引用本文： 李玉瑩, 文泳鑒, 鐘少琦, 楊鑫敏, 姚林波, 王雯, 劉婷婷, 黃偉, 孫鑫, 夏慶. 柴芩承氣湯對急性胰腺炎動物模型血清脂質代謝的調控作用. 華西醫學, 2023, 38(11): 1701-1708. doi: 10.7507/1002-0179.202303020 復制
急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是臨床上常見的消化系統疾病之一，是一種由胰酶異常激活引起胰腺組織自身消化進而導致胰腺局部水腫、炎癥細胞浸潤甚至壞死的急腹癥[1-2]，近年來全球發病率逐年升高[3-5]。重癥 AP（severe AP, SAP）占比約為 20%[1]，具有進展迅猛、病程復雜、致死率高等特點，造成嚴重的公共衛生和社會經濟負擔[6]。柴芩承氣湯（chaiqin chengqi decoction, CQCQD）是四川大學華西醫院長期用于治療 AP 的臨床驗方，團隊系列基礎研究發現其可通過多途徑、多靶點改善 AP 的胰腺損傷及相關的器官功能障礙[7-10]。此外，既往關于 AP 患者與動物模型循環代謝物的研究均發現蛋白質、碳水化合物、脂質代謝等多種營養物質代謝紊亂[11-12]，團隊進一步研究發現 CQCQD 可逆轉胰腺代謝軌跡尤其是谷胱甘肽代謝途徑[12]。然而，目前尚未有研究探討 CQCQD 對 AP 血清中脂質代謝物的影響，因此本研究采用脂質組學技術靶向 375 種脂質分子定量檢測探討 CQCQD 對雨蛙素誘導的 AP 小鼠血清中具體脂質分子類型及水平的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
27 只無特定病原體雄性 C57BL/6 小鼠，鼠齡 8～11 周，體重 18～22 g，購自河北伊維沃生物科技有限公司。本實驗操作過程均遵循國家及學校相關規定，并通過四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會認證（倫理備案號：20221221002）。
1.2 藥物與試劑
1.2.1 藥物
大黃 20 g、芒硝 20 g、厚樸 20 g、枳實 15 g、柴胡 15 g、黃芩 15 g、茵陳 15 g、梔子 20 g，均購自四川省中醫院，并根據團隊既往方法制備 CQCQD 凍干粉[13]。
1.2.2 試劑
雨蛙素（美國 Tocris 公司）；二喹啉甲酸法蛋白濃度檢測試劑盒（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、10% 中性甲醛溶液、二甲基亞砜、十六烷基三甲基溴化銨、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（美國 Sigma 公司）；蛋白酶抑制劑（瑞士 Roche 公司）；乙二胺四乙酸二鈉鹽（上海生工公司）；雙氧水（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。
1.3 主要儀器與設備
5424R 低溫高速小離心機（德國 Eppendorf 公司）；普通顯微鏡（德國 Zeiss 公司）；pH 計、XP205 電子天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）；CLARIOstar 全功能多功能酶標儀（德國 BMG 公司）；全自動生化分析儀（德國 Roche 公司）；超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（美國 Waters 公司）；Allegra X-15R 臺式冷凍離心機（美國 Beckman 公司）；GL-3250A 恒溫磁力攪拌棒、TS-1000 水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；MSC-100 恒溫混勻儀（杭州奧盛儀器有限公司）。
1.4 造模、給藥與取材
將 27 只小鼠按照完全隨機法分成 3 組，每組 9 只，即對照組（CON 組）、AP 模型組（AP 組）、AP 加 CQCQD 組（APQ 組）。實驗開始前 12 h 禁食，不禁水。AP 組與 APQ 組均采用間隔 1 h 共 7 次的雨蛙素（50 μg/kg）腹腔注射以誘導 AP 模型，CON 組則接受同頻次、等體積的磷酸鹽緩沖液腹腔注射[14]。團隊既往研究顯示，在雨蛙素誘導的 AP 小鼠中 CQCQD 的臨床等效劑量（5.5 g/kg）具有最好的療效[13]。將 CQCQD 以 3.85 g/kg（0.13 g/mL）的劑量溶解于無菌水中，APQ 組分別在造模 1、5、9 h 給予 CQCQD 灌胃治療，劑量相當于生藥 5.5 g/kg[13]。AP 組給予等量無菌水灌胃，CON 組不予灌胃。
第 1 次雨蛙素或磷酸鹽緩沖液注射后 12 h 收集血液和組織樣本，檢測各組小鼠血清生化指標、病理改變情況綜合評價 AP 模型嚴重程度及 CQCQD 療效。所有小鼠采取眼球取血，血液樣本室溫下靜置 30 min 后，1500×g、室溫離心 15 min 后獲得待測血清，保存于?80℃冰箱中備用。取血后迅速打開腹腔，取出小鼠胰腺組織并分為兩部分，將胰體完整部分放入包埋盒，并浸泡于 10% 中性甲醛溶液中固定 48 h 以上待用；胰頭則液氮速凍，后凍存于?80℃冰箱中，用于測定髓過氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）。
