引用本文： 陳松, 符培亮, 叢銳軍, 吳海山, 許震宇. TGF-β3、BMP-2及地塞米松誘導兔滑膜MSCs成軟骨分化的研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(1): 92-99. doi: 10.7507/1002-1892.20140021 復制
關節軟骨一旦損傷很難自我修復，學者們對如何促進軟骨修復進行了大量探索。采用自體軟骨細胞移植治療軟骨損傷預后較好，但由于細胞來源不足、細胞增殖能力有限以及供區損傷等缺點，限制了其臨床應用[1]。MSCs具有向軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞分化的能力，應用其修復軟骨損傷具有良好應用前景[2]。De Bari等[3]從人關節滑膜分離獲得滑膜MSCs（synovial MSCs，SMSCs），其比來源于骨髓、骨膜、脂肪及肌肉的MSCs具有更強的成軟骨、成骨及成脂肪分化能力，同時具有取材簡便、對機體損傷小等優點[4]，吸引了越來越多研究者關注。
MSCs成軟骨分化過程中，細胞因子的作用必不可少。Sekiya等[5]在研究BMSCs向軟骨細胞分化時發現，單純使用TGF-β1誘導作用不夠，必須添加BMP-6；Sekiya等[6]在研究SMSCs體外向軟骨細胞分化的最優條件時發現，TGF-β1和BMP-2聯合使用最為有效；Nishimura等[7]應用PELLET培養系統誘導SMSCs向軟骨細胞分化時發現，SMSCs在TGF-β1和地塞米松（dexamethasone，DEX）誘導作用下可分化為軟骨細胞。以上研究結果顯示，TGF-β、BMP及DEX均可促進MSCs向軟骨細胞分化。TGF-β1是常用的成軟骨誘導劑，但有研究顯示，與TGF-β1相比，TGF-β3誘導MSCs成軟骨能力更強[8-9]。Shirasawa等[10]研究表明，BMP-2能明顯提高TGF-β3誘導SMSCs向軟骨細胞分化的效率。目前關于細胞因子誘導BMSCs成軟骨分化的研究較多，最佳誘導條件也得到實驗驗證，但罕見關于誘導SMSCs成軟骨分化的最佳細胞因子條件的報道。本研究采用TGF-β3、BMP-2及DEX誘導兔SMSCs成軟骨分化，為探索SMSCs向軟骨細胞分化的最優條件奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10～16月齡新西蘭大白兔5只，雌雄不限，體重1.8～2.5 kg，由第二軍醫大學動物實驗中心提供。
DMEM培養液、0.05%胰蛋白酶/EDTA（GIBCO/BRL公司，美國）；一抗Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、DEX、2-磷酸-抗壞血酸、L-脯氨酸、丙酮酸鹽（Sigma公司，美國）；TGF-β3、胰島素、胰島素鐵硒傳遞蛋白（insulin-transferrin-selenium，ITS）+ Premix（R&D公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；Oligo dT、dNTP、焦碳酸二乙酯和各PCR引物（上海吉凱生物技術有限公司）；逆轉錄酶M-MLV（Fermentas公司，加拿大）；rTaq DNA 合成酶、100 bp DNA Ladder（Takara公司，日本）；Ⅰ、Ⅱ型膠原IgG（Monosan公司，美國）；小鼠抗人角蛋白19單克隆即用型抗體、小鼠抗人波形蛋白單克隆即用型抗體、DR-PE、二步法抗兔/鼠通用型免疫組織化學檢測試劑盒（上海基因科技有限公司）；小鼠抗人單克隆熒光標記抗體CD106-PE、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD14-FITC、CD71-FITC、CD105-PE（BD公司，美國）；BMP-2（山之內制藥，日本）。
CO2培養箱（Thermo Forma公司，美國）；SBD 50恒溫水浴搖床（Heto公司，丹麥）；SMZ 645型光學顯微鏡（Nikon公司，日本）；IX70型熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；流式細胞儀（BD公司，美國）；CellQuest軟件（Becton Dickinson公司，美國）。
1.2 SMSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 SMSCs分離及培養
取新西蘭大白兔5只，按照Pei等[11]方法進行SMSCs分離、培養，本研究獲第二軍醫大學醫學倫理委員會批準。無菌條件下取兔膝關節滑膜，將收集的滑膜剪成3～5 mm3碎塊，加入0.4%Ⅰ型膠原酶，37℃、5%CO2條件下消化，4 h后篩網過濾，濾液以800 × g離心10 min，去上清；細胞轉入75 cm2培養瓶中，于37℃、5%CO2條件下單層擴增培養7～14 d，培養基為含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM，隔天換液。倒置顯微鏡下觀察細胞生長和形態學特征。培養至90%融合時，以0.05% 胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶3比例傳代，第3代細胞為目的細胞。
1.2.2 SMSCs鑒定
