急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）表現為腎功能突然、快速下降，在住院患者中發病率高、病死率高。AKI 可由多種病因引起，缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是 AKI 的最常見病因之一。越來越多的研究發現間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）來源的外泌體可以通過調節免疫反應、抗氧化應激、對抗細胞凋亡、促進組織再生等機制緩解 IRI-AKI，能在一定程度上避免直接應用 MSC 的限制。該文就 MSC 來源的外泌體治療缺血再灌注腎損傷的作用和機制作一綜述，為該方向的科研工作者提供參考。
引用本文： 劉藝, 張鵬, 孫世仁, 柏明. 間充質干細胞來源的外泌體在缺血再灌注腎損傷中的作用和機制研究進展. 華西醫學, 2022, 37(7): 1081-1087. doi: 10.7507/1002-0179.202205144 復制
急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種表現為腎功能快速減退的臨床綜合征，病因眾多、病死率高。部分存活的 AKI 患者最終發展為慢性腎臟病和終末期腎臟疾病，需長期透析治療[1]。缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指在器官或組織缺血后恢復血流，反而加重組織損傷的現象。腎臟為富血供器官，極易受 IRI 影響[2]。IRI 引起腎組織活性氧增多、細胞因子、趨化因子等水平改變，引起細胞死亡，導致腎臟損傷[3-4]，是引起 AKI 最常見的病因之一[5]。IRI-AKI 也是移植腎失功的重要原因之一[5-6]。臨床治療目前僅能在依賴腎臟替代治療的同時等待腎臟自我修復，這也是 AKI 病死率居高不下的重要原因之一。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種具有自我更新和多向分化能力的多能干細胞，有免疫調節[7-8]、抗炎[9-10]和組織修復[11-12]等特性，可通過直接或間接機制緩解 IRI 造成的腎臟損傷，改善腎功能。但直接應用 MSC 存在引入受損活細胞、存儲、運輸、倫理等限制。近年，有研究表明 MSC 來源的外泌體（MSC-derived exosome，MSC-EXO）在保留 MSC 治療特性的同時，亦能克服應用 MSC 活細胞的限制，有望在 IRI-AKI 治療中發揮重要作用[9, 11]。本文就 MSC-EXO 治療 IRI-AKI 的作用和相關機制作一綜述，以期為相關領域的進一步研究和治療提供參考。
1 MSC-EXO 的一般特征
MSC 具有多向分化潛能、免疫調節功能、低免疫原性、容易獲得等眾多優點，與胚胎干細胞相比，MSC 存在于許多器官中，甚至在成人中也是如此，故在干細胞應用領域具有很強的優勢。外泌體為源于核內體的納米級膜性小泡，一般指直徑在 30～120 nm 的盤狀小泡，可于多種生物體液中存在，如血液、精液、腦脊液、滑膜液體、母乳、唾液、膽汁、腹水、羊水、胸水和尿液。它包含其細胞起源的各種分子成分，包括蛋白質、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）和微 RNA（microRNA，miRNA）或雙鏈 DNA，可調節免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等多種病理生理過程。
MSC-EXO 安全性高，在疾病的診斷標記、治療靶點、藥物運輸等多環節均有重要意義。目前，它們在癌癥[13]、免疫學、心血管[14]、呼吸[15]等各系統疾病中均被廣泛發現和應用。例如，外泌體中的蛋白可作為腫瘤病程進展的生物標志物[16]；MSC-EXO 可以通過遞送 miRNA、環狀 RNA 等遺傳物質抑制膀胱癌[17]、改善心肌梗死后的心臟功能[18]，也可通過傳遞谷胱甘肽過氧化物酶 1 促進肝臟氧化損傷的恢復[19]，還可通過介導 P38/MAPK/ERK 信號通路防止腎間質纖維化[20]等。
目前，用于治療藥物輸送的外泌體的開發仍處于初級階段，轉化研究和臨床應用的成本較高。但外泌體介導的藥物傳遞具有低毒性、低免疫原性和高度可工程化的特點，故有望廣泛用于疾病的無細胞治療。
2 MSC-EXO 通過免疫調節治療 IRI-AKI
