肺部感染的發病率與病死率在世界感染性疾病中處于高位，快速準確的病原學診斷是進行及時且有效治療的關鍵。宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術突破了傳統病原微生物檢測方法的局限，提高了病原體的檢出率。該文對 mNGS 技術在肺部的細菌、真菌、病毒及混合感染診斷中的應用及優勢進行分析，并對其在 RNA 檢測、厚壁菌破壁及宿主 DNA 清除等方面面臨的挑戰和突破進行闡述，以期通過 mNGS 實現靶向、精準的病原學診斷，從而有效治療肺部感染。
引用本文： 趙澤玉, 王慧. 宏基因組二代測序在肺部感染診斷中的應用與挑戰. 華西醫學, 2022, 37(8): 1231-1237. doi: 10.7507/1002-0179.202205127 復制
肺部感染是指細菌、病毒及真菌等各類病原體引起的氣管、支氣管和肺實質的感染。肺部感染在世界范圍內仍是高發病率和高病死率的一種感染性疾病[1]，快速準確地檢測出病原體對于指導臨床用藥至關重要。傳統病原微生物檢測方法在時效性、特異度、靈敏度等方面均不能滿足臨床需求，而隨著基因測序技術和生物信息學方法的進步，宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術越來越多地應用于肺部感染性疾病的診治中。1977 年，Sanger 等[2]發明了第一代測序技術，稱為 Sanger 測序法，使得基因測序成為可能。2005 年，基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統 Genome Sequencer 20 System 被 Nature 報道，開創了新一代測序的先河[3]。2008 年 Palacios 等[4]利用 mNGS 發現了沙粒病毒，2011 年 Xu 等[5]利用 mNGS 發現了新型布尼亞病毒，開啟了 mNGS 技術在臨床感染中應用的先例。2014 年，mNGS 應用于一名患有嚴重聯合免疫缺陷的 14 歲男孩，診斷出神經系統鉤端螺旋體感染，在予以對應抗菌藥物治療后，患者狀態恢復至接近病前；此次應用掀起了 mNGS 技術在病原微生物鑒定領域，尤其是疑難微生物鑒定方面的應用熱潮[6]。2018 年，Miao 等[7]回顧性分析了 2017 年 4 月－12 月在復旦大學附屬中山醫院發生的 561 例疑似急性或慢性感染病例，比較了 mNGS 和傳統培養方法在病原體診斷效能方面的差異，結果顯示 mNGS 在病原體識別方面具有更高的靈敏度。至此以后，mNGS 在國內的臨床應用迅速發展起來。研究顯示，mNGS 技術可檢出的病原體已覆蓋了較大范圍的細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原微生物，這為肺部感染性疾病的精確診斷作出了重大貢獻[8]。但 mNGS 同時存在諸如污染菌干擾、厚壁菌破壁困難、RNA 檢測困難及宿主 DNA 干擾等問題。本文將對 mNGS 在肺部感染性疾病診治方面的應用情況、研究進展，以及面臨的挑戰進行綜述。
1 mNGS 技術的優勢
mNGS 即病原宏基因組學技術，它不依賴于傳統微生物培養，而是直接提取標本中的全部核酸進行高通量測序，通過對生物信息的分析，去除人源序列后，將篩選出的數據與病原數據庫進行比對，獲得疑似致病微生物的種屬信息。mNGS 具有無偏倚、廣覆蓋、高靈敏度和速度快的特點[9]。與 mNGS 檢測技術相比，微生物培養、鏡下涂片、組織病理學等傳統檢測技術有檢測時間久、陽性率低和可檢病原體種類有限等局限[10]。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術較傳統微生物檢測方法更快速、靈敏，但其必須基于已知病原體的基因序列，且假陽性或假陰性概率較高[11]。mNGS 可測出樣本中所有微生物，而不似 PCR 只有單一靶標，同時無需提前獲悉待測病原體的序列信息。mNGS 可彌補 PCR 的缺點，并能監測病毒傳播過程中可能的變異，同時對于部分病毒含量較低的樣本，mNGS 可提高檢測陽性率[12]。mNGS 也可在病原培養后做深度的二代測序，甚至全基因組分析，為預防以后同類型傳染病的暴發積累經驗。除了病原體鑒定，mNGS 還可提供額外基因組信息用于呼吸道微生物組分析、人類宿主反應分析和耐藥性預測，所有這些都更有利于對患者的臨床干預。mNGS 還具有不易受抗生素暴露影響的優勢。有研究指出，在未接觸抗生素治療的患者中，mNGS 與培養之間的靈敏度沒有顯著差異（43.3% vs. 36.7%，P=0.1）；然而，在有抗生素暴露史患者中，mNGS 的靈敏度顯著高于培養（52.7% vs. 34.4%，P<0.01）[7]。
2 mNGS 相關肺部感染診斷標本的選擇