① 流式細胞儀檢測細胞表面抗原：取第3代貼壁SMSCs，加入0.05%胰蛋白酶/EDTA消化，以800 × g離心10 min，PBS重懸并調整細胞密度為2.4 × 106個/mL。取細胞懸液100 μL，加入3 μL不同小鼠抗人單克隆熒光標記抗體（CD106-PE、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD14-FITC、CD71-FITC、CD105-PE）和相應同型對照抗體振蕩混勻，室溫避光放置30 min。每管加入2 mL含1%NaN3的PBS，混勻，以800 × g離心10 min，棄上清，振蕩重懸細胞。每管加入200 μL含0.1%多聚甲醛的PBS，混勻固定，4℃冰箱放置，流式細胞儀檢測，以CellQuest軟件分析陽性細胞百分比。
② 成脂誘導分化：取第3代貼壁SMSCs，以2 × 105個/cm2密度接種于24孔板中，待細胞融合達80%～90% 后，加入成脂誘導培養基（含10%FBS、100 U/ mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、0.5 μmol/L谷氨酰胺、0.5 μmol/L胰島素、0.5 μmol/L異丁基甲基黃嘌呤、0.5 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L DEX）誘導培養1、 14、21 d后，吸出誘導培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，油紅O染色30 min，倒置顯微鏡觀 察。
③ 成骨誘導分化：取第3代貼壁SMSCs，以2 × 105個/cm2密度接種于24孔板中，待細胞融合達80%～90% 后，加入成骨誘導培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、1 nmol/ L DEX、20 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C）誘導培養1、14、21 d后，吸出誘導培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，茜素紅染色，倒置顯微鏡觀察。
1.3 SMSCs成軟骨誘導分化
取第3代SMSCs，采用PELLET培養系統，將2 × 105個細胞接種于15 mL聚丙烯管中，以800 × g離心10 min，置于37℃、5%CO2條件下培養，加入基礎培養基（含2 ng/mL FGF-2、1 nmol/L維甲酸、50 mg/L維生素C、50 μg/mL磷酸酯、40 μg/mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、1%ITS）。為探究最佳成軟骨誘導細胞因子組合，將接種SMSCs后的聚丙烯管分成8組，依次編號為A～H。在基礎培養基基礎上，A組加10 ng/mL TGF-β3；B組加500 ng/mL BMP-2；C組加100 nmol/ L DEX；D組加10 ng/mL TGF-β3 + 500 ng/ mL BMP-2；E組加10 ng/mL TGF-β3 + 100 nmol/L DEX；F組加500 ng/mL BMP-2 + 100 nmol/L DEX；G組加10 ng/ mL TGF-β3 + 500 ng/mL BMP-2 + 100 nmol/L DEX；H組為空白對照組。各組細胞因子組合在誘導SMSCs成軟骨分化后各時間點，通過比較各組軟骨微球的直徑、重量，蛋白聚糖、Ⅱ型膠原表達，以及軟骨標志基因表達水平來評價各組細胞因子誘導成軟骨分化能力的大小，確定最佳成軟骨誘導細胞因子組合；并通過檢測各組軟骨微球DNA含量來評價軟骨微球重量增加與細胞增殖的關系。
1.3.1 微球直徑和重量檢測
成軟骨誘導培養21 d，用微標尺測量各組微球直徑；成軟骨誘導培養7、14、21 d，用計量儀檢測各組微球重量；每組檢測3個樣本，取均 值。
1.3.2 甲苯胺藍染色檢測蛋白聚糖表達
成軟骨誘導培養21 d，取各組軟骨微球，棄培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，石蠟包埋切片，片厚5 μm，脫蠟蒸餾水沖洗，甲苯胺藍染色，倒置顯微鏡下觀察蛋白聚糖表達。
1.3.3 免疫組織化學染色檢測Ⅱ型膠原表達
成軟骨誘導培養21 d，取各組軟骨微球，棄培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，室溫下以含4%山羊血清的PBS對細胞的非特異性結合位點封閉15 min。加入一抗Ⅱ型膠原，4℃孵育過夜；加入二抗Cy3標記的羊抗小鼠IgG（1∶150），室溫反應1 h，PBS洗3 次后DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察Ⅱ型膠原表達。
1.3.4 實時定量PCR（real
time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測成軟骨相關基因表達 成軟骨誘導培養0、1、7、14、21 d，取各組軟骨微球，以3 mg/mL膠原酶D于37℃溶解消化3 h。采用Trizol試劑盒提取軟骨微球中總RNA。以總RNA為模板，參照試劑盒說明書進行逆轉錄和PCR反應。逆轉錄采用25 μL反應體系：細胞RNA樣品2 μg，隨機引物Oligo dT 100 ng，10 mmol/L dNTP 1.5 μL，RNAsin 20 U，M-MLV 200 U，M-MLV Buffer 5 μL。反應條件：70℃、5 min，42℃、1 h，95℃、10 min，35個循環。PCR采用50 μL反應體系：cDNA 模板2 μL，10 × PCR緩沖液5 μL，10 mmol/ L dNTP 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶2.5 U，上、下游引物各 0.5 μL。