炎癥反應和免疫調節在 IRI-AKI 過程中起重要作用[21-22]。腎臟 IRI 過程中，受損的細胞可釋放內源性分子-損傷相關分子模式（包括熱休克蛋白、高遷移率族蛋白 1、DNA 片段等），分泌白細胞介素（interleukin，IL）-1α、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子及單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-8 等趨化因子，激活固有免疫和適應性免疫應答，引發非感染性炎癥反應，促進 IRI-AKI 過程[23-24]。同時，IRI 可機械破壞腎血管內皮細胞完整性，增加血管通透性，促進免疫細胞滲入缺血后腎臟[25-26]。天然免疫系統和獲得性免疫系統的各種免疫細胞在 IRI 后腎損傷的發病機制中起著關鍵作用。在 IRI 中，缺血期的缺氧和隨后再灌注時產生的活性氧可以引發一系列以炎癥和細胞死亡為特征的有害反應[27]。IRI-AKI 過程有多種細胞和體液免疫成分參與[4, 22]。比如，核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、熱休克因子蛋白-1 和低氧誘導因子-1α 等在 IRI 后被激活[28-29]，可刺激一系列促炎細胞因子的合成[30-31]。巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞激活后可以釋放多種細胞因子和趨化因子，并提呈抗原。細胞因子和趨化因子是調節免疫細胞向缺血后腎臟炎癥細胞浸潤的重要介質。總之，在 AKI 發生早期和損傷修復過程中炎癥反應均發揮了重要作用。
目前，在 AKI 中已發現許多炎癥的分子介質，包括 NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白 3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體[32]、Toll 樣受體[33]，以及促進中性粒細胞和單核細胞介導的炎癥反應的各種分泌細胞因子[34-35]。NLRP3 是目前為止腎臟中最具特征性的炎癥體形成蛋白。細胞質天然免疫受體 NLRP3 主要在巨噬細胞和樹突狀細胞中表達[36]，可被各種刺激激活。NF-κB p65 磷酸化可觸發 NLRP3 炎癥小體的組裝，激活的 NLRP3 與胱天蛋白酶-1（caspase-1）前體和凋亡相關點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）結合。前體 caspase-1 轉化為具有催化活性的 caspase-1，促進 IL-1β 和 IL-18 成熟，引發強烈的炎癥反應[4]。
免疫調節與 NF-κB 等信號通路有著密切聯系。CARD6 基因可以激活 NF-κB 等信號通路。腎 IRI 誘導 tissp40 過表達，導致 NF-κB p65 磷酸化，CCL2/CCR2 誘導巨噬細胞 NF-κB 活化和炎癥因子表達，在 IRI 所致的腎損傷中起關鍵作用[37-38]。細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）可使 CARD6 較不使用 EV 刺激組呈現下降狀態[39]。MSC-EXO 可依賴 CCR2 蛋白作為誘餌改善 CCL2 誘導的炎癥因子 mRNA 的上調[40]，如 TNF-α、IL-6 和 IL-1β，進而抑制外周單核/巨噬細胞的募集和激活，減少 IRI 術后巨噬細胞的浸潤，最終改善腎功能。其處理的巨噬細胞中 NF-κB 的磷酸化 p65 顯著降低。
研究發現，MSC-EXO 可通過抑制 T 細胞和巨噬細胞浸潤緩解 AKI，且這種緩解能力與外泌體的數量或濃度密切相關，3D 培養可更高效地生產獲得 MSC-EXO[41]。使用 3D-EXO 處理的 AKI 小鼠體內 TNF-α、MCP-1、IL-6 和 IL-1β mRNA 表達顯著降低，NF-κB p65 磷酸化表達降低。細胞因子細胞外熱休克蛋白 70 也可通過 CD14 與單核細胞結合，激活 NF-κB 信號，增加 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的產生[42]。MSC 來源的 EV 治療順鉑誘導的 AKI 時，可獨立或協同抑制熱休克蛋白 70，導致 NLRP3 炎癥小體和下游促炎細胞因子表達減少，最終改善腎功能[43]。
MSC-EXO 可以通過調控炎細胞增殖、浸潤、炎性細胞因子等改善 AKI，為 AKI 的治療帶來了新的曙光。學者們正進一步嘗試不同方式優化 MSC-EXO 調控炎癥反應的能力[41, 44]，以提高 MSC-EXO 的有效性和安全性。
3 MSC-EXO 通過氧化應激治療 IRI-AKI
MSC-EXO 可以通過緩解氧化應激改善腎臟功能（圖1）。在正常的生理條件下，活性氧的產生和消除是平衡的，而當這種平衡被破壞時，就會產生氧化應激[45]，導致氧化還原信號中斷與相應的分子損傷。氧化應激是引起 IRI-AKI 的主要原因之一。腎小管中含有豐富的線粒體，線粒體是活性氧產生的主要場所，其功能障礙在腎 IRI 損傷中與氧化應激有密切聯系[46-47]。IRI 后，氧化應激誘導腎小管中活性氧的過度積累，破壞線粒體 DNA 并導致下一代線粒體的突變[48]。高濃度的活性氧可導致腎細胞線粒體破碎和破壞，從而引發腎細胞壞死和凋亡，并釋放促凋亡蛋白[49]。
圖1
MSC-EXO/EV 于腎臟氧化應激的機制
SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；GPX：谷胱甘肽過氧化物酶；MDA：丙二醛；HIF-1α：低氧誘導因子-1α；NOX2：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 2；Nrf2：核因子 E2 相關因子；ARE：抗氧化反應元件；Keap1：Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白 1；TFAM：線粒體轉錄因子 A；mtDNA：線粒體 DNA；ROS：活性氧；OXPHOS：氧化磷酸化；↑：增多、上升；↓：減少、下降
學者在 IRI-AKI 大鼠中發現，褪黑素預處理后 MSC-EXO 可通過降低丙二醛含量、低氧誘導因子-1α mRNA 水平和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 2 蛋白表達，并通過誘導超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶和上調 HO1 基因的表達，發揮更強的減輕腎氧化應激的作用[44]。同時，人臍帶來源的 MSC 釋放的 EV 也被證實可以通過抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-2 [50-51]的表達或增強核因子 E2 相關因子-2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應元件 [52]的激活，減輕氧化應激，從而減輕 IRI 對腎臟的損傷。
外泌體或 EV 可發揮天然的抗氧化酶活性，其固有的抗氧化酶可在各種病理條件下直接減輕氧化應激。它們也可間接影響氧化應激[53]：將藥物輸送到靶細胞，調節與氧化應激相關的信號通路。線粒體依賴于 Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（the epoxy chloropropane Kelch sample related protein 1，Keap1）-Nrf2 信號通路發揮抗氧化作用，阻止額外活性氧的產生。MSC-EV 則可通過轉導 miRNA-200a-3p 靶向激活腎小管上皮細胞（tubular epithelia cell，TEC）的 Keap1-Nrf2 信號通路，在 mRNA 和蛋白水平上顯著增加 TEC 中 Nrf2 表達，降低 Keap1 表達，通過調節線粒體結構和功能，降低活性氧水平，保護 TEC 免受氧化損傷，促進腎功能恢復[54]。也有研究表明，在 IRI-AKI 小鼠模型中，應用 MSC-EV 可恢復線粒體轉錄因子-A（recombinant transcription factor A，TFAM）蛋白和 TFAM-線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）復合物（類核）的穩定性，從而逆轉受損腎小管細胞中的 mtDNA 缺失和線粒體氧化磷酸化缺陷以改善小鼠腎臟功能[9]。
4 MSC-EXO 通過抗凋亡治療 IRI-AKI
在 AKI 過程中，多種形式的細胞死亡包括凋亡、調節性壞死、自噬、有絲分裂災難等可導致腎損傷[55-56]。IRI-AKI 的主要特征也表現為凋亡和腎小管細胞壞死。IRI 可引發一系列有害的細胞反應，導致細胞損傷，通過鐵死亡和壞死性凋亡等調節性壞死導致細胞膜破裂，引起細胞質成分釋放，繼而激活炎癥和免疫系統，最終導致細胞死亡[2, 6]。MSC-EXO 可通過多種途徑減輕腎細胞凋亡或壞死（圖2）。
圖2
MSC-EXO/EV 于腎臟細胞凋亡、壞死的機制
caspase：胱天蛋白酶；PARP1：聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1；Bcl-2：B 淋巴細胞瘤-2 基因；Bax：BCL-2 關聯 X 的蛋白質；SHC1：含 Src 同源性 2 域轉化蛋白 1；EGFR：表皮生長因子受體；ERK：細胞外調節蛋白激酶；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；↑：增多、上升；↓：減少、下降
近端小管細胞抑癌基因 p53 的激活可通過調節細胞周期阻滯、凋亡和自噬等多種細胞生物學過程，在 IRI-AKI 的發病機制中起重要作用[57-58]。細胞周期阻滯可最終導致細胞衰老或死亡，故而搶救細胞周期 G2/M 阻滯的 TEC 可能成為 AKI 治療的關鍵。MSC-EXO 可通過靶向調控 AKI 的細胞周期阻滯、TEC 凋亡等來促進腎小管修復。在 IRI 誘導的 AKI 小鼠和體外實驗中，Cao 等[59]發現 MSC-EXO 可通過抑制 miR-125b-5p/p53 通路減弱 G2/M 阻滯，使 HK-2 細胞凋亡明顯抑制，表現為凋亡相關蛋白 Bax 和 caspase-3 表達下降，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達上調。對 IRI 的研究也發現，MSC-EXO 可降低 caspase-3 活性和基因表達，并降低抗凋亡標志物聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1、Bax 的 mRNA 水平，通過增加 Bcl-2 誘導抗凋亡作用，顯著減輕細胞凋亡。使用褪黑素預處理 MSC-EXO 則可獲得更好效果[44]。