1.5 檢測指標及方法
1.5.1 胰腺組織病理檢查
對 10% 中性甲醛溶液固定后的胰腺組織脫水、石蠟包埋并切片，使用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色。2 位研究人員雙盲對 HE 染色胰腺組織進行觀察和病理評分，將切片置于顯微鏡下，先于低倍鏡（4×）下觀察切片整體情況，再于高倍鏡（20×）下隨機選取 10 個具有代表性的實驗拍照，并根據文獻[14]的評分標準從水腫、炎癥細胞浸潤和壞死 3 個方面進行評分，三者之和為病理總分。
1.5.2 胰腺組織 MPO 檢測
按照團隊既往方法測定胰腺組織中的 MPO 活性[8, 15-16]，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。
1.5.3 血清胰淀粉酶、脂肪酶水平檢測
使用全自動生化儀檢測血清胰淀粉酶、脂肪酶。
1.5.4 血清脂質組學研究
① 樣品制備：樣品在冰浴下解凍。吸取 10 μL 血清樣品于 96 孔板中，加入 300 μL 脂質提取溶劑，渦旋混合 20 min，然后將 96 孔板以 4000×g 的速度離心 20 min，轉移 20 μL 上清液于新的 96 孔板中，并與 80 μL 脂質稀釋溶劑混合，用于超高效液相色譜-質譜分析。質量控制（質控）樣品為該批所用樣品的進樣溶液取 10 μL 合并而來。
② 色譜條件：色譜柱為 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μmol/L 分析柱（2.1 mm×100 mm）。流動相含 A 液與 B 液，A 液中乙腈∶水為 6∶4，B 液中異丙醇∶乙腈為 9∶1，流動相的酸堿度使用 5 mmol/L 甲酸銨+0.1% 甲酸進行調節。樣品注射體積為 2 μL，流速為 0.3 mL/min，柱溫為 45℃。洗脫條件為第 0～0.5 分鐘，60% B 液；第 0.5～3 分鐘，60%→80% B 液；第 3～7 分鐘，80%→100% B 液；第 7～9 分鐘，100% B 液；第 9～9.5 分鐘，100%→60% B 液；第 9.5～11 分鐘 60% B 液。
③ 質譜條件：毛細管電壓 3.0 kV（電噴霧正離子模式），離子源溫度 150℃，脫溶劑溫度 550℃，脫溶劑氣流速 1000 L/h，碰撞氣流速 0.13 L/h。
④ 上樣順序：待測樣本按照組別信息進行隨機測樣。質控樣本穿插于整體樣本中進行檢測。
1.6 統計學方法
應用 GraphPad Prism 8 軟件進行數據處理及圖表可視化。通過 Shapiro-Wilk 檢驗對計量資料進行正態性檢驗，符合正態分布的以均數±標準差表示，不符合正態分布的以中位數（下四分位數，上四分位數）表示。服從正態分布的數據中，符合方差齊性的數據采用單因素方差分析進行多組間比較，采用 Dunnett-t 檢驗進行兩組間比較（AP 組為對照）；不符合方差齊性的數據，則采用 Brown-Forsythe 檢驗進行多組間比較，采用 Dunnett T3 檢驗進行兩組間比較（AP 組為對照）。不服從正態分布性的數據多組間比較采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，兩組間比較采用 Dunn 檢驗（AP 組為對照），并采用 Hodges-Lehmann 估計兩組間的中位數差及 95% 置信區間（confidence interval, CI）。雙側檢驗水準 α=0.05。
采用 MassLynx 軟件（美國 Waters 公司）對超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀生成的原始數據文件進行處理，對每一個脂質進行峰提取、積分和定量。為了探討 CQCQD 對雨蛙素誘導的 AP 小鼠血清脂質輪廓的干預效應，采用 iMAP 軟件（上海麥特繪譜生物科技有限公司），分別對各組小鼠血清（CON 組 vs. AP 組和 AP 組 vs. APQ 組）進行正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）等多維統計分析。對 OPLS-DA 模型進行 1000 次隨機打亂樣本分組的隨機置換檢驗以驗證模型是否存在過擬合。對不同的脂質亞類進行統計分析，并以變量投影重要性>1.0、P<0.05（依據數據的正態性和方差齊性選取成組 t 檢驗或 Mann-Whitney U 檢驗），和|log2FC|≥0［FC：組間變化倍數（fold change）］這 3 個條件作為標準篩選兩組間的脂質差異代謝物。對含不同飽和度脂肪酰基（飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸）的溶血磷脂酰乙醇胺（lyso-phosphatidylethanolamine, LPE）及不同的 LPE 脂質分子進行統計分析篩選潛在的生物標志物。
2 結果
2.1 CQCQD 改善 AP 小鼠胰腺損傷