反應條件：94℃、5 min，94℃、45 s，54～60℃、45 s，72℃、45 s，30～35個循環；72℃延伸5 min。檢測目的基因為SOX-9、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、BMP受體Ⅱ（BMP receptorⅡ，BMPR-Ⅱ）的表達，以GAPDH為參照基因，各基因引物序列見表 1。于21 d取RT-PCR擴增產物10 μL，于1%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光分析裝置拍攝擴增產物電泳圖。采用2-ΔΔCt方法計算各組基因相對表達量。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequence of each gene
1.3.5 軟骨微球DNA含量檢測
各組軟骨微球分化過程中，以2.4 × 105個未分化SMSCs的DNA含量為0 d值，7、14、21 d DNA含量分別為4、4、6個軟骨微球細胞總量的平均值（每個軟骨微球含細胞數約為8.0 × 105個）。各時間點軟骨微球以3 mg/mL膠原酶D于37℃溶解消化3 h，消化后細胞以1 mg/mL蛋白酶K于50℃溶解消化24 h。石碳酸/氯仿/異戊醇提取DNA。NanoDropND-1000微型分光光度計檢測DNA在260 nm波長處的吸光度（A）值，作為DNA含 量。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SMSCs形態學觀察及鑒定
2.1.1 SMSCs形態學觀察
原代細胞呈多邊形或星形；第1代細胞形態逐漸變成圓形和梭形；隨著傳代代次增加，細胞形態逐漸均勻一致，呈“向日葵”樣分布，第3代細胞呈梭形。見圖 1。
圖1
SMSCs形態學觀察（倒置顯微鏡× 100） ? 原代細胞 ? 第1代細胞 ? 第3代細胞 ? ?2.1.2 流式細胞儀檢測細胞表面抗原
MSCs特異性抗原CD44、CD106、CD105、CD90呈陽性表達，陽性表達率分別為99.45% ± 0.49%、99.52% ± 0.72%、99.91% ± 0.37%、99.12% ± 0.35%；而CD34、CD45、CD14、CD71呈陰性表達，陽性表達率分別為6.42% ± 2.11%、6.31% ± 3.70%、7.36% ± 5.12%、6.28% ± 4.64%。
2.1.3 SMSCs成脂、成骨誘導分化
成脂誘導14 d后，細胞質有脂滴出現；隨時間延長，脂滴逐漸增多、增大，細胞呈圓形，且相互融合；21 d后停止誘導，油紅O染色示脂滴呈環狀排列（圖 2 a）。成骨誘導1 d后，細胞質內可見不透光物質分泌和沉積，呈小點狀或片狀；14 d后可見細胞外基質中有少許鈣鹽沉積；21 d茜素紅染色細胞質可見棕黃色顆粒沉淀（圖 2 b）。
2.2 不同細胞因子組合對SMSCs成軟骨誘導分化的作用
2.2.1 微球直徑和重量檢測
成軟骨誘導培養21 d，A、B、C組軟骨微球大小較H組無明顯增加，微球直徑比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；D、E、F組軟骨微球大小較A、B、C組有所增加，微球直徑比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；G組軟骨微球顯著增大，微球直徑與其余各組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3、4。
成軟骨誘導培養7、14、21 d，A、B、C組軟骨微球重量較H組無明顯增加，差異無統計學意義（P＞ 0.05）；D、E、F組軟骨微球重量較A、B、C組明顯增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；G組軟骨微球重量顯著增加，與其余各組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。
2.2.2 甲苯胺藍染色檢測蛋白聚糖表達
成軟骨誘導培養21 d，A、B、C組蛋白聚糖表達呈陰性；E、F組有微弱蛋白聚糖表達，但明顯少于D、G組；G組有大量蛋白聚糖表達，明顯多于D組。見圖 6。
圖6
各組成軟骨誘導21 d甲苯胺藍染色觀察（倒置顯微鏡×100） ? D組 ? E組 ? F組 ? G組 ? ?2.2.3 免疫組織化學染色檢測Ⅱ型膠原表達
成軟骨誘導培養21 d，A、B、C組Ⅱ型膠原表達呈陰性；E、F組有微弱Ⅱ型膠原表達，但明顯少于D、G組；G組有大量Ⅱ型膠原表達，明顯多于D組。見圖 7。
2.2.4 RT-qPCR檢測軟骨相關基因表達
RT-qPCR檢測結果顯示，21 d時A、B、C組軟骨相關基因的表達水平顯著低于D、E、F、G組，D、E、F組顯著低于G組，差異均有統計學意義（P＜ 0.01）。見圖 8。其中G組誘導7 d 時Ⅱ型膠原基因首次表達，并隨時間延長表達增加；1 d時Ⅹ型膠原基因首次表達，之后表達量不斷增加；1～14 d時均可見SOX-9基因表達，并隨時間延長不斷增加，21 d時有所下降；1 d時可見Aggrecan基因大量表達，14 d時達峰值，隨后表達量逐漸減少；BMPR-Ⅱ基因表達隨時間延長不斷增加，7 d時達峰值，隨后表達量逐漸減少。見圖 9。
2.2.5 軟骨微球DNA含量檢測
成軟骨誘導培養7 d，各組軟骨微球DNA含量均較0 d時減少了約70%，14 d時減少約80%，且隨時間延長DNA含量繼續降低，21 d時減少約88%。各時間點間DNA含量比較差異均有統計學意義（P＜ 0.01）。見圖 10。
圖10
G組成軟骨誘導各時間點軟骨微球DNA含量變化
Figure10.