不同類型的肺部感染性疾病，病原微生物的分布不同。mNGS 相關肺部感染標本的選擇具有多樣性，如痰液、血液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、經支氣管鏡肺活檢術（transbronchial lung biopsy，TBLB）標本、支氣管刷檢標本等均可作為檢測樣本[13]。痰標本是肺部感染患者的常規檢查項目，但是痰標本需要經呼吸道咳出，這樣會帶入大量的口腔定植菌，從而干擾檢測結果。深部痰可一定程度避免口腔定植菌污染，但僅適用于氣管插管的危重患者。BALF、TBLB 及支氣管刷檢標本等皆經支氣管鏡獲得，盡管上呼吸道定植菌對此類標本的干擾較痰標本小，但仍不能完全避免干擾。為了盡可能減少上呼吸道定植菌的干擾，在開始使用纖維支氣管鏡之前，患者應在醫護人員的指導下先用無菌生理鹽水漱口，減少口腔污染菌的數量，如有假牙應先摘掉。另外，應采用保護性支氣管肺泡灌洗技術，勿從支氣管鏡的工作腔中吸取灌洗液標本，也能有效避免上呼吸道菌群的污染；標本采集順序為支氣管灌洗液、BALF、毛刷標本和活檢標本，應避免帶血[14]。BALF 標本位于深部肺組織，人源性核酸含量低，對結果干擾最小，對深部肺部感染有較好的代表性，故其在肺部感染的標本選擇中常排在首要位置，研究也顯示 BALF 標本的 mNGS 檢測效率優于傳統培養方法[8, 15-17]。Wang 等[18]使用 mNGS 檢測了 39 例疑似感染性外周肺病變患者的 BALF、TBLB 和支氣管刷檢標本中的病原體，結果顯示對于上述 3 類標本中的細菌和真菌檢測，mNGS 比傳統培養方法更靈敏，但三者之間 mNGS 檢測靈敏度沒有顯著差異。重癥肺炎患者常并發血流感染，外周血的采集過程不受口腔定植菌的干擾，且采集方便，故盡管血液標本靈敏度不如 BALF 高，但當存在菌血癥或膿毒血癥時，血液標本更適用于 mNGS 檢測[19-20]。Chen 等[21]對 20 例重癥肺炎患者的 BALF 和血液標本進行常規微生物學檢查和 mNGS 檢測潛在的病原體，結果顯示 10 例 mNGS 陽性重癥肺炎患者中 BALF 標本和血標本同時檢出了病原體，因此對伴有血流感染的重癥肺炎患者，可以采用血液標本進行 mNGS 檢測；但由于血流感染的異質性較大，目前針對血流感染者尚缺乏大樣本 mNGS 診斷效能方面的研究。綜上，mNGS 檢測可選樣本具有多樣性，可因病而異選擇最佳檢測標本。
3 mNGS 在肺部細菌、真菌、病毒及混合感染中的應用
3.1 mNGS 在肺部細菌感染中的應用
細菌是肺部感染中常見的病原體之一。傳統的微生物學診斷方法包括痰培養、血培養等，但其檢測周期長，陽性率低，靈敏度低[7]。在細菌檢測方法的選擇上，mNGS 要優于傳統微生物培養方法。Liu 等[13]使用 mNGS 技術和傳統微生物培養方法，檢測了 2019 年 5 月－2021 年 4 月在中南大學湘雅三醫院就診的社區獲得性肺炎患者的 BALF 標本中的病原體，結果顯示 mNGS 檢出病原菌陽性率為 64%，BALF 培養僅為 28%。Xie 等[1]回顧性分析了 140 例疑似肺部感染住院患者的 mNGS 和常規檢測結果，結果顯示 mNGS 與常規診斷檢測的病原體陽性檢出率存在顯著差異（82.14% vs. 35.71%，P<0.05），mNGS 對肺部感染診斷的靈敏度高于常規檢測（89.17% vs. 50.00%，P<0.01），但特異度沒有明顯差別（75.00% vs. 81.82%，P>0.05）。Qian 等[22]對復旦大學附屬華山醫院的 100 例患者通過 mNGS 及傳統培養檢測細菌，結果顯示培養檢出病原菌 54 份，病原菌共計 70 種，mNGS 共檢出病原菌 95 份，病原菌共計 225 種；mNGS 對病原菌的檢測比傳統培養具有更高的靈敏度（95% vs. 54%，P<0.001）。目前，mNGS 技術常用于混合、罕見、難檢出的病原體，如結核分枝桿菌、新生隱球菌等，并在檢測時長方面具有明顯優勢。如 Ma 等[23]報告了 1 例 82 歲老年患者，在經過多次包括支氣管鏡檢查在內的結核相關檢查均未發現結核分枝桿菌感染的情況下，對 BALF 行 mNGS 檢測檢出了結核分枝桿菌和白色假絲酵母菌。Shi 等[24]通過對 110 例疑診肺結核患者的 BALF 標本進行 mNGS 檢測，并與常規微生物檢測（結核 X-pert 檢測、分枝桿菌培養及抗酸桿菌染色）和最終臨床診斷進行了比較，結果顯示 mNGS 對結核分枝桿菌的檢測顯示出 47.92%的靈敏度，這與結核 X-pert 檢測（45.83%）和分枝桿菌培養（46.81%）相比無明顯差異，但高于抗酸桿菌染色（29.17%）對 BALF 結核病診斷的靈敏度。然而，目前鮮有描述 mNGS 在疑似肺結核患者中應用的研究，還需更多的臨床應用來驗證其檢測效果。
3.2 mNGS 在肺部真菌感染中的應用
傳統意義上，真菌感染的實驗室診斷依賴于真菌病原體的分離，或在染色劑的幫助下對臨床標本進行直接顯微鏡檢查。真菌病原體的培養，特別是絲狀真菌，通常需要 1～2 周的孵育時間，而且鑒定時也非常具有挑戰性。常用真菌抗原如（1, 3）-β-D 葡聚糖檢測和半乳甘露聚糖檢測的靈敏度和特異度都較低[25]。mNGS 作為病原體檢測的新興技術，在真菌檢測領域逐漸嶄露頭角。比較有代表性的是 Yang 等[26]回顧性研究了 106 例疑似肺部真菌感染患者，比較了 mNGS 檢測與常規測試的診斷性能，結果顯示 mNGS 技術對 TBLB、BALF 標本在診斷肺部真菌感染方面的靈敏度顯著高于常規檢測（常規檢測 vs. TBLB-mNGS：44.4% vs. 80.0%，P<0.05；常規檢測 vs. BALF-mNGS：44.4% vs. 84.4%，P<0.05），mNGS 與常規檢測的特異度無顯著差異（常規檢測 vs. TBLB-mNGS：88.52% vs. 91.8%；常規檢測 vs. BALF-mNGS：88.52% vs. 85.3%）。Li 等[27]利用 mNGS 技術檢測出了 1 例由皮炎外瓶霉引起的罕見肺真菌病病例，及時指導臨床用藥，并最終改善了治療效果。Lu 等[28]對 4 份非 HIV 感染的肺孢子菌肺炎病例，使用 mNGS 與傳統檢測方法進行檢測結果的比較，結果顯示 mNGS 檢測出肺孢子菌的時間明顯短于傳統檢測方法。