引用本文： 汪云鳳, 閆九明, 周正明, 郭鑒葵, 魏瑤瑤, 景小凡, 廖欣怡, 胡雯. 玉米低聚肽改善地塞米松誘導的肌肉萎縮效果研究. 華西醫學, 2023, 38(3): 429-437. doi: 10.7507/1002-0179.202205119 復制
肌肉萎縮或肌少癥是指進行性骨骼肌量減少、伴有肌肉力量和（或）功能減退的綜合征[1]。在亞洲，肌少癥發生率為 7.3%～12.0%，60～70 歲老年人發病率為 5%～13%，80 歲以上人群為 11%～50%[1-2]。該病病因中最主要的因素是年齡，其次為運動神經元損傷、活動量下降、長期臥床、惡病質、營養不足/吸收障礙等[3]，其中，營養素缺乏導致骨骼肌蛋白合成降低是肌肉萎縮發生和進展的重要原因。營養干預可顯著改善骨骼肌質量、肌肉力量及功能，已有較多研究顯示補充蛋白質及其水解產物可改善肌肉萎縮，并將補充蛋白質列入診療推薦意見中[4-5]。研究發現，蛋白質在人體內主要是以低聚肽的形式吸收，因此越來越多肌少癥干預研究聚焦于各類動植物源性肽[6-7]。給予 65 歲以上男性肌少癥患者 15 g/d 的膠原蛋白肽干預 12 周后，患者去脂體重和握力均得到顯著改善[8]。玉米低聚肽（corn oligopeptide, COP）是以玉米蛋白粉為原料，經蛋白酶酶解制得的相對分子質量小于 1000、主要成分為短肽（2～6 個氨基酸）的混合物[9]。COP 可有效調節人體脂質代謝，同時可抑制血管緊張素轉換酶活性發揮降血壓的作用，并通過抑制生物大分子過氧化或清除體內自由基產物起到機體抗氧化活性作用[9-13]。然而，關于其干預肌肉萎縮作用的研究尚未見報道，因此本研究旨在評價 COP 改善地塞米松誘導的大鼠肌肉萎縮效果，探索 COP 新的生物活性功能，并為肌肉萎縮精準臨床干預提供新的營養底物。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗樣品與動物
實驗樣品：COP，淡黃色粉末，無味，購自浙江海氏生物科技有限公司（批號：J30020A）。
實驗動物：49 只 8 周齡（體重 250～280 g）無特定病原體（specific pathogen free, SPF）級雄性 Sprague-Dawley 大鼠，購自北京維通利華公司［生產許可證：SCXK（京）2021-0006］，飼養于四川大學華西公共衛生學院 SPF 級動物房［使用許可證：SYXK（川）2018-011］。動物房內保持安靜、清潔、通風和適宜光照狀態，溫度（23±2）℃，濕度 40%～70%，明暗交替周期 12 h，同時保證動物自由飲水和充分進食，飲水和飼料均經無菌處理，飼養期間 5 只/籠。本課題經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會審查通過，動物倫理備案號：20211548A。
1.1.2 實驗試劑與儀器
主要試劑：地塞米松（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；無菌生理鹽水（四川科倫藥業股份有限公司）；RNA 樣本保存液（北京天根生化科技有限公司）；環保型 GD 固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；動物組織中 RNA 提取試劑盒（成都福際生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒［伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］；實時熒光定量試劑盒［伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］；蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin, HE）染液套裝（武漢賽維爾生物科技有限公司）。