The change of DNA content of cell pellets at each time point in group G
3 討論
MSCs具有很強的自我復制和多向分化潛能，具有向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞及肌細胞等多種終末細胞定向分化的能力[2, 12]。滑膜中MSCs比例很高，少量滑膜組織即可獲得足量SMSCs，是BMSCs數目的100倍以上，且隨供體年齡增加，SMSCs數量未明顯減少[13]。與其他來源MSCs相比，SMSCs具有更好的成軟骨能力、更強的集落形成和擴增能力；另外，由于其取材簡便、對機體損傷小等優點，成為軟骨損傷修復理想的種子細胞來源[4]。本研究中，滑膜取自新西蘭大白兔膝關節，我們通過細胞形態觀察、流式細胞儀檢測細胞表面抗原及多向分化潛能檢測，結果顯示成功從兔膝關節處分離培養出了SMSCs。
本研究采用PELLET培養系統對SMSCs行成軟骨誘導分化。結果發現，不同組合細胞因子對軟骨微球直徑和重量作用不同。通過對G組單個軟骨微球DNA含量檢測發現，隨著時間推移，DNA含量越來越少，說明軟骨微球的變大、變重并不是細胞增殖的結果，而是由于細胞外基質合成增加引起[14]。提示可將軟骨微球直徑和重量作為評價SMSCs軟骨生成能力的指標之一。
本研究結果顯示，TGF-β3、BMP-2、DEX三者聯合具有最強的促軟骨形成能力，這與Rui等[15]報道結果相似。DEX具有促進細胞有絲分裂、抑制MSCs向脂肪細胞分化的功能，同時可與MSCs的糖皮質激素受體結合，激活細胞表面受體，從而促進MSCs向軟骨細胞分化[16]。Barry等[17]對TGF-β1、β2和β3誘導人MSCs成軟骨分化能力進行了比較，結果顯示TGF-β3和TGF-β2誘導形成的軟骨微球產生的細胞外基質較TGF-β1誘導形成的軟骨微球更多，且糖胺聚糖和Ⅱ型膠原含量也更多。本研究也表明TGF-β3能誘導兔SMSCs向軟骨細胞分化。TGF-β3與其Ⅱ型受體（TGFβR-Ⅱ）結合使其磷酸化，磷酸化的TGFβR-Ⅱ激活下游信號分子Smad2、3、4，磷酸化的Smad2、3、4被轉移至細胞核中調節軟骨相關基因SOX-9的表達，最終調節細胞的成軟骨分化能力[18]。此外，也有研究顯示TGF-β3可以增強SMSCs的增殖能力，并抑制其向骨、脂肪分化[17]。
BMP-2對促進SMSCs向軟骨細胞分化起著重要作用。Li等[19]利用TGF-β1體外誘導鼠BMSCs向軟骨細胞分化；但Shirasawa等[10]研究表明，單純使用TGF-β1不能充分誘導MSCs向軟骨細胞分化。邱林等[20]在BMP-2的基礎上，利用腺病毒介導TGF-β3轉染兔BMSCs，成功誘導了BMSCs向纖維軟骨細胞分化。Sekiya等[6]比較BMP-2、4、7體外促進BMSCs向軟骨細胞分化能力的研究發現，BMP-2誘導成軟骨能力最強。Shirasawa等[10]在探究體外誘導SMSCs向軟骨細胞分化的最佳細胞因子組合時發現，聯合使用BMP-2、TGF-β3及DEX產生的軟骨微球體積最大、重量最重、軟骨相關基因（SOX-9、Aggrecan、Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、BMPR-Ⅱ）表達最多，本研究也得到了相似結果。BMP-2與BMPR-Ⅱ結合使其磷酸化，磷酸化的BMPR-Ⅱ激活下游信號分子Smad1、5、8，磷酸化的Smad1、5、8被轉移至細胞核中調節軟骨相關基因的表達，最終調節細胞的成軟骨分化能力。在本研究中，BMP-2對TGF-β3誘導SMSCs成軟骨有促進作用，但BMPR-Ⅱ基因在BMP-2與TGF-β3聯合誘導SMSCs成軟骨分化過程中表達量明顯升高，而在TGF-β3單獨誘導過程中表達量卻明顯下降，說明TGF-β3對BMPR-Ⅱ基因的表達起抑制作用。但這種調節機制尚未深入探討，也是本研究不足之處。
Ⅹ型膠原基因通常作為軟骨細胞肥大的標準基因，一般認為其在軟骨細胞向肥大細胞分化時才開始表達[21]，但Mwale等[22]和Shen等[23]報道，在BMSCs向軟骨細胞分化過程中，Ⅹ型膠原基因與Ⅱ型膠原基因同步表達，甚至在其之前即開始表達。本研究中，在G組成軟骨誘導1 d后，Ⅹ型膠原基因表達水平明顯升高，而此時Ⅱ型膠原基因表達水平卻未明顯升高；在7 d時，可檢測到Ⅹ型膠原基因與Ⅱ型膠原基因同時高表達，與Mwale等[22]報道結果相似。
綜上述，本研究成功從新西蘭大白兔膝關節滑膜分離獲取了SMSCs。在SMSCs向軟骨細胞分化過程中，TGF-β3、BMP-2與DEX 3種細胞因子聯合誘導可以最大化促進SMSCs成軟骨分化，為應用SMSCs治療軟骨損傷奠定了實驗基礎。但本研究為體外實驗，在誘導SMSCs成軟骨分化過程中需不斷加入細胞因子，實驗操作有一定復雜性。根據Horie等[24]報道，將成軟骨誘導初級階段的SMSCs注射至半月板損傷模型中，可直接分化形成半月板細胞，不依賴外來因子的作用。因此，下一步我們將采用分離獲得的SMSCs移植修復半月板缺損，觀察其修復效果。
關節軟骨一旦損傷很難自我修復，學者們對如何促進軟骨修復進行了大量探索。采用自體軟骨細胞移植治療軟骨損傷預后較好，但由于細胞來源不足、細胞增殖能力有限以及供區損傷等缺點，限制了其臨床應用[1]。MSCs具有向軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞分化的能力，應用其修復軟骨損傷具有良好應用前景[2]。De Bari等[3]從人關節滑膜分離獲得滑膜MSCs（synovial MSCs，SMSCs），其比來源于骨髓、骨膜、脂肪及肌肉的MSCs具有更強的成軟骨、成骨及成脂肪分化能力，同時具有取材簡便、對機體損傷小等優點[4]，吸引了越來越多研究者關注。
