試驗的開展，對骨軟骨損傷修復策略不再局限于單一成分，而應側重于骨軟骨單元“一體化”的整體研究。
如何重建一個類似天然骨軟骨組織的無縫連接的骨軟骨界面，仍是再生醫學的一個重大挑戰。在骨軟骨組織工程領域，未來應廣泛結合材料學、工程學、化學和細胞生物學等多學科最新發展，共同恢復正常軟骨和軟骨下骨的功能和力學特性，為骨軟骨損傷的治療提供最佳解決方案。