主要儀器：實時熒光定量聚合酶鏈反應儀［伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］；核酸定量測定儀（美國賽默飛世爾科技公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；光學顯微鏡（日本 Olympus 株式會社）；YLS-13A 大鼠抓力測定儀（濟南益延科技發展有限公司）；Waters 2D UPLC 超高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；Q Exactive 高分辨質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美國 Waters 公司）等。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組及處理情況
動物模型構建：適應性喂養 5 d 后，采用隨機數字表將 49 只大鼠分為空白組（10 只）和模型組（39 只）。模型組腹腔注射地塞米松（1.0 mg/kg，0.2 mL/100 g），空白組注射生理鹽水，期間每周稱量體重 2 次。19 d 后，空白組、模型組分別隨機取 1 只和 3 只大鼠觀察模型是否構建成功。
干預階段：造模成功后，采用隨機數字表將模型組隨機分為 4 組，即模型對照組、COP 低劑量組（COP-L 組，0.5 g/kg）、COP 中劑量組（COP-M 組，1.0 g/kg）、COP 高劑量組（COP-H 組，2.0 g/kg），9 只/組。空白組、模型對照組每日灌胃純水，COP 低、中、高劑量組每日灌胃相應劑量的 COP，灌胃容積 1 mL/100 g，干預 33 d，期間每 3 天稱量 1 次體重。干預結束后測大鼠抓力。隨后用 2% 戊巴比妥鈉（0.25 mL/100 g，腹腔注射）麻醉處死。
1.2.2 大鼠抓力測試
大鼠適應環境 10 min 后開始抓力測試，使大鼠前肢抓住抓力儀的金屬拉桿，抓住大鼠尾巴，向后逐漸均勻用力拉，直到大鼠釋放金屬拉桿，釋放時的值被記錄為最大張力。每只大鼠測試 3 次，每次間隔 30 s，取 3 次測試的平均值作為每只大鼠的抓力。
1.2.3 肌肉重量及系數
動物處死后快速剝離腓腸肌、比目魚肌、脛骨前肌和跖肌稱重，并計算肌肉系數（肌肉系數=肌肉濕重/空腹體重×100%）。
1.2.4 肌肉組織病理學
腓腸肌、比目魚肌、脛骨前肌和跖肌經環保型 GD 固定液固定 24 h 后，經脫水、透明、包埋、切片和脫蠟后，進行 HE 染色觀察，并采集圖像分析。
1.2.5 逆轉錄-定量聚合酶鏈反應
取腓腸肌、比目魚肌、脛骨前肌和跖肌樣品，提取肌肉組織總 RNA，反轉錄為互補 DNA。根據逆轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒說明書依次加入互補 DNA 模板以及各反應試劑。擴增條件為：98℃酶活化 2 min，98℃變性 5 s，60℃退火/延伸 5 s，共 40 個循環，得出各目的基因及內參的平均閾值循環數（threshold cycle, Ct），采用 2-△△Ct 計算相對表達量。每一個指標重復測量 2 次，取平均值。內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及肌環指蛋白-1（muscle ring finger protein-1，MuRF-1）、肌萎縮 F 盒蛋白（muscle atrophy F-box protein，Atrogin-1）的 mRNA 引物序列見表1。
表1
MuRF-1 和 Atrogin-1 mRNA 引物序列及大小
1.2.6 腓腸肌代謝組學
腓腸肌中加入提取液（V 甲醇∶V 乙腈∶V 水=2∶2∶1），研磨、水浴超聲后離心取上清液抽干，隨后加入復溶液（V 甲醇∶V 水=1∶9）復溶。復溶的樣品取上清液置于上樣瓶中。本實驗采用 Waters 2D UPLC 串聯 Q Exactive 高分辨質譜儀，在正離子模式和負離子模式下對代謝物進行分離和檢測。色譜流動相：正離子模式流動相為含 0.1% 甲酸的水溶液（A 液）和含 0.1% 甲酸的 100% 甲醇（B 液），負離子模式流動相為含 10 mmol/L 甲酸氨的水溶液（A 液）和含 10 mmol/L 甲酸氨的 95% 甲醇（B 液）。利用 Q Exactive 質譜儀進行一級、二級質譜數據采集，質譜掃描質核比范圍為 70～1050。一級質譜數據采集后，按照母離子強度，選取一級譜圖峰強度前 3 的母離子進行碎裂，采集二級譜圖。
