血管鈣化是一種主動的、可調控的復雜生物學過程，也是心血管事件的獨立危險因素，目前尚缺乏有效的治療方法。鐵死亡是一種新型調節性細胞死亡方式，其發生機制與鐵代謝、脂質代謝、谷胱甘肽代謝等多種途徑密切相關，近年來研究顯示鐵死亡可能參與血管鈣化的發生發展。該文在介紹鐵死亡發生機制的基礎上，分別探討鐵死亡與內膜鈣化、中膜鈣化以及心臟瓣膜鈣化等不同類型鈣化的密切關系，為血管鈣化的防治提供新的思路。
引用本文： 曹夢霞, 歐三桃. 鐵死亡與血管鈣化的研究進展. 華西醫學, 2023, 38(3): 470-475. doi: 10.7507/1002-0179.202210004 復制
血管鈣化是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）在各種病理因素作用下轉分化為成骨成軟骨細胞表型并介導鈣鹽異常沉積于血管壁的過程，根據發生位置的不同，分為內膜鈣化、中膜鈣化以及瓣膜鈣化等多種病理類型[1]。隨著人口老齡化的發展，其發病率和死亡率逐年增高，是心血管事件的獨立危險因素，明顯增加全因死亡的風險。血管鈣化最初被認為是鈣磷代謝失調的被動沉積，隨后的研究證明這是一個類似于骨形成并受細胞和基因主動調控的過程，VSMC、內皮細胞（endothelial cell, EC）、瓣膜間質細胞（valvular interstitial cell, VIC）和巨噬細胞等是參與其中的重要細胞成分[2]。其病理生理學機制紛繁復雜，至今尚未完全闡明，主要涉及細胞成骨型分化、血管鈣化促進因子與抑制因子之間的失衡、鈣磷代謝紊亂、炎癥和氧化應激、細胞凋亡和自噬等[3]。鐵死亡作為一種新型程序性細胞死亡模式，已被證明與癌癥、心血管疾病、神經系統疾病、缺血再灌注損傷等多種疾病的病理生理過程密切相關[4]，成為疾病治療和預后的研究熱點。近年來有學者發現鐵死亡在調控血管鈣化的發生發展中可能發揮重要的作用[5]。本文將圍繞鐵死亡與血管鈣化之間的關系作一綜述，進而為血管鈣化的防治提供新的靶點。
1 鐵死亡概述
死亡是細胞生命過程中不可避免的重要環節，對于生長發育、體內平衡和預防癌癥等過度增殖性疾病至關重要。2012 年 Dixon 等[6]首次提出了鐵死亡的概念，其特征是鐵依賴性的脂質過氧化，脂質活性氧（reactive oxygen species, ROS）積累對細胞結構和功能都造成不可逆的損傷，最終發生死亡，與其他類型的細胞死亡相比，鐵死亡有著特定的形態、生化和遺傳學表現。它的發生機制復雜，目前尚未完全闡明，主要與鐵代謝、脂質代謝、谷胱甘肽（glutathione, GSH）代謝和核因子 E2 相關因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）信號通路等密切相關[4，7]。此外，其他途徑及有關因子也能影響細胞對鐵死亡的敏感性。
1.1 鐵代謝與鐵死亡
鐵是人體中一種重要的微量元素，其吸收、消耗、轉移和儲存通過復雜的機制從而維持系統及細胞內的鐵穩態。三價鐵（trivalent iron, Fe3+）與轉鐵蛋白（transferrin, TF）結合存在于循環中，經膜轉鐵蛋白受體 1（transferrin receptor 1, TFR1）進入組織細胞，在內質網中被金屬還原酶—前列腺六跨膜上皮抗原 3（six-transmembrane epithelial antigen of the prostate member 3, STEAP3）還原為二價鐵（ferrous iron, Fe2+），隨后在溶質載體家族 11A2/二價金屬轉運體 1（solute carrier family 11a2/divalent metal transporter 1, SLC11A2/DMT1）作用下釋放到胞質的不穩定鐵池（labile iron pool, LIP），多余的鐵可輸送到循環中或以鐵蛋白的形式儲存。
當細胞內發生鐵過載時，一方面過多的 Fe2+與線粒體不斷代謝產生的過氧化氫發生芬頓（Fenton）反應，產生羥基自由基或過氧化自由基，進一步氧化脂質，促進脂質過氧化物（lipid peroxide, LOOH）的產生和 ROS 積累，造成細胞氧化應激性損傷，而氧化應激正是血管鈣化的重要機制[8]，因此鐵穩態異常在其中的作用也不應忽視[9]；另一方面，鐵可以增加非血紅素鐵酶的活性，如負責脂質過氧化的脂氧合酶（lipoxygenase, LOX），促進 ROS 生成[10]。此外，改變鐵代謝相關因子的表達或功能可通過影響細胞內鐵離子濃度調控鐵死亡的發生。例如，鐵反應元件結合蛋白 2（iron response element binding protein 2, IREB2）的抑制增加了鐵蛋白的表達，降低細胞對鐵死亡的敏感性[11]；過表達熱休克蛋白β-1（heat shock protein beta-1, HSPB1）通過抑制 TRF1 降低細胞內鐵濃度，顯著抑制鐵死亡[12]。可見，鐵穩態的變化在鐵死亡中起著重要作用。鐵代謝與鐵死亡過程見圖1。
圖1
鐵代謝與鐵死亡