MSCs成軟骨分化過程中，細胞因子的作用必不可少。Sekiya等[5]在研究BMSCs向軟骨細胞分化時發現，單純使用TGF-β1誘導作用不夠，必須添加BMP-6；Sekiya等[6]在研究SMSCs體外向軟骨細胞分化的最優條件時發現，TGF-β1和BMP-2聯合使用最為有效；Nishimura等[7]應用PELLET培養系統誘導SMSCs向軟骨細胞分化時發現，SMSCs在TGF-β1和地塞米松（dexamethasone，DEX）誘導作用下可分化為軟骨細胞。以上研究結果顯示，TGF-β、BMP及DEX均可促進MSCs向軟骨細胞分化。TGF-β1是常用的成軟骨誘導劑，但有研究顯示，與TGF-β1相比，TGF-β3誘導MSCs成軟骨能力更強[8-9]。Shirasawa等[10]研究表明，BMP-2能明顯提高TGF-β3誘導SMSCs向軟骨細胞分化的效率。目前關于細胞因子誘導BMSCs成軟骨分化的研究較多，最佳誘導條件也得到實驗驗證，但罕見關于誘導SMSCs成軟骨分化的最佳細胞因子條件的報道。本研究采用TGF-β3、BMP-2及DEX誘導兔SMSCs成軟骨分化，為探索SMSCs向軟骨細胞分化的最優條件奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10～16月齡新西蘭大白兔5只，雌雄不限，體重1.8～2.5 kg，由第二軍醫大學動物實驗中心提供。
DMEM培養液、0.05%胰蛋白酶/EDTA（GIBCO/BRL公司，美國）；一抗Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、DEX、2-磷酸-抗壞血酸、L-脯氨酸、丙酮酸鹽（Sigma公司，美國）；TGF-β3、胰島素、胰島素鐵硒傳遞蛋白（insulin-transferrin-selenium，ITS）+ Premix（R&D公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；Oligo dT、dNTP、焦碳酸二乙酯和各PCR引物（上海吉凱生物技術有限公司）；逆轉錄酶M-MLV（Fermentas公司，加拿大）；rTaq DNA 合成酶、100 bp DNA Ladder（Takara公司，日本）；Ⅰ、Ⅱ型膠原IgG（Monosan公司，美國）；小鼠抗人角蛋白19單克隆即用型抗體、小鼠抗人波形蛋白單克隆即用型抗體、DR-PE、二步法抗兔/鼠通用型免疫組織化學檢測試劑盒（上海基因科技有限公司）；小鼠抗人單克隆熒光標記抗體CD106-PE、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD14-FITC、CD71-FITC、CD105-PE（BD公司，美國）；BMP-2（山之內制藥，日本）。
CO2培養箱（Thermo Forma公司，美國）；SBD 50恒溫水浴搖床（Heto公司，丹麥）；SMZ 645型光學顯微鏡（Nikon公司，日本）；IX70型熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；流式細胞儀（BD公司，美國）；CellQuest軟件（Becton Dickinson公司，美國）。
1.2 SMSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 SMSCs分離及培養
取新西蘭大白兔5只，按照Pei等[11]方法進行SMSCs分離、培養，本研究獲第二軍醫大學醫學倫理委員會批準。無菌條件下取兔膝關節滑膜，將收集的滑膜剪成3～5 mm3碎塊，加入0.4%Ⅰ型膠原酶，37℃、5%CO2條件下消化，4 h后篩網過濾，濾液以800 × g離心10 min，去上清；細胞轉入75 cm2培養瓶中，于37℃、5%CO2條件下單層擴增培養7～14 d，培養基為含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的H-DMEM，隔天換液。倒置顯微鏡下觀察細胞生長和形態學特征。培養至90%融合時，以0.05% 胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶3比例傳代，第3代細胞為目的細胞。
1.2.2 SMSCs鑒定
① 流式細胞儀檢測細胞表面抗原：取第3代貼壁SMSCs，加入0.05%胰蛋白酶/EDTA消化，以800 × g離心10 min，PBS重懸并調整細胞密度為2.4 × 106個/mL。取細胞懸液100 μL，加入3 μL不同小鼠抗人單克隆熒光標記抗體（CD106-PE、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD14-FITC、CD71-FITC、CD105-PE）和相應同型對照抗體振蕩混勻，室溫避光放置30 min。每管加入2 mL含1%NaN3的PBS，混勻，以800 × g離心10 min，棄上清，振蕩重懸細胞。每管加入200 μL含0.1%多聚甲醛的PBS，混勻固定，4℃冰箱放置，流式細胞儀檢測，以CellQuest軟件分析陽性細胞百分比。