液相色譜-質譜數據處理：使用 Compound Discoverer 3.1 軟件進行數據分析及代謝物鑒定，并導出鑒定結果。代謝物的鑒定結合高分辨串聯質譜云數據庫（mzCloud）、在線化學數據庫（ChemSpider）、人類代謝組學數據庫（The Human Metabolome Database）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和 LipidMaps 數據庫。最后將結果導入 metaX 軟件進行歸一化、校正等處理。
1.3 統計學方法
所有數據納入 SPSS 26.0 軟件進行統計分析。對造模和干預階段體重隨時間變化數據進行重復測量方差分析，其中干預階段采用 Dunnett-t 檢驗進行事后檢驗（以模型對照組作為對照組，空白組和 3 個 COP 劑量組與其比較）；干預階段，抓力、肌肉系數（腓腸肌、比目魚肌和跖肌）、肌纖維直徑（脛骨前肌和跖肌）以及比目魚肌 Atrogin-1 mRNA 相對表達量數據均符合正態分布及方差齊性，采用均數±標準差表示，并采用單因素方差分析比較組間差異，當 P<0.05 時，進一步采用 Dunnett-t 檢驗進行事后檢驗；比目魚肌 MuRF-1 mRNA 相對表達量數據不服從正態分布，采用中位數（最小值，最大值）表示，使用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗分析組間差異，當 P<0.05 時，進一步采用“全部成對多重比較”進行事后檢驗。
非靶向代謝組學數據采用多元統計偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）和單變量 t 檢驗相結合的方式篩選組間差異代謝物。運用 PLS-DA 建立代謝物表達量與樣品類別之間的關系模型，對樣品類別進行預測，結合差異倍數和 P 值，確定各組間的差異代謝物。差異代謝物篩選條件：① 差異倍數≥1.20 或≤0.83；② P<0.05。P<0.05 的代謝通路為差異代謝物顯著富集的代謝通路。
2 結果
2.1 地塞米松對大鼠體重和肌纖維形態的影響
采用重復測量方差分析對空白組和模型組 6 個不同時間點體重進行分析。多變量檢驗部分的統計結果顯示：時間有統計學意義（F=197.458，P<0.01），時間和分組的交互作用有統計學意義（F=142.762，P<0.01），表明兩組隨時間的變化不一致；進一步采用簡單效應分析兩組在不同時間點的體重差異，結果顯示腹腔注射地塞米松第 7 天至造模結束，模型組大鼠體重均小于空白組（P<0.05），見圖1a。
圖1
地塞米松對大鼠體重和肌纖維形態的影響
a. 造模階段大鼠體重變化，*與空白組比較，
造模結束，與空白組相比，鏡下可見模型組腓腸肌、比目魚肌肌纖維之間間隙增大，肌纖維直徑減小，部分區域肌原纖維分裂，肌纖維萎縮，見圖1b，提示造模成功。
2.2 COP 對大鼠體重變化的影響
整個干預期間，各組大鼠體重均呈現增加趨勢。多變量檢驗部分的統計結果顯示：時間有統計學意義（F=64.992，P<0.01），時間和分組的交互作用無統計學意義（F=1.490，P>0.05）；主體間效應檢驗結果顯示分組因素對體重存在影響（F=7.823，P<0.01），Dunnett-t 事后檢驗結果顯示模型對照組大鼠體重小于空白組（P<0.01），與模型對照組大鼠相比，COP-L 組、COP-M 組、COP-H 組體重差異無統計學意義（P>0.05），見圖2。
圖2
COP 對大鼠體重增長趨勢的影響
*模型對照組與空白組比較，
2.3 COP 對大鼠肌肉相關指標的影響
COP 干預 33 d 后，大鼠肌肉相關指標中存在組間差異的指標見表2。
表2
COP 干預 33 d 后各組大鼠肌肉相關指標比較（n=9）
2.3.1 抓力