Ferritin：鐵蛋白；Ferroptosis：鐵死亡；Fenton：芬頓反應（Fe2++H2O2→Fe3++OH•+OH?）
1.2 脂質代謝與鐵死亡
鐵依賴性的脂質 ROS 積累是鐵死亡最重要的特征，幾乎參與鐵死亡的所有途徑。多種酶系統，包括超氧化物歧化酶，過氧化氫酶等，可去除多余的 ROS 以防止細胞受損。當 ROS 清除和生成不平衡時，就會發生氧化應激，細胞內大量 ROS 與脂膜上的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid, PUFA）發生反應，引發脂質過氧化損傷細胞膜，誘發鐵死亡。PUFA 對脂質過氧化反應極為敏感，其中的花生四烯酸（arachidonic acid, AA）和腎上腺酸（adrenic acid, AdA）是誘導鐵死亡的關鍵因素[13]。酰基輔酶 a 合成酶長鏈 4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4, ACSL4）和溶血卵磷脂酰基轉移酶 3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3, LPCAT3）參與 PUFA 的合成和重塑，可將 PUFA 轉化為 LOOH，在鐵死亡中發揮著重要作用，ACSL4 和 LPCAT3 表達的下調可能會影響 LOOH 底物的濃度從而抑制鐵死亡[13-14]。此外，LOX 催化不飽和脂肪酸的過氧化，有證據顯示敲除 LOX 可減輕 erastin（鐵死亡的經典誘導劑）誘導的鐵死亡[15]（見圖2）。
圖2
脂質代謝與鐵死亡
AA-CoA：花生四烯酸-輔酶 A；AdA-CoA：腎上腺酸-輔酶 A；AA-PE：花生四烯酸-磷脂酰乙醇胺；AdA-PE：腎上腺酸-磷脂酰乙醇胺；Ferroptosis：鐵死亡
1.3 GSH 代謝與鐵死亡
GSH 作為一種抗氧化劑，能在 GSH 過氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4, GPX4）的作用下，還原有害的 LOOH 為相應的脂質醇（lipid alcohol, LOH），減少細胞內 ROS 積累，抑制鐵死亡。而 GSH 的合成需要胱氨酸/谷氨酸逆向轉運體（cystine/glutamate antiporter, System Xc-）的參與。System Xc-是細胞抗氧化系統的重要組成部分，廣泛分布于膜磷脂雙分子層，由溶質載體家族 3 成員 2（solute carrier family 3 member 2, SLC3A2）和溶質載體家族 7 成員 11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）組成，介導胱氨酸和谷氨酸等比例進出細胞，影響半胱氨酸和 GSH 的合成。早期發現的鐵死亡誘導劑 erastin 和 RSL3 即通過直接抑制 System Xc-和 GPX4 活性誘導鐵死亡[16]。因此，能抑制 System Xc-的功能、使 GSH 合成減少和 GPX4 活性降低的物質或因素可導致細胞內氧化還原穩態失衡，大量的 ROS 積累，逐漸發生氧化損傷和鐵死亡 （見圖3）。
圖3
GSH 代謝與鐵死亡
Cystine：胱氨酸；Glutamate：谷氨酸；Cysteine：半胱氨酸；GSSH：氧化型谷胱甘肽；erastin、RSL3：鐵死亡誘導劑；Ferroptosis：鐵死亡
1.4 Nrf2 通路與鐵死亡
Nrf2 是細胞抗氧化反應系統的主要調節因子，它的許多下游靶基因參與維持機體氧化還原動態平衡。正常生理情況下，Nrf2 與 Kelch 樣 ECH 相關蛋白 1（Kelch-1ike ECH- associated protein 1, Keap1）結合，通過泛素化和蛋白酶體降解持續處于失活狀態。當細胞暴露于氧化應激或受親電體和細胞毒性物質攻擊時，Nrf2 從 Keap1 結合中釋放并轉移到細胞核，結合抗氧化反應元件，轉錄激活血紅素氧合酶、GSH 過氧化物酶等多種抗氧化酶基因。研究證實 Nrf2 的水平與細胞鐵死亡的敏感性直接相關，表達上調可以增強細胞對鐵死亡的敏感性，而下調可以減輕脂質過氧化，預防鐵死亡[17-18]。p62 是細胞自噬的重要受體蛋白，抑制自噬能增加 p62 的表達，激活 p62-Keap1-Nrf2 通路保護肝癌細胞免受酒精誘導的鐵死亡[19]。丹參酮ⅡA 通過激活 Nrf2 通路顯著抑制 erastin 和 RSL3 引起的人冠狀動脈 EC 鐵死亡[20]。這些證據表明 Nrf2 抗氧化系統有望通過調控鐵死亡成為心血管疾病的潛在治療靶點。
1.5 其他途徑
研究表明，依賴核受體輔激活因子 4 的鐵蛋白自噬以及脂肪自噬、時鐘自噬等選擇性自噬能誘導鐵死亡[21]，并且越來越多的證據表明鐵死亡是一種自噬依賴性細胞死亡[22]。鐵死亡抑制蛋白利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）還原輔酶 Q10，與 GPX4 和 GSH 協同抵抗脂質過氧化和鐵死亡[23]。體內重要的抑癌基因 p53 也能通過雙向途徑調控鐵死亡[24]；此外，甲羥戊酸途徑[25]、轉硫途徑[26]、線粒體功能障礙[27]等均有參與細胞鐵死亡的調控。總之，鐵死亡的具體發生機制仍在不斷完善中。