小鼠胰腺組織 HE 染色結果顯示，CON 組胰腺組織結構完整，染色均勻，胰腺組織無水腫、炎癥細胞浸潤和腺泡細胞壞死；AP 組胰腺組織水腫，廣泛的小葉間間隙增寬，伴有腺泡細胞的破壞，導管及部分實質有炎性細胞浸潤，導管周圍存在點狀壞死；相較于 AP 組，APQ 組胰腺水腫、炎癥浸潤及壞死均有顯著改善。見圖1。
圖1
各組小鼠胰腺組織病理檢查（HE ×200）
CON：對照組；AP：急性胰腺炎模型組；APQ：急性胰腺炎模型+柴芩承氣湯治療組；HE：蘇木精-伊紅染色
與 CON 組相比，AP 組胰腺水腫、炎癥浸潤、壞死和病理總分，血清淀粉酶、脂肪酶水平，以及胰 MPO 活性均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 AP 組相比，APQ 組胰腺炎癥浸潤、壞死和病理總分以及血清淀粉酶水平明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；胰腺組織水腫評分、血清脂肪酶水平和 MPO 活性差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
各組小鼠胰腺損傷指標（n=9，x±s）
2.2 CQCQD 對 AP 小鼠血清脂質輪廓的影響
2.2.1 脂質代謝物鑒定
本研究靶向 375 種脂質分子進行定量檢測，檢測出 319 種不同的脂質代謝物，覆蓋 12 個亞類。本研究中固醇酯含量占檢測總脂質含量的 94.75%，包括 15 種膽固醇酯；甘油酯含量占 4.30%，包括 48 種甘油三酯和 20 種甘油二酯；甘油磷脂含量占 0.85%，其中包括 80 種磷脂酰膽堿、44 種磷脂酰乙醇胺、20 種溶血磷脂酰膽堿、17 種磷脂酰絲氨酸、14 種磷脂酰肌醇和 12 種 LPE；鞘磷脂類含量占 0.11%，包括 30 種鞘磷脂、18 種神經酰胺和 1 種神經酰胺磷酸乙醇胺。
2.2.2 CQCQD 干預影響 AP 介導的血清脂質輪廓改變
為了探討 CQCQD 對雨蛙素誘導的 AP 小鼠血清脂質輪廓的干預效應，分別對各組小鼠血清（CON 組 vs. AP 組和 AP 組 vs. APQ 組）進行 OPLS-DA 分析，結果如圖2a、2b 所示，各組樣本脂質譜分離程度高，表明組間血清脂質輪廓整體可能存在差異。其中，CON 組 vs. AP 組的 OPLS-DA 分析中，R2X、R2Y、Q2Y 參數分別為 0.564、0.974、0.862；AP 組 vs. APQ 組的 OPLS-DA 分析中，R2X、R2Y、Q2Y 參數分別為 0.333、0.884、0.466。兩個 OPLS-DA 模型的置換檢驗均提示 Q2Y>0.2，且 Q2Y 擬合曲線在 Y 軸上的截距<0，說明這 2 個模型均具有良好的解釋能力和預測能力。見圖2c、2d。
圖2
各組小鼠血清脂質輪廓特征
a. CON 組與 AP 組血清脂質 OPLS-DA 分析得分圖；b. AP 組與 APQ 組血清脂質 OPLS-DA 分析得分圖；c. CON 組與 AP 組 OPLS-DA 模型的置換檢驗；d. AP 組與 APQ 組 OPLS-DA 模型的置換檢驗。CON 組：對照組；AP 組：急性胰腺炎模型組；APQ 組：急性胰腺炎模型+柴芩承氣湯治療組；OPLS-DA：正交偏最小二乘法判別分析；P1：第一主成分；O1：正交主成分
2.3 CQCQD 對 AP 小鼠血清脂質分子和含量的影響
2.3.1 CQCQD 部分挽救 AP 介導的血清 LPE 改變
與 CON 組相比，AP 組小鼠膽固醇酯、甘油二酯、鞘磷脂、神經酰胺、神經酰胺磷酸乙醇胺、LPE、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸的含量均有不同程度的升高，且差異有統計學意義（P<0.05），兩組間甘油三酯、溶血磷脂酰膽堿含量差異無統計學意義（P>0.05）。與 AP 組相比，APQ 組小鼠血清脂質譜中 LPE 降低且差異有統計學意義（P<0.05），其余脂質亞類差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
表2
各組小鼠血清不同脂質亞類相對豐度變化（n=9，x±s）
CON 組與 AP 組共篩選出差異脂質分子 158 種，所有差異代謝物均在 AP 組明顯升高；AP 組與 APQ 組則共篩選出差異脂質分子 29 種，其中 7 種差異代謝物在 APQ 組明顯升高；另外 22 種則明顯降低。其中共有 13 種脂質分子（9 種 LPE、2 種磷脂酰膽堿、1 種磷脂酰乙醇胺、1 種膽固醇酯）含量組間變化呈相反趨勢：AP 組含量較 CON 組升高，APQ 組含量則較 AP 組下降。見圖3。
圖3
CQCQD 對 AP 小鼠血清脂質分子影響熱圖
CON：對照組；AP：急性胰腺炎模型組；APQ：急性胰腺炎模型+柴芩承氣湯治療組；LPE：溶血磷脂酰乙醇胺；PC：磷脂酰膽堿；PE：磷脂酰乙醇胺；CE：膽固醇酯；CQCQD：柴芩承氣湯
2.3.2 CQCQD 對 AP 小鼠血清含不同脂肪酰基 LPE 脂質的影響
與 CON 組小鼠相比，AP 組小鼠血清中含飽和脂肪酰基、單不飽和脂肪酰基和多不飽和脂肪酰基的 LPE 明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與 AP 組相比，APQ 組 3 種含不同脂肪酰基的 LPE 水平均較 AP 組降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。