與空白組大鼠相比，模型對照組大鼠抓力略降低，但差異無統計學意義（P>0.05）。與模型對照組大鼠相比，COP-L 組、COP-M 組大鼠抓力提高，差異有統計學意義（P<0.01）。
2.3.2 肌肉系數
與空白組大鼠相比，模型對照組大鼠腓腸肌、比目魚肌、跖肌的肌肉系數均一定程度減小，但差異無統計學意義（P>0.05）。與模型對照組大鼠相比，COP-L 組大鼠腓腸肌、比目魚肌、跖肌的肌肉系數均增大（P<0.05），COP-M 組大鼠跖肌的肌肉系數增大（P<0.05），COP-H 組大鼠腓腸肌、比目魚肌的肌肉系數增大（P<0.05）。各組脛骨前肌肌肉系數差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.3 肌纖維直徑
與空白組大鼠相比，模型對照組大鼠脛骨前肌肌纖維直徑顯著減小，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型對照組相比，COP-L 組大鼠脛骨前肌肌纖維直徑增大（P<0.05），COP-M 組和 COP-H 組大鼠脛骨前肌和跖肌肌纖維直徑增大（P<0.05）。各組腓腸肌、比目魚肌肌纖維直徑差異無統計學意義（P>0.05）。
此外，HE 染色后鏡下可見空白組大鼠 3 種肌肉肌纖維結構完整，肌纖維細胞排列整齊且緊密。模型對照組大鼠腓腸肌、脛骨前肌肌纖維變細，肌纖維之間的間隙增大，肌纖維細胞排列不整齊，結構不完整。而 COP 干預后大鼠肌纖維結構明顯恢復，肌纖維細胞排列緊密，肌纖維之間的間隙明顯縮小。見圖3。
圖3
干預結束后大鼠腓腸肌、脛骨前肌、跖肌病理檢查圖像（HE ×200）
黑箭示與模型對照組比較，COP 組肌纖維結構恢復，肌纖維細胞排列緊密，肌纖維之間的間隙明顯縮小
2.3.4 Atrogin-1 和 MuRF-1 mRNA 相對表達量
與空白組大鼠相比，模型對照組比目魚肌中 Atrogin-1 mRNA 相對表達量顯著增加（P<0.05）；與模型對照組大鼠相比，COP 3 個劑量組比目魚肌中 Atrogin-1 mRNA 相對表達量均下降（P<0.05），COP-L 組、COP-H 組比目魚肌中 MuRF-1 mRNA 相對表達量下降（P<0.05）。各組腓腸肌、脛骨前肌、跖肌中 Atrogin-1 和 MuRF-1 mRNA 相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.4 COP 對肌肉代謝的影響
2.4.1 差異代謝物篩選
本研究根據代謝物的二級質譜碎片信息對化合物進行定性后，共鑒定到 290 種代謝物，其中正離子模式下 191 個，負離子模式下 99 個。根據代謝物的檢測結果與鑒定結果在數據庫中的匹配情況，將鑒定結果劃分為不同的可信度等級，等級 1～5 的可信度依次下降。篩選等級為 1、2、3 的差異代謝物，綜合正負離子模式整合為柱狀圖進行直觀比較（圖4）。相較于模型對照組，COP-L 組共有 10 種化合物顯著升高，包括 D-葡萄糖 6-磷酸鹽、B-d-果糖 6-磷酸、精氨酸、檸檬酸鹽等，其中 D-葡萄糖 6-磷酸鹽、B-d-果糖 6-磷酸為磷酸戊糖途徑的上游代謝物。COP-M 組共有 27 種化合物顯著升高，包括色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等必需氨基酸；8 種代謝物顯著下降，如膽酸、肉蔻豆酸等。COP-H 組共有 2 種化合物顯著升高，分別是 N-乙酰基-1 天冬氨酸谷氨酸和 L-3 苯基乳酸；4 種代謝物顯著降低，包括膽酸和 4-羧基苯甘氨酸等。
圖4
差異代謝物表達倍數分析
a. COP-L 組
2.4.2 差異代謝物的代謝通路富集分析