2 鐵死亡與血管鈣化
2.1 鐵死亡與內膜鈣化
內膜鈣化好發于動脈粥樣硬化，可導致動脈壁增厚變硬、血管腔狹窄，進而發展為嚴重的危及生命的并發癥，如心肌梗塞、缺血性心肌病和中風等。動脈粥樣硬化是一種慢性進行性炎癥性疾病，脂質代謝異常、炎癥和氧化應激是主要特征。而鐵死亡作為一種以鐵依賴性的 ROS 積累和脂質過氧化為特征的細胞死亡方式，已被證明在動脈粥樣硬化發生發展中起著重要的作用[28]。ROS 誘導的氧化磷脂可增加動脈粥樣硬化的危險因素，包括 EC 功能障礙、泡沫細胞形成、異常增殖和 VSMC 的異位遷移；鐵代謝異常與動脈粥樣硬化之間也有著復雜的關系[29]。因此探討鐵死亡與動脈粥樣硬化的關系，可能會對改善動脈粥樣硬化及其相關的血管鈣化提供一個潛在的研究方向。
2.1.1 鐵死亡致 EC 功能障礙促進動脈粥樣硬化
EC 損傷和功能障礙是動脈粥樣硬化的始動環節，氧化應激在其中也起著重要作用。研究發現，過氧化氫誘導的人臍靜脈 EC 發生了鐵死亡，伴有 GPX4 表達下降和 ACSL4 表達增加，柴胡皂苷 A 能呈劑量依賴性地提高細胞存活率，抑制氧化應激和鐵死亡[30]。此外，慢性鐵超負荷可以誘導 EC 氧化應激和功能障礙及促炎介質的釋放，加重載脂蛋白 E 基因敲除小鼠的高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化，通過低鐵飲食和鐵螯合治療可顯著改善動脈粥樣硬化病程[31-32]。表明鐵死亡參與了 EC 功能障礙，為動脈粥樣硬化防治策略的發展提供了新方向。另外，在氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）處理的人臍靜脈 EC 中也發現了 System Xc–活性和 GPX4 表達的顯著下降，促進 EC 功能障礙和動脈粥樣硬化，使用鐵死亡抑制劑能減輕脂質過氧化，進而緩解動脈粥樣硬化[33]。而他汀類藥物如氟伐他汀，被證明可通過調節 GPX4 和 System Xc-，抑制 ox-LDL 誘導的鐵死亡，保護 EC[34]，為其在動脈粥樣硬化中的臨床應用提供了新的科學依據。
2.1.2 泡沫細胞鐵死亡加速動脈粥樣硬化斑塊進展
巨噬細胞在 ox-LDL 的作用下轉變為泡沫細胞在動脈粥樣硬化中起著關鍵作用，不僅會通過分泌大量的細胞因子和蛋白酶加重斑塊的促炎微環境，泡沫細胞死亡同時也增加了斑塊的不穩定性，加速動脈粥樣硬化的進展。劉洋等[35]在 ox-LDL 處理后的巨噬細胞中檢測到脂質過氧化水平升高，GPX4 與 SLC7A11 的表達水平降低，證實了 ox-LDL 誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞有鐵死亡發生。Su 等[36]也發現過量的鐵會導致巨噬細胞來源的泡沫細胞 ROS 積累和 GPX4 表達下降，誘導其發生鐵死亡并伴隨著炎性細胞因子白介素 1β和白介素 18 的表達增加，加重動脈粥樣硬化斑塊的形成和不穩定性。進一步研究發現與抑制沉默調節蛋白 1（sirtuin 1, SIRT1）有關，激活 SIRT1 后可以通過激活自噬減少泡沫細胞鐵死亡，表明 SIRT1-自噬軸可能為動脈粥樣硬化提供新的治療靶點。此外，有研究提出氯喹介導的泡沫細胞自噬不足可以關閉 Nrf2 抗氧化的積極作用，同時啟動 Nrf2 操縱的鐵沉積和脂質過氧化，促進泡沫細胞鐵死亡[37]，可見自噬和鐵死亡在動脈粥樣硬化泡沫細胞中可能具有更復雜的作用機制，還需要深入探討。
2.1.3 平滑肌細胞鐵死亡對動脈粥樣硬化的影響
VSMC 向血管內膜的遷移與初始動脈粥樣硬化斑塊形成有關，在應對動脈粥樣硬化局部微環境的損傷刺激時還具有顯著的表型可塑性，可轉化為多種細胞類型，進而影響動脈粥樣硬化斑塊穩定性。研究表明動脈粥樣硬化中的 VSMC 也可發生鐵死亡，胞內鐵的積累會誘導 VSMC 的 ROS 產生和脂質過氧化，促進其表型轉化和動脈粥樣硬化斑塊的發展[38]。香煙煙霧的暴露與顯著的心血管病理生理學改變相關，例如心臟肥大、炎癥和氧化應激、促纖維化和動脈粥樣硬化、主動脈鈣化和動脈硬化[39]。有學者發現香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract, CSE）可以劑量和時間依賴的方式誘導 VSMC 鐵死亡，通過特異性的鐵死亡抑制劑或鐵螯合劑能完全消除，進一步研究證實胞內 GSH 的耗竭是誘導 VSMC 鐵死亡的主要原因之一；同時在 CSE 作用下，許多動脈粥樣硬化相關的炎癥因子，包括白介素 1β、白介素 6、腫瘤壞死因子α、基質金屬蛋白酶-2 和基質金屬蛋白酶-9 在大鼠主動脈 VSMC 中上調[40]。可以推測，鐵水平過高和多種因素的刺激會誘導 VSMC 鐵死亡，導致 VSMC 異常增殖和鈣化，最終促進動脈粥樣硬化斑塊的形成；相關鐵螯合劑的使用可能會對此類血管鈣化的治療提供新的方法。此外，二甲雙胍作為一種經典的抗糖尿病藥物，被證明具有抗鐵死亡作用，能激活 Nrf2 通路、增強 VSMC 的抗氧化能力，抑制高脂血癥介導的血管鈣化[41]，為其在動脈粥樣硬化相關內膜鈣化中的保護作用增添了新的依據。