Sun 等[29]納入 198 例非 HIV 免疫抑制重癥肺炎患者，其中肺孢子菌 77 例，通過使用 mNGS 技術和常規檢測方法（血真菌 G 試驗/乳酸脫氫酶和 BALF-顯微鏡）對這些患者的 BALF 標本進行檢測，發現 mNGS 檢測出的肺孢子菌靈敏度為 97.4%，明顯高于常規方法檢測結果（血真菌 G 試驗/乳酸脫氫酶為 87.01%，BALF-顯微鏡為 46.75%），特異度居中（BALF-mNGS 為 85.12%，血真菌 G 試驗/乳酸脫氫酶為 59.50%，BALF-顯微鏡為 100%）。Xu 等[30]對 12 例腎移植患者進行 BALF 的 mNGS 檢測，結果肺孢子菌檢出陽性率達到了 54.5%。以上研究均指出了 mNGS 技術檢測肺孢子菌的優勢所在。綜上，臨床中疑似肺部真菌感染的患者，在傳統檢測方法均未取得指導性檢驗結果的情況下，建議獲取患者 TBLB 或 BALF 標本進行 mNGS 檢測，以盡早測出病原菌，指導臨床用藥。
3.3 mNGS 在肺部病毒感染中的應用
除細菌、真菌等感染外，肺部感染可由病毒引起，如偏肺病毒、鼻病毒、冠狀病毒及呼吸道合胞病毒等[12]。傳統的病毒檢測方法主要包括血清學試驗（抗原和抗體檢測）和核酸檢測等，這些常規檢測方法往往需要提前預設病原體的種類，且現有檢測方法只能覆蓋少部分病毒，而 mNGS 檢測幾乎可檢測樣本中所有的病原體，因此在病原檢測中具有明顯優勢。研究表明，嚴重急性呼吸綜合征、中東呼吸綜合征以及新型冠狀病毒肺炎這三大嚴重的呼吸系統疾病都與新型冠狀病毒密切相關[31]。除新發病原體外，有關研究也提出了 mNGS 能檢測出常規方法難以檢測到的病毒。van Boheemen 等[12]利用 mNGS 對 25 個呼吸道樣本進行了回顧性研究，結果與 PCR 相比，mNGS 的靈敏度為 83%，特異度為 94%，且檢測出了傳統微生物方法無法檢測到的病毒，如丙型流感病毒、KI 多瘤病毒、巨細胞病毒和腸道病毒等。Shi 等[32]的研究指出，mNGS 不僅能檢測出新型冠狀病毒，同時能檢測出傳統培養方法無法檢測出的呼吸道、血液和胃腸道中潛伏的人類皰疹病毒 1 型。
3.4 mNGS 在混合性肺部感染中的應用
混合性肺部感染患者體內往往存在多種病原體，其臨床癥狀較單一，肺部感染更重，且病情發展快，病死率高，故需要在短時間內準確找到病原體。與傳統檢測相比，mNGS 的病原體檢測范圍更廣。Wang 等[33]回顧性分析了納入的 55 例混合性肺部感染病例，結果顯示 mNGS 診斷混合性肺部感染的靈敏度遠高于常規檢測（97.2% vs. 13.9%，P<0.01），但特異度相反（63.2% vs. 94.7%，P=0.07)。Chen 等[34]回顧性研究了 20 例混合感染患者的檢測結果，雖然兩者均檢測出多種病原菌，但 mNGS 技術鑒定出 79 種細菌、4 種真菌和 7 種病毒，而傳統培養方法僅僅鑒定出 9 種細菌和 8 種真菌，提示 mNGS 對多重病原體感染診斷有絕對優勢。
3.5 mNGS 診斷的特異度問題
綜上，mNGS 檢測病原體的靈敏度均遠高于傳統檢測方法，正是基于 mNGS 檢測技術的無偏性和高度靈敏的特點，mNGS 可能會導致報告出現假陽性結果，未能正確解釋檢測報告可能會導致錯誤的疾病診斷，故其特異度較傳統檢測方法并不突出，甚至更低。要改進 mNGS 檢測技術特異度的問題，首先，應該盡量減少環境污染菌、呼吸道定植菌和人類宿主 DNA 的干擾；其次，假陽性結果的出現可能是因為數據庫中根據種水平的不同，參考基因組可能由數十至數千臨床株系融合而成，同屬或同種不同株系微生物在致病力、流行病學方面可能存在較大差異，而 mNGS 技術檢測出的病原體可能種水平相同，而株系不同，這就需要重點關注和報告種水平的特異性序列，提高分辨率和特異度。
4 mNGS 技術面臨的挑戰與突破
4.1 污染菌的干擾
mNGS 技術面臨污染菌的干擾，這是目前所面臨的重要挑戰之一。環境菌的污染包括來源于采集標本時的醫院環境污染，運輸過程中的樣本污染，甚至是實驗室的試劑污染和試劑盒污染等。對于避免環境中、試劑中、容器中的病原菌污染，嚴格遵守檢測流程的質量控制程序非常重要。我國已有專家共識對 mNGS 技術進行了樣本采集、測序和結果解讀的規范[35-38]。為了避免環境菌污染，首先在采集標本時要做到無菌操作，并明確具體的工作流程和人員配備方式；其次，在運輸過程中一定要避免樣本暴露導致的樣本污染；再者，對于 mNGS 實驗室操作而言，工作人員應花大量時間進行分子生物學技術培訓以熟悉實驗操作，因為最關鍵的往往是重復性工作，如移液器的規范操作，避免反應試劑錯加、漏加或工作流程中關鍵步驟的遺漏等。
4.2 臨床解讀
與環境污染菌相比，人體定植菌的消除才是更為嚴峻的挑戰。Langelier 等[39]對 20 例下呼吸道感染患者開發了 logistic 回歸模型和基于規則的模型來區分可能的病原體和氣道微生物，結果顯示，所有臨床證實的下呼吸道病原體平均占所有樣本讀數的 99%。準確識別病原體并提供用藥指南是微生物檢測的最終目標，除參考病原體檢測結果外，還需結合患者臨床表現、免疫狀態和基礎疾病進行綜合評估，以檢出真正的病原體。
4.3 RNA 檢測困難