圖5 氣泡圖顯示綜合正負離子模式篩選到的差異代謝物，COP 3 個劑量組與模型對照組相比，顯著富集的通路分別有 28、21、7 條。其中 COP-L 組顯示富集的代謝物較多且差異性較高的包括 6 條與氨基酸合成代謝相關的代謝通路、3 條與酸類代謝相關通路和 3 條與糖代謝相關通路：芳香族氨基酸的生物合成，三羧酸循環，賴氨酸生物合成，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代謝，丙酮酸代謝，牛磺酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，磷酸戊糖途徑，糖酵解與糖代謝合成。COP-M 組富集的通路包括精氨酸和脯氨酸代謝、芳香族氨基酸的生物合成、氨酰基-tRNA 生物合等成。COP-H 組差異代謝物富集的通路雖較少，但也涉及 β-丙氨酸代謝、泛酸和輔酶 A 的生物合成等與氨基酸代謝和能量代謝相關的通路。此外，嘌呤代謝通路在 COP 3 個劑量組均呈現較高的差異性且富集到的代謝物較多，但該通路的主要代謝產物尿酸在 3 組中未呈現明顯上調或下調。COP-L 組、COP-M 組顯示芳香族氨基酸的生物合成通路富集到的代謝產物較多。
圖5
代謝通路富集分析氣泡圖
a. COP-L 組
3 討論
肌肉萎縮的臨床癥狀表現為肌肉力量的減弱，肌纖維變細甚至消失，肌肉體積縮小[1]。大量研究表明，低聚肽、氨基酸以及其代謝物可改善肌肉萎縮[14-17]。在本研究中，連續給予大鼠 33 d COP 后，由地塞米松誘導的腓腸肌、脛骨前肌、跖肌肌纖維萎縮得到明顯改善，抓力也明顯提高，這與 Yamamoto 等[18]連續喂養支鏈氨基酸 5 d 后可改善由地塞米松誘導的大鼠比目魚肌肌纖維直徑減小相似。但與模型對照組相比，3 個劑量組大鼠體重均未出現差異，這可能與干預時間相對較短，尚未引起體重明顯改變有關。
泛素-蛋白酶體途徑在骨骼肌蛋白分解中起重要作用，E3 泛素連接酶 MuRF-1 和 Atrogin-1 mRNA 相對表達量是判斷蛋白降解的關鍵指標[19-20]。動物和細胞實驗發現，在肌肉分解過程中 MuRF-1 和 Atrogin-1 表達增加[20-21]。本研究結果顯示，地塞米松導致大鼠比目魚肌中 Atrogin-1 和 MuRF-1 的 mRNA 表達量增加，而 COP 可減小兩者的表達，這可能與 COP 中含有較高比例支鏈氨基酸密切相關。研究表明，支鏈氨基酸中的亮氨酸可抑制肌肉萎縮時 MuRF-1 和 Atrogin-1 表達量上調，調控泛素-蛋白酶體途徑，抑制骨骼肌蛋白的降解[19-23]。因此，我們猜測 COP 改善肌肉萎縮的機制可能與支鏈氨基酸類似。
這也與我們對差異代謝物及其富集的代謝通路分析發現相一致，給予 COP 干預后，亮氨酸、甘氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸等代謝產物增加，氨基酸代謝通路如三羧酸循環、芳香族氨基酸代謝通路等被激活。現有研究表明，氨基酸水平的改變可以無差別地刺激肌肉蛋白的合成[24]。谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等與骨骼肌質量指數、握力相關[25]。氨基酸、肉堿和脂肪酸氧化標志物與體質量指數、脂肪百分比和四肢骨骼肌肉量相關性較強[26]。由此可見，COP 可能通過三羧酸循環、芳香族氨基酸合成等通路，生成亮氨酸、纈氨酸以及苯丙氨酸等，可為肌肉蛋白合成提供底物，改善地塞米松誘導的肌肉萎縮。
酸性化合物在體內積累，可破壞體內的酸堿平衡，肌肉在酸性環境中降解的幅度增大，我們發現 COP 可激活與酸類物質代謝相關的通路，與之對應的泛酸、膽酸等酸性物質明顯下調，根據楊蕾[27]對中老年人肌少癥血液代謝組學結果，即肌少癥血液中酸性物質明顯增加，我們猜測 COP 可通過激活酸降解通路，減少酸性物質在體內的蓄積，改善骨骼肌蛋白所處酸性環境。此外，研究表明，萎縮中的骨骼肌糖酵解代謝明顯減少，引起下游產物減少以及上游代謝物積累[28]，本研究中，與模型對照組相比，COP-L 組 3 條糖代謝通路雖被激活，但磷酸戊糖途徑中的上游代謝物 D-葡萄糖 6-磷酸鹽和 B-d-果糖 6-磷酸上調，而 COP-H 組未發現兩者的累積且與能量代謝相關的泛酸和輔酶 A 的生物合成途徑被激活，我們猜測 COP-L 逆轉糖酵解的強度較低，COP-H 可進一步增強肌肉糖酵解與能量供應。綜上，本研究表明 COP 可為骨骼肌蛋白合成提供底物，改善由地塞米松誘導的大鼠肌纖維萎縮，機制可能與通過減小泛素-蛋白酶體途徑中 E3 泛素連接酶的表達和增加肌肉中重要氨基酸的生物合成有關。