2.2 鐵死亡與中膜鈣化
血管中膜鈣化，亦稱為 M?nckeberg’s 硬化，常見于糖尿病、慢性腎臟病（chronic kidney disease, CKD）、高血壓、骨質疏松、衰老等，是臨床上比較普遍的病理生理變化[42]。尤其在 CKD 患者中，血管鈣化是最重要的并發癥之一，與其心血管事件的高發生率和高死亡率密切相關，而中膜鈣化是終末期腎臟疾病血管病變的特征性表現[43]。
CKD 患者通常有腎性貧血及鐵穩態異常，靜脈注射鐵劑也常被用作貧血的常規輔助治療。然而鐵在 CKD 血管鈣化中的作用目前仍存在爭議。既往有研究表明在大鼠 CKD 模型中鐵劑可抑制血管鈣化[44-45]。例如，Seto 等[44]用右旋糖苷鐵處理腺嘌呤誘導的尿毒癥大鼠，發現鐵通過抑制磷酸鹽轉運蛋白和 VSMC 成骨轉分化減輕鈣化；Ciceri 等[45]報道檸檬酸鐵通過抑制細胞凋亡來減少高磷血癥誘導的血管鈣化。另有研究稱蔗糖鐵是高磷酸鹽誘導的血管鈣化中的一把“雙刃劍”，它可以劑量依賴性方式減輕血管鈣化，但在高濃度時會導致血管系統鐵過載，提示鐵劑的安全使用劑量尚需臨床深入探索[46]。
由于鐵本身是一種促氧化劑，具有誘導 ROS 產生的能力，其過載又能加劇氧化應激和血管鈣化[47-48]，而鐵死亡作為一種以致死性氧化應激產物積累為特征的細胞死亡，表明了其在 CKD 血管鈣化中的潛在作用。近來有學者通過體內、外實驗發現，在鈣磷酸鹽誘導的血管鈣化中 VSMC 發生了鐵死亡，抑制鐵死亡后顯著減弱 VSMC 成骨分化和鈣化，改善了 CKD 大鼠和 VitD3 超載小鼠的主動脈鈣化[49]。此證實了鐵死亡可促進 CKD 的血管鈣化，而抑制鐵死亡可改善血管鈣化。從機制上講，高鈣和磷酸鹽處理下調了 VSMC 中 SLC7A11 的表達，降低 GSH 含量及 GPX4 的表達；SLC7A11 和 GPX4 的敲低均能促進 VSMC 的鈣化和成骨分化[49]。這些發現表明 SLC7A11/GSH/GPX4 軸介導的鐵死亡在 CKD 背景下促進 VSMC 成骨分化和動脈鈣化，為 CKD 血管鈣化提供了一種新的靶向策略。
2.3 鐵死亡與心臟瓣膜鈣化
心臟瓣膜鈣化是血管鈣化的重要病理類型之一，常見于主動脈瓣。主動脈瓣主要由 VSMC、VIC、瓣膜內皮細胞（valvular endothelial cells, VEC）等構成。VIC 控制主動脈瓣的結構和功能，可衍生為成骨樣細胞和肌成纖維樣細胞參與鈣化處細胞外基質（extracellular matrix, ECM）的重塑。在退行性主動脈瓣疾病中，常發生葉內出血（intraleaflet hemorrhage, IH），先前已有多個研究表明 IH 可能導致鐵蓄積，與退行性主動脈瓣狹窄的快速進展有關[50-52]。Laguna-Fernandez 等[51]在研究人主動脈瓣膜 IH 中發現，狹窄的主動脈瓣鈣化區有顯著的鐵蓄積，游離鐵含量與瓣膜鈣化程度呈正相關；鐵通過 IH 積聚在主動脈瓣中，并在促炎環境中被 VIC 吸收，促進 VIC 增殖和表型分化、減少彈性蛋白的產生，加速 ECM 重塑和鈣化相關基因的表達。表明了 IH 處的鐵蓄積可以加速主動脈瓣膜鈣化及狹窄的進展，但其中的具體機制尚不明確。此外，Morvan 等[52]也發現浸潤的衰老紅細胞在主動脈瓣葉內反復積累可能會促進 VIC 向成骨細胞表型分化并有利于鈣沉積導致鈣化。
新近的研究表明，在鈣化的主動脈瓣膜中觀察到 IH 區域有大量的鐵積累，同時還有異常的脂質過氧化、伴 NADPH 和 GSH 含量降低、ROS 含量增多[53]。提示在主動脈瓣膜鈣化的病理進展中，鐵死亡可能與 IH 有關。進一步研究發現 SLC7A11 在成骨分化培養基處理的 VIC 和鈣化的主動脈瓣中表達下調[51]。SLC7A11 是 System Xc-的主要成分，調節 GSH 的下游合成，它的缺乏會加重氧化應激以及 VIC 中鐵過載誘導的鐵死亡。細胞實驗也表明鐵可能通過加重鐵死亡促進 SLC7A11 缺陷型 VIC 成骨分化，加速主動脈瓣鈣化的進展[53]。說明抑制鐵死亡和 IH 可能為減輕心臟瓣膜鈣化進展提供一種潛在的治療策略。
3 總結和展望
隨著心血管疾病發病率的逐年升高，血管鈣化已成為世界范圍內越來越受到關注的公共健康問題，闡明其主要調控機制也是血管生物學亟待解決的任務之一。鐵死亡作為一種鐵依賴性、脂質過氧化驅動的新型細胞死亡方式，已成為腫瘤治療發展以及預防神經退行性疾病和心血管疾病的關鍵目標，它的發現為疾病研究領域開辟了一個新的平臺。本文在介紹鐵死亡發生機制的基礎上，分別闡述了鐵死亡與內膜鈣化、中膜鈣化及主動脈瓣膜鈣化之間的密切關系。然而目前的研究大多只是揭示現象且主要集中在基礎實驗，較缺乏臨床研究，其具體作用機制也未完全闡明。因此進一步探討鐵死亡在血管鈣化中的作用機制，進而尋找高度靶向性、有效的治療方法，將具有重要的實用價值。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