核酸質量是 mNGS 檢測成功的關鍵因素，人體 RNA 豐度高且復雜，RNA 不如 DNA 穩定，可以被存在于皮膚、血液和組織中的內源性核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）以及外源性 RNase 降解。為了盡可能保持 RNA 完整性，最大程度地避免外源性 RNase 污染和抑制內源性 RNase 的活力，首先應創造無外源性 RNase 的操作環境，目前已有專家共識提出 mNGS 送檢標準[37]。外源性 RNase 主要來源于與材料接觸的實驗器材和操作人員的呼吸、手接觸，因此在試驗操作之前必須將實驗器材進行高溫滅菌處理，操作者必須戴帽子、口罩、手套。內源性 RNase 來源于紅細胞裂解釋放的 RNase 和白細胞中的 RNase，在培養細胞中加入裂解液可使細胞裂解，同時裂解液中的有效成分可以抑制胞內 RNase，進而使 RNA 保持完整。除避免 RNase 的干擾以保持 RNA 完整性外，優化 RNA 流程的核酸提取、建庫等方法以提高 RNA 檢出效率也同樣重要。Deng 等[40]提出的帶有加標引物富集的宏基因組測序方法是一種新型 RNA 富集策略，其流程簡單，成本較低，保留了 mNGS 的檢測廣度，同時提高了 RNA 檢測效率，使得 RNA 檢測向前跨進了一大步，但該研究成果還未廣泛應用于臨床，還需更多的實驗數據予以支撐。He 等[41]對 151 例肺炎患者的痰標本與 BALF 標本使用 TruePrep DNA Library PrepKit V2 for Illumina 進行文庫制備，與另外 2 種商業 RNA 文庫制備試劑盒（NEB UltraⅡ和 Vazyme TR503）比較，結果表明，使用 TruePrep 技術制備出的文庫，能使 mNGS 檢測出更多的病原菌，使得 RNA 病毒檢測能力有所提高。目前常用的 RNA 測序技術多種多樣，但大多數測序技術過程復雜，成本昂貴，且對 RNA 總量和濃度的要求高，在對微量 RNA 病原體檢測時常顯不足。陸泓雨等[42]建立了一套簡便的、對 RNA 樣本起始量要求很低的微量 RNA 建庫技術，提高了微量 RNA 檢出量，盡管該技術未用于微量 RNA 樣品的 mNGS 測序，但這對 mNGS 測序技術的發展起到了推動作用。
4.4 厚壁菌破壁困難
胞內寄生菌、真菌（具有復雜的細胞結構且細胞壁外還有一層厚厚的莢膜）、結核分枝桿菌（細胞壁外有分枝菌酸）、布魯菌、諾卡菌等常見病原體破壁困難，核酸序列豐度低，檢出困難，需要提高破壁技術，來提升陽性率。相關研究表明，采用珠子攪拌破壞細胞壁的方案，可以提高馬拉色菌科 27 屬的 DNA 產量[43]。Angebault 等[44]對法國 Mondor 醫院的 6 個痰液標本進行細菌和真菌培養，后將培養過的痰標本移入 PowerLyzer 0.1 mm 玻璃珠管中進行細胞壁的機械裂解，隨后使用自動 QIAsymphony 提取和手動 PowerSoil MoBio 提取 2 種方法提取標本中的病原體 DNA，再使用 V1-V2 和 V4-V3 16S 靶向擴增子測序檢測細菌多樣性和群落結構，最終檢測到鏈球菌等革蘭陽性菌。Vesty 等[45]比較了真菌和細菌口腔 16S/ITS 靶向擴增子測序的 4 種提取方案，指出包含酶裂解步驟的方案能增強唾液中 DNA 的提取效率。Huseyin 等[46]比較了 5 種提取腸道菌群病原體 DNA 的方案，提出只有包含珠擊步驟的方法才能提取足夠數量的病原體 DNA，盡管該研究的致病病原體與肺部感染無關，但使用的破壁技術對肺部感染厚壁菌的 mNGS 檢測具有指導意義。隨著生物學的發展，難破壁病原體的 mNGS 檢測技術有很大突破，但在肺部感染性疾病中，除有細胞結構的病原體外，還存在病毒、寄生蟲等病原體感染。Deng 等[40]開發的帶有加標引物富集的宏基因組測序技術以平均 10 倍的富集度擴增了指定的病毒基因組，提高了特定病毒病原體的檢測靈敏度。此外，除了提高破壁技術和使用加標引物富集的宏基因組測序方法外，在這些低豐度核酸序列病原體的診斷過程中需要結合宿主因素、流行病學史、影像學特征、病理學特征、實驗室檢查結果及抗生素治療反應，進行綜合評估以檢出精確的病原體。
4.5 人類宿主 DNA 的干擾及其他
肺部感染患者的呼吸道樣本中含有大量的人類宿主 DNA，95%的原始 mNGS 讀數來自鼻咽抽吸物樣本中的人類 DNA，這使得 mNGS 檢測病原體標本的靈敏度降低[47]。現有的增加微生物核酸提取率的方法包括反向富集方法（過濾法、超速離心法、差異裂解法、去甲基化磁珠等）和正向富集方法（多重 PCR 和探針捕獲）。在反向富集方法中，過濾法和超速離心法屬于物理分離技術，其基于宿主細胞與微生物大小差異或其他物理差異對宿主細胞進行清除，這種方法簡單易操作，但僅可用于去除完整性較好的人源細胞；差異裂解法則利用人源細胞與微生物細胞結構差異，選擇性地裂解宿主細胞，利用核酸酶酶解掉釋放出來的宿主 DNA，最后進行病原體 DNA 的富集純化[48-49]；在正向富集方法中，多重 PCR 操作簡單，周期短，適用于目標明確、區域不大的應用；而捕獲探針試驗操作復雜，周期長，適合大范圍地尋找可能的致病源，如罕見病原體的檢測[50]。相較前幾種核酸提取方法，Charalampous 等[51]提出的一種優化的基于皂苷的宿主 DNA 去除方法即納米孔測序技術，其去除宿主 DNA 的能力更強，該方法可去除呼吸道樣本中 99.99%的人類 DNA。但由于使用額外的試劑，外源性背景污染的風險也隨之升高。此外，檢測周期較長、價格昂貴也限制了 mNGS 成為常規檢測項目，如何加速病原體檢出時間及降低成本費用，也是推進臨床應用和研究的關鍵。
5 小結與展望