② 成脂誘導分化：取第3代貼壁SMSCs，以2 × 105個/cm2密度接種于24孔板中，待細胞融合達80%～90% 后，加入成脂誘導培養基（含10%FBS、100 U/ mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、0.5 μmol/L谷氨酰胺、0.5 μmol/L胰島素、0.5 μmol/L異丁基甲基黃嘌呤、0.5 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L DEX）誘導培養1、 14、21 d后，吸出誘導培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，油紅O染色30 min，倒置顯微鏡觀 察。
③ 成骨誘導分化：取第3代貼壁SMSCs，以2 × 105個/cm2密度接種于24孔板中，待細胞融合達80%～90% 后，加入成骨誘導培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、1 nmol/ L DEX、20 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C）誘導培養1、14、21 d后，吸出誘導培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，茜素紅染色，倒置顯微鏡觀察。
1.3 SMSCs成軟骨誘導分化
取第3代SMSCs，采用PELLET培養系統，將2 × 105個細胞接種于15 mL聚丙烯管中，以800 × g離心10 min，置于37℃、5%CO2條件下培養，加入基礎培養基（含2 ng/mL FGF-2、1 nmol/L維甲酸、50 mg/L維生素C、50 μg/mL磷酸酯、40 μg/mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、1%ITS）。為探究最佳成軟骨誘導細胞因子組合，將接種SMSCs后的聚丙烯管分成8組，依次編號為A～H。在基礎培養基基礎上，A組加10 ng/mL TGF-β3；B組加500 ng/mL BMP-2；C組加100 nmol/ L DEX；D組加10 ng/mL TGF-β3 + 500 ng/ mL BMP-2；E組加10 ng/mL TGF-β3 + 100 nmol/L DEX；F組加500 ng/mL BMP-2 + 100 nmol/L DEX；G組加10 ng/ mL TGF-β3 + 500 ng/mL BMP-2 + 100 nmol/L DEX；H組為空白對照組。各組細胞因子組合在誘導SMSCs成軟骨分化后各時間點，通過比較各組軟骨微球的直徑、重量，蛋白聚糖、Ⅱ型膠原表達，以及軟骨標志基因表達水平來評價各組細胞因子誘導成軟骨分化能力的大小，確定最佳成軟骨誘導細胞因子組合；并通過檢測各組軟骨微球DNA含量來評價軟骨微球重量增加與細胞增殖的關系。
1.3.1 微球直徑和重量檢測
成軟骨誘導培養21 d，用微標尺測量各組微球直徑；成軟骨誘導培養7、14、21 d，用計量儀檢測各組微球重量；每組檢測3個樣本，取均 值。
1.3.2 甲苯胺藍染色檢測蛋白聚糖表達
成軟骨誘導培養21 d，取各組軟骨微球，棄培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，石蠟包埋切片，片厚5 μm，脫蠟蒸餾水沖洗，甲苯胺藍染色，倒置顯微鏡下觀察蛋白聚糖表達。
1.3.3 免疫組織化學染色檢測Ⅱ型膠原表達
成軟骨誘導培養21 d，取各組軟骨微球，棄培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，室溫下以含4%山羊血清的PBS對細胞的非特異性結合位點封閉15 min。加入一抗Ⅱ型膠原，4℃孵育過夜；加入二抗Cy3標記的羊抗小鼠IgG（1∶150），室溫反應1 h，PBS洗3 次后DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察Ⅱ型膠原表達。
1.3.4 實時定量PCR（real
time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測成軟骨相關基因表達 成軟骨誘導培養0、1、7、14、21 d，取各組軟骨微球，以3 mg/mL膠原酶D于37℃溶解消化3 h。采用Trizol試劑盒提取軟骨微球中總RNA。以總RNA為模板，參照試劑盒說明書進行逆轉錄和PCR反應。逆轉錄采用25 μL反應體系：細胞RNA樣品2 μg，隨機引物Oligo dT 100 ng，10 mmol/L dNTP 1.5 μL，RNAsin 20 U，M-MLV 200 U，M-MLV Buffer 5 μL。反應條件：70℃、5 min，42℃、1 h，95℃、10 min，35個循環。PCR采用50 μL反應體系：cDNA 模板2 μL，10 × PCR緩沖液5 μL，10 mmol/ L dNTP 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶2.5 U，上、下游引物各 0.5 μL。反應條件：94℃、5 min，94℃、45 s，54～60℃、45 s，72℃、45 s，30～35個循環；72℃延伸5 min。檢測目的基因為SOX-9、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、BMP受體Ⅱ（BMP receptorⅡ，BMPR-Ⅱ）的表達，以GAPDH為參照基因，各基因引物序列見表 1。于21 d取RT-PCR擴增產物10 μL，于1%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光分析裝置拍攝擴增產物電泳圖。采用2-ΔΔCt方法計算各組基因相對表達量。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequence of each gene