血管鈣化是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）在各種病理因素作用下轉分化為成骨成軟骨細胞表型并介導鈣鹽異常沉積于血管壁的過程，根據發生位置的不同，分為內膜鈣化、中膜鈣化以及瓣膜鈣化等多種病理類型[1]。隨著人口老齡化的發展，其發病率和死亡率逐年增高，是心血管事件的獨立危險因素，明顯增加全因死亡的風險。血管鈣化最初被認為是鈣磷代謝失調的被動沉積，隨后的研究證明這是一個類似于骨形成并受細胞和基因主動調控的過程，VSMC、內皮細胞（endothelial cell, EC）、瓣膜間質細胞（valvular interstitial cell, VIC）和巨噬細胞等是參與其中的重要細胞成分[2]。其病理生理學機制紛繁復雜，至今尚未完全闡明，主要涉及細胞成骨型分化、血管鈣化促進因子與抑制因子之間的失衡、鈣磷代謝紊亂、炎癥和氧化應激、細胞凋亡和自噬等[3]。鐵死亡作為一種新型程序性細胞死亡模式，已被證明與癌癥、心血管疾病、神經系統疾病、缺血再灌注損傷等多種疾病的病理生理過程密切相關[4]，成為疾病治療和預后的研究熱點。近年來有學者發現鐵死亡在調控血管鈣化的發生發展中可能發揮重要的作用[5]。本文將圍繞鐵死亡與血管鈣化之間的關系作一綜述，進而為血管鈣化的防治提供新的靶點。
1 鐵死亡概述
死亡是細胞生命過程中不可避免的重要環節，對于生長發育、體內平衡和預防癌癥等過度增殖性疾病至關重要。2012 年 Dixon 等[6]首次提出了鐵死亡的概念，其特征是鐵依賴性的脂質過氧化，脂質活性氧（reactive oxygen species, ROS）積累對細胞結構和功能都造成不可逆的損傷，最終發生死亡，與其他類型的細胞死亡相比，鐵死亡有著特定的形態、生化和遺傳學表現。它的發生機制復雜，目前尚未完全闡明，主要與鐵代謝、脂質代謝、谷胱甘肽（glutathione, GSH）代謝和核因子 E2 相關因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）信號通路等密切相關[4，7]。此外，其他途徑及有關因子也能影響細胞對鐵死亡的敏感性。
1.1 鐵代謝與鐵死亡
鐵是人體中一種重要的微量元素，其吸收、消耗、轉移和儲存通過復雜的機制從而維持系統及細胞內的鐵穩態。三價鐵（trivalent iron, Fe3+）與轉鐵蛋白（transferrin, TF）結合存在于循環中，經膜轉鐵蛋白受體 1（transferrin receptor 1, TFR1）進入組織細胞，在內質網中被金屬還原酶—前列腺六跨膜上皮抗原 3（six-transmembrane epithelial antigen of the prostate member 3, STEAP3）還原為二價鐵（ferrous iron, Fe2+），隨后在溶質載體家族 11A2/二價金屬轉運體 1（solute carrier family 11a2/divalent metal transporter 1, SLC11A2/DMT1）作用下釋放到胞質的不穩定鐵池（labile iron pool, LIP），多余的鐵可輸送到循環中或以鐵蛋白的形式儲存。
當細胞內發生鐵過載時，一方面過多的 Fe2+與線粒體不斷代謝產生的過氧化氫發生芬頓（Fenton）反應，產生羥基自由基或過氧化自由基，進一步氧化脂質，促進脂質過氧化物（lipid peroxide, LOOH）的產生和 ROS 積累，造成細胞氧化應激性損傷，而氧化應激正是血管鈣化的重要機制[8]，因此鐵穩態異常在其中的作用也不應忽視[9]；另一方面，鐵可以增加非血紅素鐵酶的活性，如負責脂質過氧化的脂氧合酶（lipoxygenase, LOX），促進 ROS 生成[10]。此外，改變鐵代謝相關因子的表達或功能可通過影響細胞內鐵離子濃度調控鐵死亡的發生。例如，鐵反應元件結合蛋白 2（iron response element binding protein 2, IREB2）的抑制增加了鐵蛋白的表達，降低細胞對鐵死亡的敏感性[11]；過表達熱休克蛋白β-1（heat shock protein beta-1, HSPB1）通過抑制 TRF1 降低細胞內鐵濃度，顯著抑制鐵死亡[12]。可見，鐵穩態的變化在鐵死亡中起著重要作用。鐵代謝與鐵死亡過程見圖1。
圖1
鐵代謝與鐵死亡
Ferritin：鐵蛋白；Ferroptosis：鐵死亡；Fenton：芬頓反應（Fe2++H2O2→Fe3++OH•+OH?）
1.2 脂質代謝與鐵死亡