總之，本文通過閱讀國內外大量文獻，對 mNGS 的應用進展及面臨的挑戰進行了綜述。mNGS 是一種具有顯著優勢的病原體新興檢測手段，其在肺部感染的病原體診斷中突破了傳統培養方法的局限，擴展了人們對病原體的認識。然而，mNGS 技術在肺部感染診斷中的應用并未普及，如何規范發展 mNGS 技術，使其成為高靈敏度、快速、廣譜、無創性且親民的病原微生物檢測技術是我們的前進目標。相信隨著相關研究的繼續深入，mNGS 將有望成為肺部感染甚至其他感染性疾病診斷的有力工具之一。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
肺部感染是指細菌、病毒及真菌等各類病原體引起的氣管、支氣管和肺實質的感染。肺部感染在世界范圍內仍是高發病率和高病死率的一種感染性疾病[1]，快速準確地檢測出病原體對于指導臨床用藥至關重要。傳統病原微生物檢測方法在時效性、特異度、靈敏度等方面均不能滿足臨床需求，而隨著基因測序技術和生物信息學方法的進步，宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術越來越多地應用于肺部感染性疾病的診治中。1977 年，Sanger 等[2]發明了第一代測序技術，稱為 Sanger 測序法，使得基因測序成為可能。2005 年，基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統 Genome Sequencer 20 System 被 Nature 報道，開創了新一代測序的先河[3]。2008 年 Palacios 等[4]利用 mNGS 發現了沙粒病毒，2011 年 Xu 等[5]利用 mNGS 發現了新型布尼亞病毒，開啟了 mNGS 技術在臨床感染中應用的先例。2014 年，mNGS 應用于一名患有嚴重聯合免疫缺陷的 14 歲男孩，診斷出神經系統鉤端螺旋體感染，在予以對應抗菌藥物治療后，患者狀態恢復至接近病前；此次應用掀起了 mNGS 技術在病原微生物鑒定領域，尤其是疑難微生物鑒定方面的應用熱潮[6]。2018 年，Miao 等[7]回顧性分析了 2017 年 4 月－12 月在復旦大學附屬中山醫院發生的 561 例疑似急性或慢性感染病例，比較了 mNGS 和傳統培養方法在病原體診斷效能方面的差異，結果顯示 mNGS 在病原體識別方面具有更高的靈敏度。至此以后，mNGS 在國內的臨床應用迅速發展起來。研究顯示，mNGS 技術可檢出的病原體已覆蓋了較大范圍的細菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原微生物，這為肺部感染性疾病的精確診斷作出了重大貢獻[8]。但 mNGS 同時存在諸如污染菌干擾、厚壁菌破壁困難、RNA 檢測困難及宿主 DNA 干擾等問題。本文將對 mNGS 在肺部感染性疾病診治方面的應用情況、研究進展，以及面臨的挑戰進行綜述。
1 mNGS 技術的優勢
mNGS 即病原宏基因組學技術，它不依賴于傳統微生物培養，而是直接提取標本中的全部核酸進行高通量測序，通過對生物信息的分析，去除人源序列后，將篩選出的數據與病原數據庫進行比對，獲得疑似致病微生物的種屬信息。mNGS 具有無偏倚、廣覆蓋、高靈敏度和速度快的特點[9]。與 mNGS 檢測技術相比，微生物培養、鏡下涂片、組織病理學等傳統檢測技術有檢測時間久、陽性率低和可檢病原體種類有限等局限[10]。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術較傳統微生物檢測方法更快速、靈敏，但其必須基于已知病原體的基因序列，且假陽性或假陰性概率較高[11]。mNGS 可測出樣本中所有微生物，而不似 PCR 只有單一靶標，同時無需提前獲悉待測病原體的序列信息。mNGS 可彌補 PCR 的缺點，并能監測病毒傳播過程中可能的變異，同時對于部分病毒含量較低的樣本，mNGS 可提高檢測陽性率[12]。mNGS 也可在病原培養后做深度的二代測序，甚至全基因組分析，為預防以后同類型傳染病的暴發積累經驗。除了病原體鑒定，mNGS 還可提供額外基因組信息用于呼吸道微生物組分析、人類宿主反應分析和耐藥性預測，所有這些都更有利于對患者的臨床干預。mNGS 還具有不易受抗生素暴露影響的優勢。有研究指出，在未接觸抗生素治療的患者中，mNGS 與培養之間的靈敏度沒有顯著差異（43.3% vs. 36.7%，P=0.1）；然而，在有抗生素暴露史患者中，mNGS 的靈敏度顯著高于培養（52.7% vs. 34.4%，P<0.01）[7]。
2 mNGS 相關肺部感染診斷標本的選擇
不同類型的肺部感染性疾病，病原微生物的分布不同。mNGS 相關肺部感染標本的選擇具有多樣性，如痰液、血液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、經支氣管鏡肺活檢術（transbronchial lung biopsy，TBLB）標本、支氣管刷檢標本等均可作為檢測樣本[13]。痰標本是肺部感染患者的常規檢查項目，但是痰標本需要經呼吸道咳出，這樣會帶入大量的口腔定植菌，從而干擾檢測結果。深部痰可一定程度避免口腔定植菌污染，但僅適用于氣管插管的危重患者。BALF、TBLB 及支氣管刷檢標本等皆經支氣管鏡獲得，盡管上呼吸道定植菌對此類標本的干擾較痰標本小，但仍不能完全避免干擾。為了盡可能減少上呼吸道定植菌的干擾，在開始使用纖維支氣管鏡之前，患者應在醫護人員的指導下先用無菌生理鹽水漱口，減少口腔污染菌的數量，如有假牙應先摘掉。另外，應采用保護性支氣管肺泡灌洗技術，勿從支氣管鏡的工作腔中吸取灌洗液標本，也能有效避免上呼吸道菌群的污染；標本采集順序為支氣管灌洗液、BALF、毛刷標本和活檢標本，應避免帶血[14]。