表3
各組小鼠血清含不同脂肪酰基 LPE 相對豐度變化（n=9，x±s）
2.3.3 篩選潛在 LPE 分子生物標志物
本研究共鑒定出 12 種 LPE 脂質成分，其中 LPE（16∶0）、LPE（18∶1）、LPE（18∶2）、LPE（20∶3）、LPE（20∶4）及 LPE（22∶5）6 種 LPE 分子水平在 AP 組上調，在 APQ 組相對 AP 組下調，可作為 CQCQD 干預 AP 的潛在生物標志物。見圖4。
圖4
CQCQD 干預 AP 血清潛在生物標志物
CON：對照組；AP：急性胰腺炎模型組；APQ：急性胰腺炎模型+柴芩承氣湯治療組；LPE：溶血磷脂酰乙醇胺。*
3 討論
CQCQD 在治療 AP 的臨床治療實踐中表現出顯著的療效。本研究結果表明，CQCQD 能夠顯著改善雨蛙素誘導的 AP 小鼠的胰腺組織炎癥、壞死程度以及血清淀粉酶水平，進一步證實了 CQCQD 對 AP 嚴重程度的改善作用。
脂質作為細胞的基本組成部分，在炎癥相關性疾病發生時出現明顯的代謝紊亂并調節多種細胞反應[17]。既往研究發現，AP 可介導多種營養物質的代謝紊亂，而脂質代謝是其重要組成部分[11-12]。本研究采用超高效液相色譜質譜技術對小鼠血清進行靶向脂質組學檢測，共鑒定出脂類 319 種（94.75% 的固醇酯，4.30% 的甘油酯，0.85% 的甘油磷脂，0.11% 的鞘磷脂類）。本研究結果表明，雨蛙素誘導 AP 后 12 h（即雨蛙素誘導的 AP 動物模型胰腺損傷高峰期[18]）后小鼠血清脂質代謝表型發生明顯改變，引起血清各類脂質（膽固醇、甘油二酯、鞘磷脂、神經酰胺、神經酰胺磷酸乙醇胺、LPE、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸）普遍升高，CQCQD 治療后可部分挽救血清的脂質紊亂，主要表現為降低 LPE 水平——不僅僅降低了 AP 小鼠血清中 LPE 的總量，還降低了含不同脂肪酰基（飽和脂肪酰基、單不飽和脂肪酰基和多不飽和脂肪酰基）LPE 及不同 LPE 脂質分子的含量。
新近 2 項關于新型冠狀病毒感染循環脂質水平的臨床研究均發現，LPE 水平在重癥患者中顯著升高，在輕癥患者中僅有輕度升高或降低[19-20]。本研究 CON 組、AP 組、APQ 組小鼠血清 LPE 水平同樣與 AP 嚴重成正比。因此，多項證據表明血清 LPE 水平在感染性疾病中可能有重要意義。綜上所述，CQCQD 能夠改善雨蛙素誘導 AP 小鼠的胰腺損傷和血脂代謝紊亂，顯著改善了 AP 小鼠血清 LPE 水平的異常升高。
盡管脂質代謝與 AP 之間的直接關系尚不清楚，但已有多項證據支持脂質代謝紊亂與 AP 病情嚴重程度密切相關：① 多項代謝組學研究均證明 AP 期間發生脂質代謝紊亂，影響花生四烯酸、甘油磷脂、甘油酯、鞘磷脂類及膽汁酸代謝[11]；② 高甘油三酯血癥、肥胖等基礎脂質代謝紊亂狀態均可顯著加重 AP 病情嚴重程度[21-24]；③ 不飽和游離脂肪酸可導致炎癥反應和胰腺壞死[25]；④ AP 發生時，磷脂酰肌醇和/或磷脂酰膽堿參與合成的 1,4,5-三磷酸肌醇和甘油二酯可誘導核轉錄因子-κB 活化[26]；⑤ 多種膽汁酸已被用于誘導 AP 動物模型[27]。因此，研究 CQCQD 對 AP 脂質代謝的影響不僅能為其臨床應用提供新的依據，還能為 AP 治療提供新的干預靶點。
目前關于 LPE 的生理病理功能的基礎研究相對不足，在炎癥相關疾病中不同 LPE 分子具有不同的效應：① 2 項研究發現含多不飽和脂肪酸的 LPE 具有抗炎作用，不僅能在酵母聚糖 A 誘導的小鼠腹膜炎模型中發揮抗炎作用[28]，還能夠緩解角叉菜膠誘導的小鼠足部水腫[29]，這可能是通過誘導 M1 巨噬細胞極化實現的[29]；② 然而 LPE（18∶1）不具備這樣的抗炎功能[29]，還有研究發現其在單核細胞和支氣管上皮細胞中可能具有一定的促炎作用。這種矛盾的作用可能與 LPE 的脂肪酰基的飽和度有關，因此不同的 LPE 分子在 AP 甚至是炎癥反應中的作用仍需要進行下一步探索。
LPE 主要由磷脂酰乙醇胺經磷脂酶 A2 催化而來，磷脂酶 A2 在多種組織器官中存在。其中分泌型ⅡA 組磷脂酶 A2 可由巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞等多種炎癥細胞分泌，并存在于體液中，不僅能夠通過多種途徑擴大炎癥級聯反應，還能夠調節多種細胞內促炎信號通路[30-31]。既往研究發現 CQCQD 中多種單體成分具有脂肪酶抑制效應[13, 32]，CQCQD 是否能夠通過抑制磷脂酶 A2 進而影響 AP 狀態下血清 LPE 水平仍需要進一步研究。
本研究仍有一定的局限性：在 AP 與 APQ 組 OPLS-DA 模型的置換檢驗中，隨機實驗數值并不完全低于原始值，有一定的過擬合可能，實驗結果存在假陽性的可能；不同的 LPE 分子以及不同的細胞類型均會引起發生不同的生物效應，在 AP 中不同的 LPE 分子對免疫細胞與腺泡細胞的影響仍需要進一步的研究；深入研究 CQCQD 對 LPE 代謝途徑的影響也能夠為該疾病的治療提供重要的參考價值。