研究顯示：腎固有細胞在 IRI 后，MSC-EV 的攝取增加，EV 通過轉移或誘導 miRNA 來調節細胞恢復的重要信號通路[60]。miRNA 預測靶點表明，靶向 caspase-3 的 miR-410、miR-495、miR-548c-5p 和 let-7a 以及靶向 caspase-7 的 miR-375、miR-495 和 miR-548c-5p 可能調控細胞凋亡。MSC-EV 的使用可使 caspase-3 和 caspase-7 減少，表明這些上調的 miRNA 可能參與調控減少三磷酸腺苷耗竭促進的腎細胞死亡。這些上調的 miRNA 也可能與含 Src 同源性 2 域轉化蛋白 1（Src homology 2 domain containing transforming protein 1，SHC1）的下調有關，SHC1 可能參與腎細胞的保護作用，也可通過抑制促生存的表皮生長因子受體-ras-細胞外調節蛋白激酶通路而導致細胞死亡[61]，SHC1 的下調則參與腎細胞的保護作用。
此外，在小鼠 AKI 模型中，MSC-EV 可通過 miRNA let-7a-5p 激活自噬途徑改善 AKI 導致的腎功能下降。RradD 是參與氨基酸傳感途徑的基因之一，含有 miRNA let-7a-5p 的 MSC-EV 靶向調控 RradD mRNA，激活下游的自噬途徑[62]，從而改善 AKI 中腎細胞凋亡，提高 AKI 修復潛力。同時，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸水凝膠可增強 EV 的抗凋亡作用[11]。
5 MSC-EXO 通過促進再生治療 IRI-AKI
與 MSC 直接定植于受損腎小管，促進腎功能恢復相比，MSC 通過旁分泌途徑發揮腎臟保護、促進腎臟組織再生作用的機制逐漸被廣泛認可（圖3）。關于 MSC-EXO 對腎 IRI 的研究發現，MSC-EXO 通過調控堿性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子和性別決定區域 Y 相關的高遷移率族框-9（sex determining region Y-box 9，Sox-9）蛋白改善腎組織再生，通過調控血管內皮生長因子基因增強血管生成[44]。MSC-EV 也被證明可以刺激損傷腎臟的再生。腎臟再生被認為與 Sox-9 的激活有密切關系。在 EV 治療和 Sox-9 細胞依賴性再生的激活機制的研究中，通過嵌入的腹部成像窗口進行雙光子活體顯微鏡的體內譜系追蹤來跟蹤誘導的 Sox-9-Cre 轉基因小鼠中的 Sox-9 細胞發現，EV 可以在靜脈注射后前往受傷的腎臟，并顯著增加 Sox-9 的活化[63]。此外，EV 可促進 AKI 后腎臟中 Sox-9 活化細胞的擴增。Sox-9 細胞的后代有助于腎小管再生，從而顯著改善 AKI 后的腎功能。
圖3
MSC-EXO/EV 促進腎組織再生的機制
VEGF：血管內皮生長因子；bFGF：堿性成纖維細胞生長因子；HGF：肝細胞生長因子；Sox-9：性別決定區域 Y 相關的高遷移率族框-9；IGF-1：胰島素樣生長因子-1；↑：增多、上升；↓：減少、下降
目前，人們普遍認為外泌體活動主要涉及遺傳物質的轉移[12]。如，骨髓 MSC-EV 可攜帶特定的 mRNA，進而刺激受損的細胞重新進入細胞周期[64]，骨髓 MSC-EV 中存在的人胰島素樣生長因子-1 受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）mRNA 轉移到腎小管細胞促使腎臟恢復[65]。臍血 MSC-EV 可通過促進腎小管細胞去分化和生長從而刺激其增殖，改善腎功能[66-67]。
IGF-1R 的 mRNA 可通過外泌體轉移到 TEC，增強 TEC 對局部產生的胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）的敏感性[65]。使用表達 IGF-1R，但不表達 IGF-1-mRNA 的外泌體和同時表達 IGF-1R 和 IGF-1-mRNA 的人骨髓 MSC 進行實驗發現，缺乏 IGF-1R 的細胞暴露在人骨髓 MSC 衍生的外泌體中，獲得了人 IGF-1R 轉錄本，該轉錄本被翻譯成相應的蛋白質。將 IGF-1R mRNA 從外泌體轉移到順鉑損傷的近端腎小管細胞（proximal tubule epithelial cell，PTEC）可促進 PTEC 增殖。損傷的 PTEC 與外泌體和可溶性 IGF-1 共同孵育則可進一步促進細胞增殖。這也一定程度上解釋了體內觀察到少量骨髓 MSC 卻擁有較強的腎保護作用的現象。