目前，臨床上干預肌肉萎縮的營養措施多為動物蛋白（如牛肉和乳清蛋白）和優質植物蛋白（大豆分離蛋白），雖已納入專家診療意見，但相比于低聚肽、氨基酸等，分子量較大，進入消化道后不可直接吸收，轉運速度慢，耗能高，消化率和利用率受機體因素影響大。所以開發以低聚肽、氨基酸等為營養底物的復配營養制劑至關重要，可一定程度上彌補動植物蛋白的缺點，本研究發現的 COP 改善肌肉萎縮作用，可為肌肉萎縮精準臨床干預提供新的營養底物。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
肌肉萎縮或肌少癥是指進行性骨骼肌量減少、伴有肌肉力量和（或）功能減退的綜合征[1]。在亞洲，肌少癥發生率為 7.3%～12.0%，60～70 歲老年人發病率為 5%～13%，80 歲以上人群為 11%～50%[1-2]。該病病因中最主要的因素是年齡，其次為運動神經元損傷、活動量下降、長期臥床、惡病質、營養不足/吸收障礙等[3]，其中，營養素缺乏導致骨骼肌蛋白合成降低是肌肉萎縮發生和進展的重要原因。營養干預可顯著改善骨骼肌質量、肌肉力量及功能，已有較多研究顯示補充蛋白質及其水解產物可改善肌肉萎縮，并將補充蛋白質列入診療推薦意見中[4-5]。研究發現，蛋白質在人體內主要是以低聚肽的形式吸收，因此越來越多肌少癥干預研究聚焦于各類動植物源性肽[6-7]。給予 65 歲以上男性肌少癥患者 15 g/d 的膠原蛋白肽干預 12 周后，患者去脂體重和握力均得到顯著改善[8]。玉米低聚肽（corn oligopeptide, COP）是以玉米蛋白粉為原料，經蛋白酶酶解制得的相對分子質量小于 1000、主要成分為短肽（2～6 個氨基酸）的混合物[9]。COP 可有效調節人體脂質代謝，同時可抑制血管緊張素轉換酶活性發揮降血壓的作用，并通過抑制生物大分子過氧化或清除體內自由基產物起到機體抗氧化活性作用[9-13]。然而，關于其干預肌肉萎縮作用的研究尚未見報道，因此本研究旨在評價 COP 改善地塞米松誘導的大鼠肌肉萎縮效果，探索 COP 新的生物活性功能，并為肌肉萎縮精準臨床干預提供新的營養底物。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗樣品與動物
實驗樣品：COP，淡黃色粉末，無味，購自浙江海氏生物科技有限公司（批號：J30020A）。
實驗動物：49 只 8 周齡（體重 250～280 g）無特定病原體（specific pathogen free, SPF）級雄性 Sprague-Dawley 大鼠，購自北京維通利華公司［生產許可證：SCXK（京）2021-0006］，飼養于四川大學華西公共衛生學院 SPF 級動物房［使用許可證：SYXK（川）2018-011］。動物房內保持安靜、清潔、通風和適宜光照狀態，溫度（23±2）℃，濕度 40%～70%，明暗交替周期 12 h，同時保證動物自由飲水和充分進食，飲水和飼料均經無菌處理，飼養期間 5 只/籠。本課題經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會審查通過，動物倫理備案號：20211548A。
1.1.2 實驗試劑與儀器
主要試劑：地塞米松（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；無菌生理鹽水（四川科倫藥業股份有限公司）；RNA 樣本保存液（北京天根生化科技有限公司）；環保型 GD 固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；動物組織中 RNA 提取試劑盒（成都福際生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒［伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］；實時熒光定量試劑盒［伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］；蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin, HE）染液套裝（武漢賽維爾生物科技有限公司）。