綜上所述，本研究的結果進一步闡明了 AP 引發的血清脂質代謝紊亂，并揭示了 CQCQD 可部分挽救 AP 介導的 LPE 代謝紊亂，為深入探討 AP 的機制以及開展相關治療靶點研究提供了嶄新的視角。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是臨床上常見的消化系統疾病之一，是一種由胰酶異常激活引起胰腺組織自身消化進而導致胰腺局部水腫、炎癥細胞浸潤甚至壞死的急腹癥[1-2]，近年來全球發病率逐年升高[3-5]。重癥 AP（severe AP, SAP）占比約為 20%[1]，具有進展迅猛、病程復雜、致死率高等特點，造成嚴重的公共衛生和社會經濟負擔[6]。柴芩承氣湯（chaiqin chengqi decoction, CQCQD）是四川大學華西醫院長期用于治療 AP 的臨床驗方，團隊系列基礎研究發現其可通過多途徑、多靶點改善 AP 的胰腺損傷及相關的器官功能障礙[7-10]。此外，既往關于 AP 患者與動物模型循環代謝物的研究均發現蛋白質、碳水化合物、脂質代謝等多種營養物質代謝紊亂[11-12]，團隊進一步研究發現 CQCQD 可逆轉胰腺代謝軌跡尤其是谷胱甘肽代謝途徑[12]。然而，目前尚未有研究探討 CQCQD 對 AP 血清中脂質代謝物的影響，因此本研究采用脂質組學技術靶向 375 種脂質分子定量檢測探討 CQCQD 對雨蛙素誘導的 AP 小鼠血清中具體脂質分子類型及水平的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
27 只無特定病原體雄性 C57BL/6 小鼠，鼠齡 8～11 周，體重 18～22 g，購自河北伊維沃生物科技有限公司。本實驗操作過程均遵循國家及學校相關規定，并通過四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會認證（倫理備案號：20221221002）。
1.2 藥物與試劑
1.2.1 藥物
大黃 20 g、芒硝 20 g、厚樸 20 g、枳實 15 g、柴胡 15 g、黃芩 15 g、茵陳 15 g、梔子 20 g，均購自四川省中醫院，并根據團隊既往方法制備 CQCQD 凍干粉[13]。
1.2.2 試劑
雨蛙素（美國 Tocris 公司）；二喹啉甲酸法蛋白濃度檢測試劑盒（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、10% 中性甲醛溶液、二甲基亞砜、十六烷基三甲基溴化銨、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（美國 Sigma 公司）；蛋白酶抑制劑（瑞士 Roche 公司）；乙二胺四乙酸二鈉鹽（上海生工公司）；雙氧水（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。
1.3 主要儀器與設備
5424R 低溫高速小離心機（德國 Eppendorf 公司）；普通顯微鏡（德國 Zeiss 公司）；pH 計、XP205 電子天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）；CLARIOstar 全功能多功能酶標儀（德國 BMG 公司）；全自動生化分析儀（德國 Roche 公司）；超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（美國 Waters 公司）；Allegra X-15R 臺式冷凍離心機（美國 Beckman 公司）；GL-3250A 恒溫磁力攪拌棒、TS-1000 水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；MSC-100 恒溫混勻儀（杭州奧盛儀器有限公司）。
1.4 造模、給藥與取材
將 27 只小鼠按照完全隨機法分成 3 組，每組 9 只，即對照組（CON 組）、AP 模型組（AP 組）、AP 加 CQCQD 組（APQ 組）。實驗開始前 12 h 禁食，不禁水。AP 組與 APQ 組均采用間隔 1 h 共 7 次的雨蛙素（50 μg/kg）腹腔注射以誘導 AP 模型，CON 組則接受同頻次、等體積的磷酸鹽緩沖液腹腔注射[14]。團隊既往研究顯示，在雨蛙素誘導的 AP 小鼠中 CQCQD 的臨床等效劑量（5.5 g/kg）具有最好的療效[13]。將 CQCQD 以 3.85 g/kg（0.13 g/mL）的劑量溶解于無菌水中，APQ 組分別在造模 1、5、9 h 給予 CQCQD 灌胃治療，劑量相當于生藥 5.5 g/kg[13]。AP 組給予等量無菌水灌胃，CON 組不予灌胃。
第 1 次雨蛙素或磷酸鹽緩沖液注射后 12 h 收集血液和組織樣本，檢測各組小鼠血清生化指標、病理改變情況綜合評價 AP 模型嚴重程度及 CQCQD 療效。所有小鼠采取眼球取血，血液樣本室溫下靜置 30 min 后，1500×g、室溫離心 15 min 后獲得待測血清，保存于?80℃冰箱中備用。取血后迅速打開腹腔，取出小鼠胰腺組織并分為兩部分，將胰體完整部分放入包埋盒，并浸泡于 10% 中性甲醛溶液中固定 48 h 以上待用；胰頭則液氮速凍，后凍存于?80℃冰箱中，用于測定髓過氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）。
1.5 檢測指標及方法
1.5.1 胰腺組織病理檢查