鐵依賴性的脂質 ROS 積累是鐵死亡最重要的特征，幾乎參與鐵死亡的所有途徑。多種酶系統，包括超氧化物歧化酶，過氧化氫酶等，可去除多余的 ROS 以防止細胞受損。當 ROS 清除和生成不平衡時，就會發生氧化應激，細胞內大量 ROS 與脂膜上的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid, PUFA）發生反應，引發脂質過氧化損傷細胞膜，誘發鐵死亡。PUFA 對脂質過氧化反應極為敏感，其中的花生四烯酸（arachidonic acid, AA）和腎上腺酸（adrenic acid, AdA）是誘導鐵死亡的關鍵因素[13]。酰基輔酶 a 合成酶長鏈 4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4, ACSL4）和溶血卵磷脂酰基轉移酶 3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3, LPCAT3）參與 PUFA 的合成和重塑，可將 PUFA 轉化為 LOOH，在鐵死亡中發揮著重要作用，ACSL4 和 LPCAT3 表達的下調可能會影響 LOOH 底物的濃度從而抑制鐵死亡[13-14]。此外，LOX 催化不飽和脂肪酸的過氧化，有證據顯示敲除 LOX 可減輕 erastin（鐵死亡的經典誘導劑）誘導的鐵死亡[15]（見圖2）。
圖2
脂質代謝與鐵死亡
AA-CoA：花生四烯酸-輔酶 A；AdA-CoA：腎上腺酸-輔酶 A；AA-PE：花生四烯酸-磷脂酰乙醇胺；AdA-PE：腎上腺酸-磷脂酰乙醇胺；Ferroptosis：鐵死亡
1.3 GSH 代謝與鐵死亡
GSH 作為一種抗氧化劑，能在 GSH 過氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4, GPX4）的作用下，還原有害的 LOOH 為相應的脂質醇（lipid alcohol, LOH），減少細胞內 ROS 積累，抑制鐵死亡。而 GSH 的合成需要胱氨酸/谷氨酸逆向轉運體（cystine/glutamate antiporter, System Xc-）的參與。System Xc-是細胞抗氧化系統的重要組成部分，廣泛分布于膜磷脂雙分子層，由溶質載體家族 3 成員 2（solute carrier family 3 member 2, SLC3A2）和溶質載體家族 7 成員 11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）組成，介導胱氨酸和谷氨酸等比例進出細胞，影響半胱氨酸和 GSH 的合成。早期發現的鐵死亡誘導劑 erastin 和 RSL3 即通過直接抑制 System Xc-和 GPX4 活性誘導鐵死亡[16]。因此，能抑制 System Xc-的功能、使 GSH 合成減少和 GPX4 活性降低的物質或因素可導致細胞內氧化還原穩態失衡，大量的 ROS 積累，逐漸發生氧化損傷和鐵死亡 （見圖3）。
圖3
GSH 代謝與鐵死亡
Cystine：胱氨酸；Glutamate：谷氨酸；Cysteine：半胱氨酸；GSSH：氧化型谷胱甘肽；erastin、RSL3：鐵死亡誘導劑；Ferroptosis：鐵死亡
1.4 Nrf2 通路與鐵死亡
Nrf2 是細胞抗氧化反應系統的主要調節因子，它的許多下游靶基因參與維持機體氧化還原動態平衡。正常生理情況下，Nrf2 與 Kelch 樣 ECH 相關蛋白 1（Kelch-1ike ECH- associated protein 1, Keap1）結合，通過泛素化和蛋白酶體降解持續處于失活狀態。當細胞暴露于氧化應激或受親電體和細胞毒性物質攻擊時，Nrf2 從 Keap1 結合中釋放并轉移到細胞核，結合抗氧化反應元件，轉錄激活血紅素氧合酶、GSH 過氧化物酶等多種抗氧化酶基因。研究證實 Nrf2 的水平與細胞鐵死亡的敏感性直接相關，表達上調可以增強細胞對鐵死亡的敏感性，而下調可以減輕脂質過氧化，預防鐵死亡[17-18]。p62 是細胞自噬的重要受體蛋白，抑制自噬能增加 p62 的表達，激活 p62-Keap1-Nrf2 通路保護肝癌細胞免受酒精誘導的鐵死亡[19]。丹參酮ⅡA 通過激活 Nrf2 通路顯著抑制 erastin 和 RSL3 引起的人冠狀動脈 EC 鐵死亡[20]。這些證據表明 Nrf2 抗氧化系統有望通過調控鐵死亡成為心血管疾病的潛在治療靶點。
1.5 其他途徑
研究表明，依賴核受體輔激活因子 4 的鐵蛋白自噬以及脂肪自噬、時鐘自噬等選擇性自噬能誘導鐵死亡[21]，并且越來越多的證據表明鐵死亡是一種自噬依賴性細胞死亡[22]。鐵死亡抑制蛋白利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）還原輔酶 Q10，與 GPX4 和 GSH 協同抵抗脂質過氧化和鐵死亡[23]。體內重要的抑癌基因 p53 也能通過雙向途徑調控鐵死亡[24]；此外，甲羥戊酸途徑[25]、轉硫途徑[26]、線粒體功能障礙[27]等均有參與細胞鐵死亡的調控。總之，鐵死亡的具體發生機制仍在不斷完善中。
2 鐵死亡與血管鈣化