6 結語
目前已有實驗顯示 MSC-EXO 可以通過多種機制保護腎臟，并在其基礎上使用修飾預處理等方式增強 MSC-EXO 的治療效果。目前雖有不少動物模型和體外科研數據表明 MSC-EXO 在治療 IRI-AKI 中發揮顯著作用，但其研究仍處于初期階段，這些結果仍未得到臨床研究的驗證，故仍需更多的研究對 MSC-EXO 在 IRI-AKI 領域中的機制和作用進行探索。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種表現為腎功能快速減退的臨床綜合征，病因眾多、病死率高。部分存活的 AKI 患者最終發展為慢性腎臟病和終末期腎臟疾病，需長期透析治療[1]。缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指在器官或組織缺血后恢復血流，反而加重組織損傷的現象。腎臟為富血供器官，極易受 IRI 影響[2]。IRI 引起腎組織活性氧增多、細胞因子、趨化因子等水平改變，引起細胞死亡，導致腎臟損傷[3-4]，是引起 AKI 最常見的病因之一[5]。IRI-AKI 也是移植腎失功的重要原因之一[5-6]。臨床治療目前僅能在依賴腎臟替代治療的同時等待腎臟自我修復，這也是 AKI 病死率居高不下的重要原因之一。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種具有自我更新和多向分化能力的多能干細胞，有免疫調節[7-8]、抗炎[9-10]和組織修復[11-12]等特性，可通過直接或間接機制緩解 IRI 造成的腎臟損傷，改善腎功能。但直接應用 MSC 存在引入受損活細胞、存儲、運輸、倫理等限制。近年，有研究表明 MSC 來源的外泌體（MSC-derived exosome，MSC-EXO）在保留 MSC 治療特性的同時，亦能克服應用 MSC 活細胞的限制，有望在 IRI-AKI 治療中發揮重要作用[9, 11]。本文就 MSC-EXO 治療 IRI-AKI 的作用和相關機制作一綜述，以期為相關領域的進一步研究和治療提供參考。
1 MSC-EXO 的一般特征
MSC 具有多向分化潛能、免疫調節功能、低免疫原性、容易獲得等眾多優點，與胚胎干細胞相比，MSC 存在于許多器官中，甚至在成人中也是如此，故在干細胞應用領域具有很強的優勢。外泌體為源于核內體的納米級膜性小泡，一般指直徑在 30～120 nm 的盤狀小泡，可于多種生物體液中存在，如血液、精液、腦脊液、滑膜液體、母乳、唾液、膽汁、腹水、羊水、胸水和尿液。它包含其細胞起源的各種分子成分，包括蛋白質、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）和微 RNA（microRNA，miRNA）或雙鏈 DNA，可調節免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等多種病理生理過程。
MSC-EXO 安全性高，在疾病的診斷標記、治療靶點、藥物運輸等多環節均有重要意義。目前，它們在癌癥[13]、免疫學、心血管[14]、呼吸[15]等各系統疾病中均被廣泛發現和應用。例如，外泌體中的蛋白可作為腫瘤病程進展的生物標志物[16]；MSC-EXO 可以通過遞送 miRNA、環狀 RNA 等遺傳物質抑制膀胱癌[17]、改善心肌梗死后的心臟功能[18]，也可通過傳遞谷胱甘肽過氧化物酶 1 促進肝臟氧化損傷的恢復[19]，還可通過介導 P38/MAPK/ERK 信號通路防止腎間質纖維化[20]等。
目前，用于治療藥物輸送的外泌體的開發仍處于初級階段，轉化研究和臨床應用的成本較高。但外泌體介導的藥物傳遞具有低毒性、低免疫原性和高度可工程化的特點，故有望廣泛用于疾病的無細胞治療。
2 MSC-EXO 通過免疫調節治療 IRI-AKI
炎癥反應和免疫調節在 IRI-AKI 過程中起重要作用[21-22]。腎臟 IRI 過程中，受損的細胞可釋放內源性分子-損傷相關分子模式（包括熱休克蛋白、高遷移率族蛋白 1、DNA 片段等），分泌白細胞介素（interleukin，IL）-1α、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子及單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-8 等趨化因子，激活固有免疫和適應性免疫應答，引發非感染性炎癥反應，促進 IRI-AKI 過程[23-24]。同時，IRI 可機械破壞腎血管內皮細胞完整性，增加血管通透性，促進免疫細胞滲入缺血后腎臟[25-26]。天然免疫系統和獲得性免疫系統的各種免疫細胞在 IRI 后腎損傷的發病機制中起著關鍵作用。在 IRI 中，缺血期的缺氧和隨后再灌注時產生的活性氧可以引發一系列以炎癥和細胞死亡為特征的有害反應[27]。IRI-AKI 過程有多種細胞和體液免疫成分參與[4, 22]。比如，核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、熱休克因子蛋白-1 和低氧誘導因子-1α 等在 IRI 后被激活[28-29]，可刺激一系列促炎細胞因子的合成[30-31]。巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞激活后可以釋放多種細胞因子和趨化因子，并提呈抗原。細胞因子和趨化因子是調節免疫細胞向缺血后腎臟炎癥細胞浸潤的重要介質。總之，在 AKI 發生早期和損傷修復過程中炎癥反應均發揮了重要作用。