對 10% 中性甲醛溶液固定后的胰腺組織脫水、石蠟包埋并切片，使用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色。2 位研究人員雙盲對 HE 染色胰腺組織進行觀察和病理評分，將切片置于顯微鏡下，先于低倍鏡（4×）下觀察切片整體情況，再于高倍鏡（20×）下隨機選取 10 個具有代表性的實驗拍照，并根據文獻[14]的評分標準從水腫、炎癥細胞浸潤和壞死 3 個方面進行評分，三者之和為病理總分。
1.5.2 胰腺組織 MPO 檢測
按照團隊既往方法測定胰腺組織中的 MPO 活性[8, 15-16]，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。
1.5.3 血清胰淀粉酶、脂肪酶水平檢測
使用全自動生化儀檢測血清胰淀粉酶、脂肪酶。
1.5.4 血清脂質組學研究
① 樣品制備：樣品在冰浴下解凍。吸取 10 μL 血清樣品于 96 孔板中，加入 300 μL 脂質提取溶劑，渦旋混合 20 min，然后將 96 孔板以 4000×g 的速度離心 20 min，轉移 20 μL 上清液于新的 96 孔板中，并與 80 μL 脂質稀釋溶劑混合，用于超高效液相色譜-質譜分析。質量控制（質控）樣品為該批所用樣品的進樣溶液取 10 μL 合并而來。
② 色譜條件：色譜柱為 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μmol/L 分析柱（2.1 mm×100 mm）。流動相含 A 液與 B 液，A 液中乙腈∶水為 6∶4，B 液中異丙醇∶乙腈為 9∶1，流動相的酸堿度使用 5 mmol/L 甲酸銨+0.1% 甲酸進行調節。樣品注射體積為 2 μL，流速為 0.3 mL/min，柱溫為 45℃。洗脫條件為第 0～0.5 分鐘，60% B 液；第 0.5～3 分鐘，60%→80% B 液；第 3～7 分鐘，80%→100% B 液；第 7～9 分鐘，100% B 液；第 9～9.5 分鐘，100%→60% B 液；第 9.5～11 分鐘 60% B 液。
③ 質譜條件：毛細管電壓 3.0 kV（電噴霧正離子模式），離子源溫度 150℃，脫溶劑溫度 550℃，脫溶劑氣流速 1000 L/h，碰撞氣流速 0.13 L/h。
④ 上樣順序：待測樣本按照組別信息進行隨機測樣。質控樣本穿插于整體樣本中進行檢測。
1.6 統計學方法
應用 GraphPad Prism 8 軟件進行數據處理及圖表可視化。通過 Shapiro-Wilk 檢驗對計量資料進行正態性檢驗，符合正態分布的以均數±標準差表示，不符合正態分布的以中位數（下四分位數，上四分位數）表示。服從正態分布的數據中，符合方差齊性的數據采用單因素方差分析進行多組間比較，采用 Dunnett-t 檢驗進行兩組間比較（AP 組為對照）；不符合方差齊性的數據，則采用 Brown-Forsythe 檢驗進行多組間比較，采用 Dunnett T3 檢驗進行兩組間比較（AP 組為對照）。不服從正態分布性的數據多組間比較采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，兩組間比較采用 Dunn 檢驗（AP 組為對照），并采用 Hodges-Lehmann 估計兩組間的中位數差及 95% 置信區間（confidence interval, CI）。雙側檢驗水準 α=0.05。
采用 MassLynx 軟件（美國 Waters 公司）對超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀生成的原始數據文件進行處理，對每一個脂質進行峰提取、積分和定量。為了探討 CQCQD 對雨蛙素誘導的 AP 小鼠血清脂質輪廓的干預效應，采用 iMAP 軟件（上海麥特繪譜生物科技有限公司），分別對各組小鼠血清（CON 組 vs. AP 組和 AP 組 vs. APQ 組）進行正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）等多維統計分析。對 OPLS-DA 模型進行 1000 次隨機打亂樣本分組的隨機置換檢驗以驗證模型是否存在過擬合。對不同的脂質亞類進行統計分析，并以變量投影重要性>1.0、P<0.05（依據數據的正態性和方差齊性選取成組 t 檢驗或 Mann-Whitney U 檢驗），和|log2FC|≥0［FC：組間變化倍數（fold change）］這 3 個條件作為標準篩選兩組間的脂質差異代謝物。對含不同飽和度脂肪酰基（飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸）的溶血磷脂酰乙醇胺（lyso-phosphatidylethanolamine, LPE）及不同的 LPE 脂質分子進行統計分析篩選潛在的生物標志物。
2 結果
2.1 CQCQD 改善 AP 小鼠胰腺損傷
小鼠胰腺組織 HE 染色結果顯示，CON 組胰腺組織結構完整，染色均勻，胰腺組織無水腫、炎癥細胞浸潤和腺泡細胞壞死；AP 組胰腺組織水腫，廣泛的小葉間間隙增寬，伴有腺泡細胞的破壞，導管及部分實質有炎性細胞浸潤，導管周圍存在點狀壞死；相較于 AP 組，APQ 組胰腺水腫、炎癥浸潤及壞死均有顯著改善。見圖1。