1.3.5 軟骨微球DNA含量檢測
各組軟骨微球分化過程中，以2.4 × 105個未分化SMSCs的DNA含量為0 d值，7、14、21 d DNA含量分別為4、4、6個軟骨微球細胞總量的平均值（每個軟骨微球含細胞數約為8.0 × 105個）。各時間點軟骨微球以3 mg/mL膠原酶D于37℃溶解消化3 h，消化后細胞以1 mg/mL蛋白酶K于50℃溶解消化24 h。石碳酸/氯仿/異戊醇提取DNA。NanoDropND-1000微型分光光度計檢測DNA在260 nm波長處的吸光度（A）值，作為DNA含 量。
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SMSCs形態學觀察及鑒定
2.1.1 SMSCs形態學觀察
原代細胞呈多邊形或星形；第1代細胞形態逐漸變成圓形和梭形；隨著傳代代次增加，細胞形態逐漸均勻一致，呈“向日葵”樣分布，第3代細胞呈梭形。見圖 1。
圖1
SMSCs形態學觀察（倒置顯微鏡× 100） ? 原代細胞 ? 第1代細胞 ? 第3代細胞 ? ?2.1.2 流式細胞儀檢測細胞表面抗原
MSCs特異性抗原CD44、CD106、CD105、CD90呈陽性表達，陽性表達率分別為99.45% ± 0.49%、99.52% ± 0.72%、99.91% ± 0.37%、99.12% ± 0.35%；而CD34、CD45、CD14、CD71呈陰性表達，陽性表達率分別為6.42% ± 2.11%、6.31% ± 3.70%、7.36% ± 5.12%、6.28% ± 4.64%。
2.1.3 SMSCs成脂、成骨誘導分化
成脂誘導14 d后，細胞質有脂滴出現；隨時間延長，脂滴逐漸增多、增大，細胞呈圓形，且相互融合；21 d后停止誘導，油紅O染色示脂滴呈環狀排列（圖 2 a）。成骨誘導1 d后，細胞質內可見不透光物質分泌和沉積，呈小點狀或片狀；14 d后可見細胞外基質中有少許鈣鹽沉積；21 d茜素紅染色細胞質可見棕黃色顆粒沉淀（圖 2 b）。
2.2 不同細胞因子組合對SMSCs成軟骨誘導分化的作用
2.2.1 微球直徑和重量檢測
成軟骨誘導培養21 d，A、B、C組軟骨微球大小較H組無明顯增加，微球直徑比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；D、E、F組軟骨微球大小較A、B、C組有所增加，微球直徑比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；G組軟骨微球顯著增大，微球直徑與其余各組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3、4。
成軟骨誘導培養7、14、21 d，A、B、C組軟骨微球重量較H組無明顯增加，差異無統計學意義（P＞ 0.05）；D、E、F組軟骨微球重量較A、B、C組明顯增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；G組軟骨微球重量顯著增加，與其余各組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。
2.2.2 甲苯胺藍染色檢測蛋白聚糖表達
成軟骨誘導培養21 d，A、B、C組蛋白聚糖表達呈陰性；E、F組有微弱蛋白聚糖表達，但明顯少于D、G組；G組有大量蛋白聚糖表達，明顯多于D組。見圖 6。
圖6
各組成軟骨誘導21 d甲苯胺藍染色觀察（倒置顯微鏡×100） ? D組 ? E組 ? F組 ? G組 ? ?2.2.3 免疫組織化學染色檢測Ⅱ型膠原表達
成軟骨誘導培養21 d，A、B、C組Ⅱ型膠原表達呈陰性；E、F組有微弱Ⅱ型膠原表達，但明顯少于D、G組；G組有大量Ⅱ型膠原表達，明顯多于D組。見圖 7。
2.2.4 RT-qPCR檢測軟骨相關基因表達
RT-qPCR檢測結果顯示，21 d時A、B、C組軟骨相關基因的表達水平顯著低于D、E、F、G組，D、E、F組顯著低于G組，差異均有統計學意義（P＜ 0.01）。見圖 8。其中G組誘導7 d 時Ⅱ型膠原基因首次表達，并隨時間延長表達增加；1 d時Ⅹ型膠原基因首次表達，之后表達量不斷增加；1～14 d時均可見SOX-9基因表達，并隨時間延長不斷增加，21 d時有所下降；1 d時可見Aggrecan基因大量表達，14 d時達峰值，隨后表達量逐漸減少；BMPR-Ⅱ基因表達隨時間延長不斷增加，7 d時達峰值，隨后表達量逐漸減少。見圖 9。
2.2.5 軟骨微球DNA含量檢測
成軟骨誘導培養7 d，各組軟骨微球DNA含量均較0 d時減少了約70%，14 d時減少約80%，且隨時間延長DNA含量繼續降低，21 d時減少約88%。各時間點間DNA含量比較差異均有統計學意義（P＜ 0.01）。見圖 10。
圖10
G組成軟骨誘導各時間點軟骨微球DNA含量變化
Figure10.