目前，在 AKI 中已發現許多炎癥的分子介質，包括 NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白 3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體[32]、Toll 樣受體[33]，以及促進中性粒細胞和單核細胞介導的炎癥反應的各種分泌細胞因子[34-35]。NLRP3 是目前為止腎臟中最具特征性的炎癥體形成蛋白。細胞質天然免疫受體 NLRP3 主要在巨噬細胞和樹突狀細胞中表達[36]，可被各種刺激激活。NF-κB p65 磷酸化可觸發 NLRP3 炎癥小體的組裝，激活的 NLRP3 與胱天蛋白酶-1（caspase-1）前體和凋亡相關點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）結合。前體 caspase-1 轉化為具有催化活性的 caspase-1，促進 IL-1β 和 IL-18 成熟，引發強烈的炎癥反應[4]。
免疫調節與 NF-κB 等信號通路有著密切聯系。CARD6 基因可以激活 NF-κB 等信號通路。腎 IRI 誘導 tissp40 過表達，導致 NF-κB p65 磷酸化，CCL2/CCR2 誘導巨噬細胞 NF-κB 活化和炎癥因子表達，在 IRI 所致的腎損傷中起關鍵作用[37-38]。細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）可使 CARD6 較不使用 EV 刺激組呈現下降狀態[39]。MSC-EXO 可依賴 CCR2 蛋白作為誘餌改善 CCL2 誘導的炎癥因子 mRNA 的上調[40]，如 TNF-α、IL-6 和 IL-1β，進而抑制外周單核/巨噬細胞的募集和激活，減少 IRI 術后巨噬細胞的浸潤，最終改善腎功能。其處理的巨噬細胞中 NF-κB 的磷酸化 p65 顯著降低。
研究發現，MSC-EXO 可通過抑制 T 細胞和巨噬細胞浸潤緩解 AKI，且這種緩解能力與外泌體的數量或濃度密切相關，3D 培養可更高效地生產獲得 MSC-EXO[41]。使用 3D-EXO 處理的 AKI 小鼠體內 TNF-α、MCP-1、IL-6 和 IL-1β mRNA 表達顯著降低，NF-κB p65 磷酸化表達降低。細胞因子細胞外熱休克蛋白 70 也可通過 CD14 與單核細胞結合，激活 NF-κB 信號，增加 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的產生[42]。MSC 來源的 EV 治療順鉑誘導的 AKI 時，可獨立或協同抑制熱休克蛋白 70，導致 NLRP3 炎癥小體和下游促炎細胞因子表達減少，最終改善腎功能[43]。
MSC-EXO 可以通過調控炎細胞增殖、浸潤、炎性細胞因子等改善 AKI，為 AKI 的治療帶來了新的曙光。學者們正進一步嘗試不同方式優化 MSC-EXO 調控炎癥反應的能力[41, 44]，以提高 MSC-EXO 的有效性和安全性。
3 MSC-EXO 通過氧化應激治療 IRI-AKI
MSC-EXO 可以通過緩解氧化應激改善腎臟功能（圖1）。在正常的生理條件下，活性氧的產生和消除是平衡的，而當這種平衡被破壞時，就會產生氧化應激[45]，導致氧化還原信號中斷與相應的分子損傷。氧化應激是引起 IRI-AKI 的主要原因之一。腎小管中含有豐富的線粒體，線粒體是活性氧產生的主要場所，其功能障礙在腎 IRI 損傷中與氧化應激有密切聯系[46-47]。IRI 后，氧化應激誘導腎小管中活性氧的過度積累，破壞線粒體 DNA 并導致下一代線粒體的突變[48]。高濃度的活性氧可導致腎細胞線粒體破碎和破壞，從而引發腎細胞壞死和凋亡，并釋放促凋亡蛋白[49]。
圖1
MSC-EXO/EV 于腎臟氧化應激的機制
SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；GPX：谷胱甘肽過氧化物酶；MDA：丙二醛；HIF-1α：低氧誘導因子-1α；NOX2：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 2；Nrf2：核因子 E2 相關因子；ARE：抗氧化反應元件；Keap1：Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白 1；TFAM：線粒體轉錄因子 A；mtDNA：線粒體 DNA；ROS：活性氧；OXPHOS：氧化磷酸化；↑：增多、上升；↓：減少、下降