圖1
各組小鼠胰腺組織病理檢查（HE ×200）
CON：對照組；AP：急性胰腺炎模型組；APQ：急性胰腺炎模型+柴芩承氣湯治療組；HE：蘇木精-伊紅染色
與 CON 組相比，AP 組胰腺水腫、炎癥浸潤、壞死和病理總分，血清淀粉酶、脂肪酶水平，以及胰 MPO 活性均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 AP 組相比，APQ 組胰腺炎癥浸潤、壞死和病理總分以及血清淀粉酶水平明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；胰腺組織水腫評分、血清脂肪酶水平和 MPO 活性差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
各組小鼠胰腺損傷指標（n=9，x±s）
2.2 CQCQD 對 AP 小鼠血清脂質輪廓的影響
2.2.1 脂質代謝物鑒定
本研究靶向 375 種脂質分子進行定量檢測，檢測出 319 種不同的脂質代謝物，覆蓋 12 個亞類。本研究中固醇酯含量占檢測總脂質含量的 94.75%，包括 15 種膽固醇酯；甘油酯含量占 4.30%，包括 48 種甘油三酯和 20 種甘油二酯；甘油磷脂含量占 0.85%，其中包括 80 種磷脂酰膽堿、44 種磷脂酰乙醇胺、20 種溶血磷脂酰膽堿、17 種磷脂酰絲氨酸、14 種磷脂酰肌醇和 12 種 LPE；鞘磷脂類含量占 0.11%，包括 30 種鞘磷脂、18 種神經酰胺和 1 種神經酰胺磷酸乙醇胺。
2.2.2 CQCQD 干預影響 AP 介導的血清脂質輪廓改變
為了探討 CQCQD 對雨蛙素誘導的 AP 小鼠血清脂質輪廓的干預效應，分別對各組小鼠血清（CON 組 vs. AP 組和 AP 組 vs. APQ 組）進行 OPLS-DA 分析，結果如圖2a、2b 所示，各組樣本脂質譜分離程度高，表明組間血清脂質輪廓整體可能存在差異。其中，CON 組 vs. AP 組的 OPLS-DA 分析中，R2X、R2Y、Q2Y 參數分別為 0.564、0.974、0.862；AP 組 vs. APQ 組的 OPLS-DA 分析中，R2X、R2Y、Q2Y 參數分別為 0.333、0.884、0.466。兩個 OPLS-DA 模型的置換檢驗均提示 Q2Y>0.2，且 Q2Y 擬合曲線在 Y 軸上的截距<0，說明這 2 個模型均具有良好的解釋能力和預測能力。見圖2c、2d。
圖2
各組小鼠血清脂質輪廓特征
a. CON 組與 AP 組血清脂質 OPLS-DA 分析得分圖；b. AP 組與 APQ 組血清脂質 OPLS-DA 分析得分圖；c. CON 組與 AP 組 OPLS-DA 模型的置換檢驗；d. AP 組與 APQ 組 OPLS-DA 模型的置換檢驗。CON 組：對照組；AP 組：急性胰腺炎模型組；APQ 組：急性胰腺炎模型+柴芩承氣湯治療組；OPLS-DA：正交偏最小二乘法判別分析；P1：第一主成分；O1：正交主成分
2.3 CQCQD 對 AP 小鼠血清脂質分子和含量的影響
2.3.1 CQCQD 部分挽救 AP 介導的血清 LPE 改變
與 CON 組相比，AP 組小鼠膽固醇酯、甘油二酯、鞘磷脂、神經酰胺、神經酰胺磷酸乙醇胺、LPE、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸的含量均有不同程度的升高，且差異有統計學意義（P<0.05），兩組間甘油三酯、溶血磷脂酰膽堿含量差異無統計學意義（P>0.05）。與 AP 組相比，APQ 組小鼠血清脂質譜中 LPE 降低且差異有統計學意義（P<0.05），其余脂質亞類差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
表2
各組小鼠血清不同脂質亞類相對豐度變化（n=9，x±s）
CON 組與 AP 組共篩選出差異脂質分子 158 種，所有差異代謝物均在 AP 組明顯升高；AP 組與 APQ 組則共篩選出差異脂質分子 29 種，其中 7 種差異代謝物在 APQ 組明顯升高；另外 22 種則明顯降低。其中共有 13 種脂質分子（9 種 LPE、2 種磷脂酰膽堿、1 種磷脂酰乙醇胺、1 種膽固醇酯）含量組間變化呈相反趨勢：AP 組含量較 CON 組升高，APQ 組含量則較 AP 組下降。見圖3。
圖3
CQCQD 對 AP 小鼠血清脂質分子影響熱圖
CON：對照組；AP：急性胰腺炎模型組；APQ：急性胰腺炎模型+柴芩承氣湯治療組；LPE：溶血磷脂酰乙醇胺；PC：磷脂酰膽堿；PE：磷脂酰乙醇胺；CE：膽固醇酯；CQCQD：柴芩承氣湯
2.3.2 CQCQD 對 AP 小鼠血清含不同脂肪酰基 LPE 脂質的影響
與 CON 組小鼠相比，AP 組小鼠血清中含飽和脂肪酰基、單不飽和脂肪酰基和多不飽和脂肪酰基的 LPE 明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與 AP 組相比，APQ 組 3 種含不同脂肪酰基的 LPE 水平均較 AP 組降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。
表3
各組小鼠血清含不同脂肪酰基 LPE 相對豐度變化（n=9，x±s）
2.3.3 篩選潛在 LPE 分子生物標志物