BALF 標本位于深部肺組織，人源性核酸含量低，對結果干擾最小，對深部肺部感染有較好的代表性，故其在肺部感染的標本選擇中常排在首要位置，研究也顯示 BALF 標本的 mNGS 檢測效率優于傳統培養方法[8, 15-17]。Wang 等[18]使用 mNGS 檢測了 39 例疑似感染性外周肺病變患者的 BALF、TBLB 和支氣管刷檢標本中的病原體，結果顯示對于上述 3 類標本中的細菌和真菌檢測，mNGS 比傳統培養方法更靈敏，但三者之間 mNGS 檢測靈敏度沒有顯著差異。重癥肺炎患者常并發血流感染，外周血的采集過程不受口腔定植菌的干擾，且采集方便，故盡管血液標本靈敏度不如 BALF 高，但當存在菌血癥或膿毒血癥時，血液標本更適用于 mNGS 檢測[19-20]。Chen 等[21]對 20 例重癥肺炎患者的 BALF 和血液標本進行常規微生物學檢查和 mNGS 檢測潛在的病原體，結果顯示 10 例 mNGS 陽性重癥肺炎患者中 BALF 標本和血標本同時檢出了病原體，因此對伴有血流感染的重癥肺炎患者，可以采用血液標本進行 mNGS 檢測；但由于血流感染的異質性較大，目前針對血流感染者尚缺乏大樣本 mNGS 診斷效能方面的研究。綜上，mNGS 檢測可選樣本具有多樣性，可因病而異選擇最佳檢測標本。
3 mNGS 在肺部細菌、真菌、病毒及混合感染中的應用
3.1 mNGS 在肺部細菌感染中的應用
細菌是肺部感染中常見的病原體之一。傳統的微生物學診斷方法包括痰培養、血培養等，但其檢測周期長，陽性率低，靈敏度低[7]。在細菌檢測方法的選擇上，mNGS 要優于傳統微生物培養方法。Liu 等[13]使用 mNGS 技術和傳統微生物培養方法，檢測了 2019 年 5 月－2021 年 4 月在中南大學湘雅三醫院就診的社區獲得性肺炎患者的 BALF 標本中的病原體，結果顯示 mNGS 檢出病原菌陽性率為 64%，BALF 培養僅為 28%。Xie 等[1]回顧性分析了 140 例疑似肺部感染住院患者的 mNGS 和常規檢測結果，結果顯示 mNGS 與常規診斷檢測的病原體陽性檢出率存在顯著差異（82.14% vs. 35.71%，P<0.05），mNGS 對肺部感染診斷的靈敏度高于常規檢測（89.17% vs. 50.00%，P<0.01），但特異度沒有明顯差別（75.00% vs. 81.82%，P>0.05）。Qian 等[22]對復旦大學附屬華山醫院的 100 例患者通過 mNGS 及傳統培養檢測細菌，結果顯示培養檢出病原菌 54 份，病原菌共計 70 種，mNGS 共檢出病原菌 95 份，病原菌共計 225 種；mNGS 對病原菌的檢測比傳統培養具有更高的靈敏度（95% vs. 54%，P<0.001）。目前，mNGS 技術常用于混合、罕見、難檢出的病原體，如結核分枝桿菌、新生隱球菌等，并在檢測時長方面具有明顯優勢。如 Ma 等[23]報告了 1 例 82 歲老年患者，在經過多次包括支氣管鏡檢查在內的結核相關檢查均未發現結核分枝桿菌感染的情況下，對 BALF 行 mNGS 檢測檢出了結核分枝桿菌和白色假絲酵母菌。Shi 等[24]通過對 110 例疑診肺結核患者的 BALF 標本進行 mNGS 檢測，并與常規微生物檢測（結核 X-pert 檢測、分枝桿菌培養及抗酸桿菌染色）和最終臨床診斷進行了比較，結果顯示 mNGS 對結核分枝桿菌的檢測顯示出 47.92%的靈敏度，這與結核 X-pert 檢測（45.83%）和分枝桿菌培養（46.81%）相比無明顯差異，但高于抗酸桿菌染色（29.17%）對 BALF 結核病診斷的靈敏度。然而，目前鮮有描述 mNGS 在疑似肺結核患者中應用的研究，還需更多的臨床應用來驗證其檢測效果。
3.2 mNGS 在肺部真菌感染中的應用
傳統意義上，真菌感染的實驗室診斷依賴于真菌病原體的分離，或在染色劑的幫助下對臨床標本進行直接顯微鏡檢查。真菌病原體的培養，特別是絲狀真菌，通常需要 1～2 周的孵育時間，而且鑒定時也非常具有挑戰性。常用真菌抗原如（1, 3）-β-D 葡聚糖檢測和半乳甘露聚糖檢測的靈敏度和特異度都較低[25]。mNGS 作為病原體檢測的新興技術，在真菌檢測領域逐漸嶄露頭角。比較有代表性的是 Yang 等[26]回顧性研究了 106 例疑似肺部真菌感染患者，比較了 mNGS 檢測與常規測試的診斷性能，結果顯示 mNGS 技術對 TBLB、BALF 標本在診斷肺部真菌感染方面的靈敏度顯著高于常規檢測（常規檢測 vs. TBLB-mNGS：44.4% vs. 80.0%，P<0.05；常規檢測 vs. BALF-mNGS：44.4% vs. 84.4%，P<0.05），mNGS 與常規檢測的特異度無顯著差異（常規檢測 vs. TBLB-mNGS：88.52% vs. 91.8%；常規檢測 vs. BALF-mNGS：88.52% vs. 85.3%）。Li 等[27]利用 mNGS 技術檢測出了 1 例由皮炎外瓶霉引起的罕見肺真菌病病例，及時指導臨床用藥，并最終改善了治療效果。Lu 等[28]對 4 份非 HIV 感染的肺孢子菌肺炎病例，使用 mNGS 與傳統檢測方法進行檢測結果的比較，結果顯示 mNGS 檢測出肺孢子菌的時間明顯短于傳統檢測方法。Sun 等[29]納入 198 例非 HIV 免疫抑制重癥肺炎患者，其中肺孢子菌 77 例，通過使用 mNGS 技術和常規檢測方法（血真菌 G 試驗/乳酸脫氫酶和 BALF-顯微鏡）對這些患者的 BALF 標本進行檢測，發現 mNGS 檢測出的肺孢子菌靈敏度為 97.4%，明顯高于常規方法檢測結果（血真菌 G 試驗/乳酸脫氫酶為 87.01%，BALF-顯微鏡為 46.75%），特異度居中（BALF-mNGS 為 85.12%，血真菌 G 試驗/乳酸脫氫酶為 59.50%，BALF-顯微鏡為 100%）。Xu 等[30]對 12 例腎移植患者進行 BALF 的 mNGS 檢測，結果肺孢子菌檢出陽性率達到了 54.5%。以上研究均指出了 mNGS 技術檢測肺孢子菌的優勢所在。綜上，臨床中疑似肺部真菌感染的患者，在傳統檢測方法均未取得指導性檢驗結果的情況下，建議獲取患者 TBLB 或 BALF 標本進行 mNGS 檢測，以盡早測出病原菌，指導臨床用藥。