2.1 鐵死亡與內膜鈣化
內膜鈣化好發于動脈粥樣硬化，可導致動脈壁增厚變硬、血管腔狹窄，進而發展為嚴重的危及生命的并發癥，如心肌梗塞、缺血性心肌病和中風等。動脈粥樣硬化是一種慢性進行性炎癥性疾病，脂質代謝異常、炎癥和氧化應激是主要特征。而鐵死亡作為一種以鐵依賴性的 ROS 積累和脂質過氧化為特征的細胞死亡方式，已被證明在動脈粥樣硬化發生發展中起著重要的作用[28]。ROS 誘導的氧化磷脂可增加動脈粥樣硬化的危險因素，包括 EC 功能障礙、泡沫細胞形成、異常增殖和 VSMC 的異位遷移；鐵代謝異常與動脈粥樣硬化之間也有著復雜的關系[29]。因此探討鐵死亡與動脈粥樣硬化的關系，可能會對改善動脈粥樣硬化及其相關的血管鈣化提供一個潛在的研究方向。
2.1.1 鐵死亡致 EC 功能障礙促進動脈粥樣硬化
EC 損傷和功能障礙是動脈粥樣硬化的始動環節，氧化應激在其中也起著重要作用。研究發現，過氧化氫誘導的人臍靜脈 EC 發生了鐵死亡，伴有 GPX4 表達下降和 ACSL4 表達增加，柴胡皂苷 A 能呈劑量依賴性地提高細胞存活率，抑制氧化應激和鐵死亡[30]。此外，慢性鐵超負荷可以誘導 EC 氧化應激和功能障礙及促炎介質的釋放，加重載脂蛋白 E 基因敲除小鼠的高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化，通過低鐵飲食和鐵螯合治療可顯著改善動脈粥樣硬化病程[31-32]。表明鐵死亡參與了 EC 功能障礙，為動脈粥樣硬化防治策略的發展提供了新方向。另外，在氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）處理的人臍靜脈 EC 中也發現了 System Xc–活性和 GPX4 表達的顯著下降，促進 EC 功能障礙和動脈粥樣硬化，使用鐵死亡抑制劑能減輕脂質過氧化，進而緩解動脈粥樣硬化[33]。而他汀類藥物如氟伐他汀，被證明可通過調節 GPX4 和 System Xc-，抑制 ox-LDL 誘導的鐵死亡，保護 EC[34]，為其在動脈粥樣硬化中的臨床應用提供了新的科學依據。
2.1.2 泡沫細胞鐵死亡加速動脈粥樣硬化斑塊進展
巨噬細胞在 ox-LDL 的作用下轉變為泡沫細胞在動脈粥樣硬化中起著關鍵作用，不僅會通過分泌大量的細胞因子和蛋白酶加重斑塊的促炎微環境，泡沫細胞死亡同時也增加了斑塊的不穩定性，加速動脈粥樣硬化的進展。劉洋等[35]在 ox-LDL 處理后的巨噬細胞中檢測到脂質過氧化水平升高，GPX4 與 SLC7A11 的表達水平降低，證實了 ox-LDL 誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞有鐵死亡發生。Su 等[36]也發現過量的鐵會導致巨噬細胞來源的泡沫細胞 ROS 積累和 GPX4 表達下降，誘導其發生鐵死亡并伴隨著炎性細胞因子白介素 1β和白介素 18 的表達增加，加重動脈粥樣硬化斑塊的形成和不穩定性。進一步研究發現與抑制沉默調節蛋白 1（sirtuin 1, SIRT1）有關，激活 SIRT1 后可以通過激活自噬減少泡沫細胞鐵死亡，表明 SIRT1-自噬軸可能為動脈粥樣硬化提供新的治療靶點。此外，有研究提出氯喹介導的泡沫細胞自噬不足可以關閉 Nrf2 抗氧化的積極作用，同時啟動 Nrf2 操縱的鐵沉積和脂質過氧化，促進泡沫細胞鐵死亡[37]，可見自噬和鐵死亡在動脈粥樣硬化泡沫細胞中可能具有更復雜的作用機制，還需要深入探討。
2.1.3 平滑肌細胞鐵死亡對動脈粥樣硬化的影響
VSMC 向血管內膜的遷移與初始動脈粥樣硬化斑塊形成有關，在應對動脈粥樣硬化局部微環境的損傷刺激時還具有顯著的表型可塑性，可轉化為多種細胞類型，進而影響動脈粥樣硬化斑塊穩定性。研究表明動脈粥樣硬化中的 VSMC 也可發生鐵死亡，胞內鐵的積累會誘導 VSMC 的 ROS 產生和脂質過氧化，促進其表型轉化和動脈粥樣硬化斑塊的發展[38]。香煙煙霧的暴露與顯著的心血管病理生理學改變相關，例如心臟肥大、炎癥和氧化應激、促纖維化和動脈粥樣硬化、主動脈鈣化和動脈硬化[39]。有學者發現香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract, CSE）可以劑量和時間依賴的方式誘導 VSMC 鐵死亡，通過特異性的鐵死亡抑制劑或鐵螯合劑能完全消除，進一步研究證實胞內 GSH 的耗竭是誘導 VSMC 鐵死亡的主要原因之一；同時在 CSE 作用下，許多動脈粥樣硬化相關的炎癥因子，包括白介素 1β、白介素 6、腫瘤壞死因子α、基質金屬蛋白酶-2 和基質金屬蛋白酶-9 在大鼠主動脈 VSMC 中上調[40]。可以推測，鐵水平過高和多種因素的刺激會誘導 VSMC 鐵死亡，導致 VSMC 異常增殖和鈣化，最終促進動脈粥樣硬化斑塊的形成；相關鐵螯合劑的使用可能會對此類血管鈣化的治療提供新的方法。此外，二甲雙胍作為一種經典的抗糖尿病藥物，被證明具有抗鐵死亡作用，能激活 Nrf2 通路、增強 VSMC 的抗氧化能力，抑制高脂血癥介導的血管鈣化[41]，為其在動脈粥樣硬化相關內膜鈣化中的保護作用增添了新的依據。