主要儀器：實時熒光定量聚合酶鏈反應儀［伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］；核酸定量測定儀（美國賽默飛世爾科技公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；光學顯微鏡（日本 Olympus 株式會社）；YLS-13A 大鼠抓力測定儀（濟南益延科技發展有限公司）；Waters 2D UPLC 超高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；Q Exactive 高分辨質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美國 Waters 公司）等。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組及處理情況
動物模型構建：適應性喂養 5 d 后，采用隨機數字表將 49 只大鼠分為空白組（10 只）和模型組（39 只）。模型組腹腔注射地塞米松（1.0 mg/kg，0.2 mL/100 g），空白組注射生理鹽水，期間每周稱量體重 2 次。19 d 后，空白組、模型組分別隨機取 1 只和 3 只大鼠觀察模型是否構建成功。
干預階段：造模成功后，采用隨機數字表將模型組隨機分為 4 組，即模型對照組、COP 低劑量組（COP-L 組，0.5 g/kg）、COP 中劑量組（COP-M 組，1.0 g/kg）、COP 高劑量組（COP-H 組，2.0 g/kg），9 只/組。空白組、模型對照組每日灌胃純水，COP 低、中、高劑量組每日灌胃相應劑量的 COP，灌胃容積 1 mL/100 g，干預 33 d，期間每 3 天稱量 1 次體重。干預結束后測大鼠抓力。隨后用 2% 戊巴比妥鈉（0.25 mL/100 g，腹腔注射）麻醉處死。
1.2.2 大鼠抓力測試
大鼠適應環境 10 min 后開始抓力測試，使大鼠前肢抓住抓力儀的金屬拉桿，抓住大鼠尾巴，向后逐漸均勻用力拉，直到大鼠釋放金屬拉桿，釋放時的值被記錄為最大張力。每只大鼠測試 3 次，每次間隔 30 s，取 3 次測試的平均值作為每只大鼠的抓力。
1.2.3 肌肉重量及系數
動物處死后快速剝離腓腸肌、比目魚肌、脛骨前肌和跖肌稱重，并計算肌肉系數（肌肉系數=肌肉濕重/空腹體重×100%）。
1.2.4 肌肉組織病理學
腓腸肌、比目魚肌、脛骨前肌和跖肌經環保型 GD 固定液固定 24 h 后，經脫水、透明、包埋、切片和脫蠟后，進行 HE 染色觀察，并采集圖像分析。
1.2.5 逆轉錄-定量聚合酶鏈反應
取腓腸肌、比目魚肌、脛骨前肌和跖肌樣品，提取肌肉組織總 RNA，反轉錄為互補 DNA。根據逆轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒說明書依次加入互補 DNA 模板以及各反應試劑。擴增條件為：98℃酶活化 2 min，98℃變性 5 s，60℃退火/延伸 5 s，共 40 個循環，得出各目的基因及內參的平均閾值循環數（threshold cycle, Ct），采用 2-△△Ct 計算相對表達量。每一個指標重復測量 2 次，取平均值。內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及肌環指蛋白-1（muscle ring finger protein-1，MuRF-1）、肌萎縮 F 盒蛋白（muscle atrophy F-box protein，Atrogin-1）的 mRNA 引物序列見表1。
表1
MuRF-1 和 Atrogin-1 mRNA 引物序列及大小
1.2.6 腓腸肌代謝組學