本研究共鑒定出 12 種 LPE 脂質成分，其中 LPE（16∶0）、LPE（18∶1）、LPE（18∶2）、LPE（20∶3）、LPE（20∶4）及 LPE（22∶5）6 種 LPE 分子水平在 AP 組上調，在 APQ 組相對 AP 組下調，可作為 CQCQD 干預 AP 的潛在生物標志物。見圖4。
圖4
CQCQD 干預 AP 血清潛在生物標志物
CON：對照組；AP：急性胰腺炎模型組；APQ：急性胰腺炎模型+柴芩承氣湯治療組；LPE：溶血磷脂酰乙醇胺。*
3 討論
CQCQD 在治療 AP 的臨床治療實踐中表現出顯著的療效。本研究結果表明，CQCQD 能夠顯著改善雨蛙素誘導的 AP 小鼠的胰腺組織炎癥、壞死程度以及血清淀粉酶水平，進一步證實了 CQCQD 對 AP 嚴重程度的改善作用。
脂質作為細胞的基本組成部分，在炎癥相關性疾病發生時出現明顯的代謝紊亂并調節多種細胞反應[17]。既往研究發現，AP 可介導多種營養物質的代謝紊亂，而脂質代謝是其重要組成部分[11-12]。本研究采用超高效液相色譜質譜技術對小鼠血清進行靶向脂質組學檢測，共鑒定出脂類 319 種（94.75% 的固醇酯，4.30% 的甘油酯，0.85% 的甘油磷脂，0.11% 的鞘磷脂類）。本研究結果表明，雨蛙素誘導 AP 后 12 h（即雨蛙素誘導的 AP 動物模型胰腺損傷高峰期[18]）后小鼠血清脂質代謝表型發生明顯改變，引起血清各類脂質（膽固醇、甘油二酯、鞘磷脂、神經酰胺、神經酰胺磷酸乙醇胺、LPE、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸）普遍升高，CQCQD 治療后可部分挽救血清的脂質紊亂，主要表現為降低 LPE 水平——不僅僅降低了 AP 小鼠血清中 LPE 的總量，還降低了含不同脂肪酰基（飽和脂肪酰基、單不飽和脂肪酰基和多不飽和脂肪酰基）LPE 及不同 LPE 脂質分子的含量。
新近 2 項關于新型冠狀病毒感染循環脂質水平的臨床研究均發現，LPE 水平在重癥患者中顯著升高，在輕癥患者中僅有輕度升高或降低[19-20]。本研究 CON 組、AP 組、APQ 組小鼠血清 LPE 水平同樣與 AP 嚴重成正比。因此，多項證據表明血清 LPE 水平在感染性疾病中可能有重要意義。綜上所述，CQCQD 能夠改善雨蛙素誘導 AP 小鼠的胰腺損傷和血脂代謝紊亂，顯著改善了 AP 小鼠血清 LPE 水平的異常升高。
盡管脂質代謝與 AP 之間的直接關系尚不清楚，但已有多項證據支持脂質代謝紊亂與 AP 病情嚴重程度密切相關：① 多項代謝組學研究均證明 AP 期間發生脂質代謝紊亂，影響花生四烯酸、甘油磷脂、甘油酯、鞘磷脂類及膽汁酸代謝[11]；② 高甘油三酯血癥、肥胖等基礎脂質代謝紊亂狀態均可顯著加重 AP 病情嚴重程度[21-24]；③ 不飽和游離脂肪酸可導致炎癥反應和胰腺壞死[25]；④ AP 發生時，磷脂酰肌醇和/或磷脂酰膽堿參與合成的 1,4,5-三磷酸肌醇和甘油二酯可誘導核轉錄因子-κB 活化[26]；⑤ 多種膽汁酸已被用于誘導 AP 動物模型[27]。因此，研究 CQCQD 對 AP 脂質代謝的影響不僅能為其臨床應用提供新的依據，還能為 AP 治療提供新的干預靶點。
目前關于 LPE 的生理病理功能的基礎研究相對不足，在炎癥相關疾病中不同 LPE 分子具有不同的效應：① 2 項研究發現含多不飽和脂肪酸的 LPE 具有抗炎作用，不僅能在酵母聚糖 A 誘導的小鼠腹膜炎模型中發揮抗炎作用[28]，還能夠緩解角叉菜膠誘導的小鼠足部水腫[29]，這可能是通過誘導 M1 巨噬細胞極化實現的[29]；② 然而 LPE（18∶1）不具備這樣的抗炎功能[29]，還有研究發現其在單核細胞和支氣管上皮細胞中可能具有一定的促炎作用。這種矛盾的作用可能與 LPE 的脂肪酰基的飽和度有關，因此不同的 LPE 分子在 AP 甚至是炎癥反應中的作用仍需要進行下一步探索。
LPE 主要由磷脂酰乙醇胺經磷脂酶 A2 催化而來，磷脂酶 A2 在多種組織器官中存在。其中分泌型ⅡA 組磷脂酶 A2 可由巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞等多種炎癥細胞分泌，并存在于體液中，不僅能夠通過多種途徑擴大炎癥級聯反應，還能夠調節多種細胞內促炎信號通路[30-31]。既往研究發現 CQCQD 中多種單體成分具有脂肪酶抑制效應[13, 32]，CQCQD 是否能夠通過抑制磷脂酶 A2 進而影響 AP 狀態下血清 LPE 水平仍需要進一步研究。
本研究仍有一定的局限性：在 AP 與 APQ 組 OPLS-DA 模型的置換檢驗中，隨機實驗數值并不完全低于原始值，有一定的過擬合可能，實驗結果存在假陽性的可能；不同的 LPE 分子以及不同的細胞類型均會引起發生不同的生物效應，在 AP 中不同的 LPE 分子對免疫細胞與腺泡細胞的影響仍需要進一步的研究；深入研究 CQCQD 對 LPE 代謝途徑的影響也能夠為該疾病的治療提供重要的參考價值。
綜上所述，本研究的結果進一步闡明了 AP 引發的血清脂質代謝紊亂，并揭示了 CQCQD 可部分挽救 AP 介導的 LPE 代謝紊亂，為深入探討 AP 的機制以及開展相關治療靶點研究提供了嶄新的視角。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