The change of DNA content of cell pellets at each time point in group G
3 討論
MSCs具有很強的自我復制和多向分化潛能，具有向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞及肌細胞等多種終末細胞定向分化的能力[2, 12]。滑膜中MSCs比例很高，少量滑膜組織即可獲得足量SMSCs，是BMSCs數目的100倍以上，且隨供體年齡增加，SMSCs數量未明顯減少[13]。與其他來源MSCs相比，SMSCs具有更好的成軟骨能力、更強的集落形成和擴增能力；另外，由于其取材簡便、對機體損傷小等優點，成為軟骨損傷修復理想的種子細胞來源[4]。本研究中，滑膜取自新西蘭大白兔膝關節，我們通過細胞形態觀察、流式細胞儀檢測細胞表面抗原及多向分化潛能檢測，結果顯示成功從兔膝關節處分離培養出了SMSCs。
本研究采用PELLET培養系統對SMSCs行成軟骨誘導分化。結果發現，不同組合細胞因子對軟骨微球直徑和重量作用不同。通過對G組單個軟骨微球DNA含量檢測發現，隨著時間推移，DNA含量越來越少，說明軟骨微球的變大、變重并不是細胞增殖的結果，而是由于細胞外基質合成增加引起[14]。提示可將軟骨微球直徑和重量作為評價SMSCs軟骨生成能力的指標之一。
本研究結果顯示，TGF-β3、BMP-2、DEX三者聯合具有最強的促軟骨形成能力，這與Rui等[15]報道結果相似。DEX具有促進細胞有絲分裂、抑制MSCs向脂肪細胞分化的功能，同時可與MSCs的糖皮質激素受體結合，激活細胞表面受體，從而促進MSCs向軟骨細胞分化[16]。Barry等[17]對TGF-β1、β2和β3誘導人MSCs成軟骨分化能力進行了比較，結果顯示TGF-β3和TGF-β2誘導形成的軟骨微球產生的細胞外基質較TGF-β1誘導形成的軟骨微球更多，且糖胺聚糖和Ⅱ型膠原含量也更多。本研究也表明TGF-β3能誘導兔SMSCs向軟骨細胞分化。TGF-β3與其Ⅱ型受體（TGFβR-Ⅱ）結合使其磷酸化，磷酸化的TGFβR-Ⅱ激活下游信號分子Smad2、3、4，磷酸化的Smad2、3、4被轉移至細胞核中調節軟骨相關基因SOX-9的表達，最終調節細胞的成軟骨分化能力[18]。此外，也有研究顯示TGF-β3可以增強SMSCs的增殖能力，并抑制其向骨、脂肪分化[17]。
BMP-2對促進SMSCs向軟骨細胞分化起著重要作用。Li等[19]利用TGF-β1體外誘導鼠BMSCs向軟骨細胞分化；但Shirasawa等[10]研究表明，單純使用TGF-β1不能充分誘導MSCs向軟骨細胞分化。邱林等[20]在BMP-2的基礎上，利用腺病毒介導TGF-β3轉染兔BMSCs，成功誘導了BMSCs向纖維軟骨細胞分化。Sekiya等[6]比較BMP-2、4、7體外促進BMSCs向軟骨細胞分化能力的研究發現，BMP-2誘導成軟骨能力最強。Shirasawa等[10]在探究體外誘導SMSCs向軟骨細胞分化的最佳細胞因子組合時發現，聯合使用BMP-2、TGF-β3及DEX產生的軟骨微球體積最大、重量最重、軟骨相關基因（SOX-9、Aggrecan、Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、BMPR-Ⅱ）表達最多，本研究也得到了相似結果。BMP-2與BMPR-Ⅱ結合使其磷酸化，磷酸化的BMPR-Ⅱ激活下游信號分子Smad1、5、8，磷酸化的Smad1、5、8被轉移至細胞核中調節軟骨相關基因的表達，最終調節細胞的成軟骨分化能力。在本研究中，BMP-2對TGF-β3誘導SMSCs成軟骨有促進作用，但BMPR-Ⅱ基因在BMP-2與TGF-β3聯合誘導SMSCs成軟骨分化過程中表達量明顯升高，而在TGF-β3單獨誘導過程中表達量卻明顯下降，說明TGF-β3對BMPR-Ⅱ基因的表達起抑制作用。但這種調節機制尚未深入探討，也是本研究不足之處。
Ⅹ型膠原基因通常作為軟骨細胞肥大的標準基因，一般認為其在軟骨細胞向肥大細胞分化時才開始表達[21]，但Mwale等[22]和Shen等[23]報道，在BMSCs向軟骨細胞分化過程中，Ⅹ型膠原基因與Ⅱ型膠原基因同步表達，甚至在其之前即開始表達。本研究中，在G組成軟骨誘導1 d后，Ⅹ型膠原基因表達水平明顯升高，而此時Ⅱ型膠原基因表達水平卻未明顯升高；在7 d時，可檢測到Ⅹ型膠原基因與Ⅱ型膠原基因同時高表達，與Mwale等[22]報道結果相似。
綜上述，本研究成功從新西蘭大白兔膝關節滑膜分離獲取了SMSCs。在SMSCs向軟骨細胞分化過程中，TGF-β3、BMP-2與DEX 3種細胞因子聯合誘導可以最大化促進SMSCs成軟骨分化，為應用SMSCs治療軟骨損傷奠定了實驗基礎。但本研究為體外實驗，在誘導SMSCs成軟骨分化過程中需不斷加入細胞因子，實驗操作有一定復雜性。根據Horie等[24]報道，將成軟骨誘導初級階段的SMSCs注射至半月板損傷模型中，可直接分化形成半月板細胞，不依賴外來因子的作用。因此，下一步我們將采用分離獲得的SMSCs移植修復半月板缺損，觀察其修復效果。