學者在 IRI-AKI 大鼠中發現，褪黑素預處理后 MSC-EXO 可通過降低丙二醛含量、低氧誘導因子-1α mRNA 水平和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 2 蛋白表達，并通過誘導超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶和上調 HO1 基因的表達，發揮更強的減輕腎氧化應激的作用[44]。同時，人臍帶來源的 MSC 釋放的 EV 也被證實可以通過抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-2 [50-51]的表達或增強核因子 E2 相關因子-2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應元件 [52]的激活，減輕氧化應激，從而減輕 IRI 對腎臟的損傷。
外泌體或 EV 可發揮天然的抗氧化酶活性，其固有的抗氧化酶可在各種病理條件下直接減輕氧化應激。它們也可間接影響氧化應激[53]：將藥物輸送到靶細胞，調節與氧化應激相關的信號通路。線粒體依賴于 Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（the epoxy chloropropane Kelch sample related protein 1，Keap1）-Nrf2 信號通路發揮抗氧化作用，阻止額外活性氧的產生。MSC-EV 則可通過轉導 miRNA-200a-3p 靶向激活腎小管上皮細胞（tubular epithelia cell，TEC）的 Keap1-Nrf2 信號通路，在 mRNA 和蛋白水平上顯著增加 TEC 中 Nrf2 表達，降低 Keap1 表達，通過調節線粒體結構和功能，降低活性氧水平，保護 TEC 免受氧化損傷，促進腎功能恢復[54]。也有研究表明，在 IRI-AKI 小鼠模型中，應用 MSC-EV 可恢復線粒體轉錄因子-A（recombinant transcription factor A，TFAM）蛋白和 TFAM-線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）復合物（類核）的穩定性，從而逆轉受損腎小管細胞中的 mtDNA 缺失和線粒體氧化磷酸化缺陷以改善小鼠腎臟功能[9]。
4 MSC-EXO 通過抗凋亡治療 IRI-AKI
在 AKI 過程中，多種形式的細胞死亡包括凋亡、調節性壞死、自噬、有絲分裂災難等可導致腎損傷[55-56]。IRI-AKI 的主要特征也表現為凋亡和腎小管細胞壞死。IRI 可引發一系列有害的細胞反應，導致細胞損傷，通過鐵死亡和壞死性凋亡等調節性壞死導致細胞膜破裂，引起細胞質成分釋放，繼而激活炎癥和免疫系統，最終導致細胞死亡[2, 6]。MSC-EXO 可通過多種途徑減輕腎細胞凋亡或壞死（圖2）。
圖2
MSC-EXO/EV 于腎臟細胞凋亡、壞死的機制
caspase：胱天蛋白酶；PARP1：聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1；Bcl-2：B 淋巴細胞瘤-2 基因；Bax：BCL-2 關聯 X 的蛋白質；SHC1：含 Src 同源性 2 域轉化蛋白 1；EGFR：表皮生長因子受體；ERK：細胞外調節蛋白激酶；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；↑：增多、上升；↓：減少、下降
近端小管細胞抑癌基因 p53 的激活可通過調節細胞周期阻滯、凋亡和自噬等多種細胞生物學過程，在 IRI-AKI 的發病機制中起重要作用[57-58]。細胞周期阻滯可最終導致細胞衰老或死亡，故而搶救細胞周期 G2/M 阻滯的 TEC 可能成為 AKI 治療的關鍵。MSC-EXO 可通過靶向調控 AKI 的細胞周期阻滯、TEC 凋亡等來促進腎小管修復。在 IRI 誘導的 AKI 小鼠和體外實驗中，Cao 等[59]發現 MSC-EXO 可通過抑制 miR-125b-5p/p53 通路減弱 G2/M 阻滯，使 HK-2 細胞凋亡明顯抑制，表現為凋亡相關蛋白 Bax 和 caspase-3 表達下降，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達上調。對 IRI 的研究也發現，MSC-EXO 可降低 caspase-3 活性和基因表達，并降低抗凋亡標志物聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1、Bax 的 mRNA 水平，通過增加 Bcl-2 誘導抗凋亡作用，顯著減輕細胞凋亡。使用褪黑素預處理 MSC-EXO 則可獲得更好效果[44]。