3.3 mNGS 在肺部病毒感染中的應用
除細菌、真菌等感染外，肺部感染可由病毒引起，如偏肺病毒、鼻病毒、冠狀病毒及呼吸道合胞病毒等[12]。傳統的病毒檢測方法主要包括血清學試驗（抗原和抗體檢測）和核酸檢測等，這些常規檢測方法往往需要提前預設病原體的種類，且現有檢測方法只能覆蓋少部分病毒，而 mNGS 檢測幾乎可檢測樣本中所有的病原體，因此在病原檢測中具有明顯優勢。研究表明，嚴重急性呼吸綜合征、中東呼吸綜合征以及新型冠狀病毒肺炎這三大嚴重的呼吸系統疾病都與新型冠狀病毒密切相關[31]。除新發病原體外，有關研究也提出了 mNGS 能檢測出常規方法難以檢測到的病毒。van Boheemen 等[12]利用 mNGS 對 25 個呼吸道樣本進行了回顧性研究，結果與 PCR 相比，mNGS 的靈敏度為 83%，特異度為 94%，且檢測出了傳統微生物方法無法檢測到的病毒，如丙型流感病毒、KI 多瘤病毒、巨細胞病毒和腸道病毒等。Shi 等[32]的研究指出，mNGS 不僅能檢測出新型冠狀病毒，同時能檢測出傳統培養方法無法檢測出的呼吸道、血液和胃腸道中潛伏的人類皰疹病毒 1 型。
3.4 mNGS 在混合性肺部感染中的應用
混合性肺部感染患者體內往往存在多種病原體，其臨床癥狀較單一，肺部感染更重，且病情發展快，病死率高，故需要在短時間內準確找到病原體。與傳統檢測相比，mNGS 的病原體檢測范圍更廣。Wang 等[33]回顧性分析了納入的 55 例混合性肺部感染病例，結果顯示 mNGS 診斷混合性肺部感染的靈敏度遠高于常規檢測（97.2% vs. 13.9%，P<0.01），但特異度相反（63.2% vs. 94.7%，P=0.07)。Chen 等[34]回顧性研究了 20 例混合感染患者的檢測結果，雖然兩者均檢測出多種病原菌，但 mNGS 技術鑒定出 79 種細菌、4 種真菌和 7 種病毒，而傳統培養方法僅僅鑒定出 9 種細菌和 8 種真菌，提示 mNGS 對多重病原體感染診斷有絕對優勢。
3.5 mNGS 診斷的特異度問題
綜上，mNGS 檢測病原體的靈敏度均遠高于傳統檢測方法，正是基于 mNGS 檢測技術的無偏性和高度靈敏的特點，mNGS 可能會導致報告出現假陽性結果，未能正確解釋檢測報告可能會導致錯誤的疾病診斷，故其特異度較傳統檢測方法并不突出，甚至更低。要改進 mNGS 檢測技術特異度的問題，首先，應該盡量減少環境污染菌、呼吸道定植菌和人類宿主 DNA 的干擾；其次，假陽性結果的出現可能是因為數據庫中根據種水平的不同，參考基因組可能由數十至數千臨床株系融合而成，同屬或同種不同株系微生物在致病力、流行病學方面可能存在較大差異，而 mNGS 技術檢測出的病原體可能種水平相同，而株系不同，這就需要重點關注和報告種水平的特異性序列，提高分辨率和特異度。
4 mNGS 技術面臨的挑戰與突破
4.1 污染菌的干擾
mNGS 技術面臨污染菌的干擾，這是目前所面臨的重要挑戰之一。環境菌的污染包括來源于采集標本時的醫院環境污染，運輸過程中的樣本污染，甚至是實驗室的試劑污染和試劑盒污染等。對于避免環境中、試劑中、容器中的病原菌污染，嚴格遵守檢測流程的質量控制程序非常重要。我國已有專家共識對 mNGS 技術進行了樣本采集、測序和結果解讀的規范[35-38]。為了避免環境菌污染，首先在采集標本時要做到無菌操作，并明確具體的工作流程和人員配備方式；其次，在運輸過程中一定要避免樣本暴露導致的樣本污染；再者，對于 mNGS 實驗室操作而言，工作人員應花大量時間進行分子生物學技術培訓以熟悉實驗操作，因為最關鍵的往往是重復性工作，如移液器的規范操作，避免反應試劑錯加、漏加或工作流程中關鍵步驟的遺漏等。
4.2 臨床解讀
與環境污染菌相比，人體定植菌的消除才是更為嚴峻的挑戰。Langelier 等[39]對 20 例下呼吸道感染患者開發了 logistic 回歸模型和基于規則的模型來區分可能的病原體和氣道微生物，結果顯示，所有臨床證實的下呼吸道病原體平均占所有樣本讀數的 99%。準確識別病原體并提供用藥指南是微生物檢測的最終目標，除參考病原體檢測結果外，還需結合患者臨床表現、免疫狀態和基礎疾病進行綜合評估，以檢出真正的病原體。
4.3 RNA 檢測困難