2.2 鐵死亡與中膜鈣化
血管中膜鈣化，亦稱為 M?nckeberg’s 硬化，常見于糖尿病、慢性腎臟病（chronic kidney disease, CKD）、高血壓、骨質疏松、衰老等，是臨床上比較普遍的病理生理變化[42]。尤其在 CKD 患者中，血管鈣化是最重要的并發癥之一，與其心血管事件的高發生率和高死亡率密切相關，而中膜鈣化是終末期腎臟疾病血管病變的特征性表現[43]。
CKD 患者通常有腎性貧血及鐵穩態異常，靜脈注射鐵劑也常被用作貧血的常規輔助治療。然而鐵在 CKD 血管鈣化中的作用目前仍存在爭議。既往有研究表明在大鼠 CKD 模型中鐵劑可抑制血管鈣化[44-45]。例如，Seto 等[44]用右旋糖苷鐵處理腺嘌呤誘導的尿毒癥大鼠，發現鐵通過抑制磷酸鹽轉運蛋白和 VSMC 成骨轉分化減輕鈣化；Ciceri 等[45]報道檸檬酸鐵通過抑制細胞凋亡來減少高磷血癥誘導的血管鈣化。另有研究稱蔗糖鐵是高磷酸鹽誘導的血管鈣化中的一把“雙刃劍”，它可以劑量依賴性方式減輕血管鈣化，但在高濃度時會導致血管系統鐵過載，提示鐵劑的安全使用劑量尚需臨床深入探索[46]。
由于鐵本身是一種促氧化劑，具有誘導 ROS 產生的能力，其過載又能加劇氧化應激和血管鈣化[47-48]，而鐵死亡作為一種以致死性氧化應激產物積累為特征的細胞死亡，表明了其在 CKD 血管鈣化中的潛在作用。近來有學者通過體內、外實驗發現，在鈣磷酸鹽誘導的血管鈣化中 VSMC 發生了鐵死亡，抑制鐵死亡后顯著減弱 VSMC 成骨分化和鈣化，改善了 CKD 大鼠和 VitD3 超載小鼠的主動脈鈣化[49]。此證實了鐵死亡可促進 CKD 的血管鈣化，而抑制鐵死亡可改善血管鈣化。從機制上講，高鈣和磷酸鹽處理下調了 VSMC 中 SLC7A11 的表達，降低 GSH 含量及 GPX4 的表達；SLC7A11 和 GPX4 的敲低均能促進 VSMC 的鈣化和成骨分化[49]。這些發現表明 SLC7A11/GSH/GPX4 軸介導的鐵死亡在 CKD 背景下促進 VSMC 成骨分化和動脈鈣化，為 CKD 血管鈣化提供了一種新的靶向策略。
2.3 鐵死亡與心臟瓣膜鈣化
心臟瓣膜鈣化是血管鈣化的重要病理類型之一，常見于主動脈瓣。主動脈瓣主要由 VSMC、VIC、瓣膜內皮細胞（valvular endothelial cells, VEC）等構成。VIC 控制主動脈瓣的結構和功能，可衍生為成骨樣細胞和肌成纖維樣細胞參與鈣化處細胞外基質（extracellular matrix, ECM）的重塑。在退行性主動脈瓣疾病中，常發生葉內出血（intraleaflet hemorrhage, IH），先前已有多個研究表明 IH 可能導致鐵蓄積，與退行性主動脈瓣狹窄的快速進展有關[50-52]。Laguna-Fernandez 等[51]在研究人主動脈瓣膜 IH 中發現，狹窄的主動脈瓣鈣化區有顯著的鐵蓄積，游離鐵含量與瓣膜鈣化程度呈正相關；鐵通過 IH 積聚在主動脈瓣中，并在促炎環境中被 VIC 吸收，促進 VIC 增殖和表型分化、減少彈性蛋白的產生，加速 ECM 重塑和鈣化相關基因的表達。表明了 IH 處的鐵蓄積可以加速主動脈瓣膜鈣化及狹窄的進展，但其中的具體機制尚不明確。此外，Morvan 等[52]也發現浸潤的衰老紅細胞在主動脈瓣葉內反復積累可能會促進 VIC 向成骨細胞表型分化并有利于鈣沉積導致鈣化。
新近的研究表明，在鈣化的主動脈瓣膜中觀察到 IH 區域有大量的鐵積累，同時還有異常的脂質過氧化、伴 NADPH 和 GSH 含量降低、ROS 含量增多[53]。提示在主動脈瓣膜鈣化的病理進展中，鐵死亡可能與 IH 有關。進一步研究發現 SLC7A11 在成骨分化培養基處理的 VIC 和鈣化的主動脈瓣中表達下調[51]。SLC7A11 是 System Xc-的主要成分，調節 GSH 的下游合成，它的缺乏會加重氧化應激以及 VIC 中鐵過載誘導的鐵死亡。細胞實驗也表明鐵可能通過加重鐵死亡促進 SLC7A11 缺陷型 VIC 成骨分化，加速主動脈瓣鈣化的進展[53]。說明抑制鐵死亡和 IH 可能為減輕心臟瓣膜鈣化進展提供一種潛在的治療策略。
3 總結和展望
隨著心血管疾病發病率的逐年升高，血管鈣化已成為世界范圍內越來越受到關注的公共健康問題，闡明其主要調控機制也是血管生物學亟待解決的任務之一。鐵死亡作為一種鐵依賴性、脂質過氧化驅動的新型細胞死亡方式，已成為腫瘤治療發展以及預防神經退行性疾病和心血管疾病的關鍵目標，它的發現為疾病研究領域開辟了一個新的平臺。本文在介紹鐵死亡發生機制的基礎上，分別闡述了鐵死亡與內膜鈣化、中膜鈣化及主動脈瓣膜鈣化之間的密切關系。然而目前的研究大多只是揭示現象且主要集中在基礎實驗，較缺乏臨床研究，其具體作用機制也未完全闡明。因此進一步探討鐵死亡在血管鈣化中的作用機制，進而尋找高度靶向性、有效的治療方法，將具有重要的實用價值。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