研究顯示：腎固有細胞在 IRI 后，MSC-EV 的攝取增加，EV 通過轉移或誘導 miRNA 來調節細胞恢復的重要信號通路[60]。miRNA 預測靶點表明，靶向 caspase-3 的 miR-410、miR-495、miR-548c-5p 和 let-7a 以及靶向 caspase-7 的 miR-375、miR-495 和 miR-548c-5p 可能調控細胞凋亡。MSC-EV 的使用可使 caspase-3 和 caspase-7 減少，表明這些上調的 miRNA 可能參與調控減少三磷酸腺苷耗竭促進的腎細胞死亡。這些上調的 miRNA 也可能與含 Src 同源性 2 域轉化蛋白 1（Src homology 2 domain containing transforming protein 1，SHC1）的下調有關，SHC1 可能參與腎細胞的保護作用，也可通過抑制促生存的表皮生長因子受體-ras-細胞外調節蛋白激酶通路而導致細胞死亡[61]，SHC1 的下調則參與腎細胞的保護作用。
此外，在小鼠 AKI 模型中，MSC-EV 可通過 miRNA let-7a-5p 激活自噬途徑改善 AKI 導致的腎功能下降。RradD 是參與氨基酸傳感途徑的基因之一，含有 miRNA let-7a-5p 的 MSC-EV 靶向調控 RradD mRNA，激活下游的自噬途徑[62]，從而改善 AKI 中腎細胞凋亡，提高 AKI 修復潛力。同時，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸水凝膠可增強 EV 的抗凋亡作用[11]。
5 MSC-EXO 通過促進再生治療 IRI-AKI
與 MSC 直接定植于受損腎小管，促進腎功能恢復相比，MSC 通過旁分泌途徑發揮腎臟保護、促進腎臟組織再生作用的機制逐漸被廣泛認可（圖3）。關于 MSC-EXO 對腎 IRI 的研究發現，MSC-EXO 通過調控堿性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子和性別決定區域 Y 相關的高遷移率族框-9（sex determining region Y-box 9，Sox-9）蛋白改善腎組織再生，通過調控血管內皮生長因子基因增強血管生成[44]。MSC-EV 也被證明可以刺激損傷腎臟的再生。腎臟再生被認為與 Sox-9 的激活有密切關系。在 EV 治療和 Sox-9 細胞依賴性再生的激活機制的研究中，通過嵌入的腹部成像窗口進行雙光子活體顯微鏡的體內譜系追蹤來跟蹤誘導的 Sox-9-Cre 轉基因小鼠中的 Sox-9 細胞發現，EV 可以在靜脈注射后前往受傷的腎臟，并顯著增加 Sox-9 的活化[63]。此外，EV 可促進 AKI 后腎臟中 Sox-9 活化細胞的擴增。Sox-9 細胞的后代有助于腎小管再生，從而顯著改善 AKI 后的腎功能。
圖3
MSC-EXO/EV 促進腎組織再生的機制
VEGF：血管內皮生長因子；bFGF：堿性成纖維細胞生長因子；HGF：肝細胞生長因子；Sox-9：性別決定區域 Y 相關的高遷移率族框-9；IGF-1：胰島素樣生長因子-1；↑：增多、上升；↓：減少、下降
目前，人們普遍認為外泌體活動主要涉及遺傳物質的轉移[12]。如，骨髓 MSC-EV 可攜帶特定的 mRNA，進而刺激受損的細胞重新進入細胞周期[64]，骨髓 MSC-EV 中存在的人胰島素樣生長因子-1 受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）mRNA 轉移到腎小管細胞促使腎臟恢復[65]。臍血 MSC-EV 可通過促進腎小管細胞去分化和生長從而刺激其增殖，改善腎功能[66-67]。
IGF-1R 的 mRNA 可通過外泌體轉移到 TEC，增強 TEC 對局部產生的胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）的敏感性[65]。使用表達 IGF-1R，但不表達 IGF-1-mRNA 的外泌體和同時表達 IGF-1R 和 IGF-1-mRNA 的人骨髓 MSC 進行實驗發現，缺乏 IGF-1R 的細胞暴露在人骨髓 MSC 衍生的外泌體中，獲得了人 IGF-1R 轉錄本，該轉錄本被翻譯成相應的蛋白質。將 IGF-1R mRNA 從外泌體轉移到順鉑損傷的近端腎小管細胞（proximal tubule epithelial cell，PTEC）可促進 PTEC 增殖。損傷的 PTEC 與外泌體和可溶性 IGF-1 共同孵育則可進一步促進細胞增殖。這也一定程度上解釋了體內觀察到少量骨髓 MSC 卻擁有較強的腎保護作用的現象。
6 結語
目前已有實驗顯示 MSC-EXO 可以通過多種機制保護腎臟，并在其基礎上使用修飾預處理等方式增強 MSC-EXO 的治療效果。目前雖有不少動物模型和體外科研數據表明 MSC-EXO 在治療 IRI-AKI 中發揮顯著作用，但其研究仍處于初期階段，這些結果仍未得到臨床研究的驗證，故仍需更多的研究對 MSC-EXO 在 IRI-AKI 領域中的機制和作用進行探索。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