核酸質量是 mNGS 檢測成功的關鍵因素，人體 RNA 豐度高且復雜，RNA 不如 DNA 穩定，可以被存在于皮膚、血液和組織中的內源性核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）以及外源性 RNase 降解。為了盡可能保持 RNA 完整性，最大程度地避免外源性 RNase 污染和抑制內源性 RNase 的活力，首先應創造無外源性 RNase 的操作環境，目前已有專家共識提出 mNGS 送檢標準[37]。外源性 RNase 主要來源于與材料接觸的實驗器材和操作人員的呼吸、手接觸，因此在試驗操作之前必須將實驗器材進行高溫滅菌處理，操作者必須戴帽子、口罩、手套。內源性 RNase 來源于紅細胞裂解釋放的 RNase 和白細胞中的 RNase，在培養細胞中加入裂解液可使細胞裂解，同時裂解液中的有效成分可以抑制胞內 RNase，進而使 RNA 保持完整。除避免 RNase 的干擾以保持 RNA 完整性外，優化 RNA 流程的核酸提取、建庫等方法以提高 RNA 檢出效率也同樣重要。Deng 等[40]提出的帶有加標引物富集的宏基因組測序方法是一種新型 RNA 富集策略，其流程簡單，成本較低，保留了 mNGS 的檢測廣度，同時提高了 RNA 檢測效率，使得 RNA 檢測向前跨進了一大步，但該研究成果還未廣泛應用于臨床，還需更多的實驗數據予以支撐。He 等[41]對 151 例肺炎患者的痰標本與 BALF 標本使用 TruePrep DNA Library PrepKit V2 for Illumina 進行文庫制備，與另外 2 種商業 RNA 文庫制備試劑盒（NEB UltraⅡ和 Vazyme TR503）比較，結果表明，使用 TruePrep 技術制備出的文庫，能使 mNGS 檢測出更多的病原菌，使得 RNA 病毒檢測能力有所提高。目前常用的 RNA 測序技術多種多樣，但大多數測序技術過程復雜，成本昂貴，且對 RNA 總量和濃度的要求高，在對微量 RNA 病原體檢測時常顯不足。陸泓雨等[42]建立了一套簡便的、對 RNA 樣本起始量要求很低的微量 RNA 建庫技術，提高了微量 RNA 檢出量，盡管該技術未用于微量 RNA 樣品的 mNGS 測序，但這對 mNGS 測序技術的發展起到了推動作用。
4.4 厚壁菌破壁困難
胞內寄生菌、真菌（具有復雜的細胞結構且細胞壁外還有一層厚厚的莢膜）、結核分枝桿菌（細胞壁外有分枝菌酸）、布魯菌、諾卡菌等常見病原體破壁困難，核酸序列豐度低，檢出困難，需要提高破壁技術，來提升陽性率。相關研究表明，采用珠子攪拌破壞細胞壁的方案，可以提高馬拉色菌科 27 屬的 DNA 產量[43]。Angebault 等[44]對法國 Mondor 醫院的 6 個痰液標本進行細菌和真菌培養，后將培養過的痰標本移入 PowerLyzer 0.1 mm 玻璃珠管中進行細胞壁的機械裂解，隨后使用自動 QIAsymphony 提取和手動 PowerSoil MoBio 提取 2 種方法提取標本中的病原體 DNA，再使用 V1-V2 和 V4-V3 16S 靶向擴增子測序檢測細菌多樣性和群落結構，最終檢測到鏈球菌等革蘭陽性菌。Vesty 等[45]比較了真菌和細菌口腔 16S/ITS 靶向擴增子測序的 4 種提取方案，指出包含酶裂解步驟的方案能增強唾液中 DNA 的提取效率。Huseyin 等[46]比較了 5 種提取腸道菌群病原體 DNA 的方案，提出只有包含珠擊步驟的方法才能提取足夠數量的病原體 DNA，盡管該研究的致病病原體與肺部感染無關，但使用的破壁技術對肺部感染厚壁菌的 mNGS 檢測具有指導意義。隨著生物學的發展，難破壁病原體的 mNGS 檢測技術有很大突破，但在肺部感染性疾病中，除有細胞結構的病原體外，還存在病毒、寄生蟲等病原體感染。Deng 等[40]開發的帶有加標引物富集的宏基因組測序技術以平均 10 倍的富集度擴增了指定的病毒基因組，提高了特定病毒病原體的檢測靈敏度。此外，除了提高破壁技術和使用加標引物富集的宏基因組測序方法外，在這些低豐度核酸序列病原體的診斷過程中需要結合宿主因素、流行病學史、影像學特征、病理學特征、實驗室檢查結果及抗生素治療反應，進行綜合評估以檢出精確的病原體。
4.5 人類宿主 DNA 的干擾及其他
肺部感染患者的呼吸道樣本中含有大量的人類宿主 DNA，95%的原始 mNGS 讀數來自鼻咽抽吸物樣本中的人類 DNA，這使得 mNGS 檢測病原體標本的靈敏度降低[47]。現有的增加微生物核酸提取率的方法包括反向富集方法（過濾法、超速離心法、差異裂解法、去甲基化磁珠等）和正向富集方法（多重 PCR 和探針捕獲）。在反向富集方法中，過濾法和超速離心法屬于物理分離技術，其基于宿主細胞與微生物大小差異或其他物理差異對宿主細胞進行清除，這種方法簡單易操作，但僅可用于去除完整性較好的人源細胞；差異裂解法則利用人源細胞與微生物細胞結構差異，選擇性地裂解宿主細胞，利用核酸酶酶解掉釋放出來的宿主 DNA，最后進行病原體 DNA 的富集純化[48-49]；在正向富集方法中，多重 PCR 操作簡單，周期短，適用于目標明確、區域不大的應用；而捕獲探針試驗操作復雜，周期長，適合大范圍地尋找可能的致病源，如罕見病原體的檢測[50]。相較前幾種核酸提取方法，Charalampous 等[51]提出的一種優化的基于皂苷的宿主 DNA 去除方法即納米孔測序技術，其去除宿主 DNA 的能力更強，該方法可去除呼吸道樣本中 99.99%的人類 DNA。但由于使用額外的試劑，外源性背景污染的風險也隨之升高。此外，檢測周期較長、價格昂貴也限制了 mNGS 成為常規檢測項目，如何加速病原體檢出時間及降低成本費用，也是推進臨床應用和研究的關鍵。
5 小結與展望
總之，本文通過閱讀國內外大量文獻，對 mNGS 的應用進展及面臨的挑戰進行了綜述。mNGS 是一種具有顯著優勢的病原體新興檢測手段，其在肺部感染的病原體診斷中突破了傳統培養方法的局限，擴展了人們對病原體的認識。然而，mNGS 技術在肺部感染診斷中的應用并未普及，如何規范發展 mNGS 技術，使其成為高靈敏度、快速、廣譜、無創性且親民的病原微生物檢測技術是我們的前進目標。相信隨著相關研究的繼續深入，mNGS 將有望成為肺部感染甚至其他感染性疾病診斷的有力工具之一。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。