腓腸肌中加入提取液（V 甲醇∶V 乙腈∶V 水=2∶2∶1），研磨、水浴超聲后離心取上清液抽干，隨后加入復溶液（V 甲醇∶V 水=1∶9）復溶。復溶的樣品取上清液置于上樣瓶中。本實驗采用 Waters 2D UPLC 串聯 Q Exactive 高分辨質譜儀，在正離子模式和負離子模式下對代謝物進行分離和檢測。色譜流動相：正離子模式流動相為含 0.1% 甲酸的水溶液（A 液）和含 0.1% 甲酸的 100% 甲醇（B 液），負離子模式流動相為含 10 mmol/L 甲酸氨的水溶液（A 液）和含 10 mmol/L 甲酸氨的 95% 甲醇（B 液）。利用 Q Exactive 質譜儀進行一級、二級質譜數據采集，質譜掃描質核比范圍為 70～1050。一級質譜數據采集后，按照母離子強度，選取一級譜圖峰強度前 3 的母離子進行碎裂，采集二級譜圖。
液相色譜-質譜數據處理：使用 Compound Discoverer 3.1 軟件進行數據分析及代謝物鑒定，并導出鑒定結果。代謝物的鑒定結合高分辨串聯質譜云數據庫（mzCloud）、在線化學數據庫（ChemSpider）、人類代謝組學數據庫（The Human Metabolome Database）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和 LipidMaps 數據庫。最后將結果導入 metaX 軟件進行歸一化、校正等處理。
1.3 統計學方法
所有數據納入 SPSS 26.0 軟件進行統計分析。對造模和干預階段體重隨時間變化數據進行重復測量方差分析，其中干預階段采用 Dunnett-t 檢驗進行事后檢驗（以模型對照組作為對照組，空白組和 3 個 COP 劑量組與其比較）；干預階段，抓力、肌肉系數（腓腸肌、比目魚肌和跖肌）、肌纖維直徑（脛骨前肌和跖肌）以及比目魚肌 Atrogin-1 mRNA 相對表達量數據均符合正態分布及方差齊性，采用均數±標準差表示，并采用單因素方差分析比較組間差異，當 P<0.05 時，進一步采用 Dunnett-t 檢驗進行事后檢驗；比目魚肌 MuRF-1 mRNA 相對表達量數據不服從正態分布，采用中位數（最小值，最大值）表示，使用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗分析組間差異，當 P<0.05 時，進一步采用“全部成對多重比較”進行事后檢驗。
非靶向代謝組學數據采用多元統計偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis, PLS-DA）和單變量 t 檢驗相結合的方式篩選組間差異代謝物。運用 PLS-DA 建立代謝物表達量與樣品類別之間的關系模型，對樣品類別進行預測，結合差異倍數和 P 值，確定各組間的差異代謝物。差異代謝物篩選條件：① 差異倍數≥1.20 或≤0.83；② P<0.05。P<0.05 的代謝通路為差異代謝物顯著富集的代謝通路。
2 結果
2.1 地塞米松對大鼠體重和肌纖維形態的影響
采用重復測量方差分析對空白組和模型組 6 個不同時間點體重進行分析。多變量檢驗部分的統計結果顯示：時間有統計學意義（F=197.458，P<0.01），時間和分組的交互作用有統計學意義（F=142.762，P<0.01），表明兩組隨時間的變化不一致；進一步采用簡單效應分析兩組在不同時間點的體重差異，結果顯示腹腔注射地塞米松第 7 天至造模結束，模型組大鼠體重均小于空白組（P<0.05），見圖1a。
圖1
地塞米松對大鼠體重和肌纖維形態的影響
a. 造模階段大鼠體重變化，*與空白組比較，
造模結束，與空白組相比，鏡下可見模型組腓腸肌、比目魚肌肌纖維之間間隙增大，肌纖維直徑減小，部分區域肌原纖維分裂，肌纖維萎縮，見圖1b，提示造模成功。
2.2 COP 對大鼠體重變化的影響
整個干預期間，各組大鼠體重均呈現增加趨勢。多變量檢驗部分的統計結果顯示：時間有統計學意義（F=64.992，P<0.01），時間和分組的交互作用無統計學意義（F=1.490，P>0.05）；主體間效應檢驗結果顯示分組因素對體重存在影響（F=7.823，P<0.01），Dunnett-t 事后檢驗結果顯示模型對照組大鼠體重小于空白組（P<0.01），與模型對照組大鼠相比，COP-L 組、COP-M 組、COP-H 組體重差異無統計學意義（P>0.05），見圖2。
圖2
COP 對大鼠體重增長趨勢的影響
*模型對照組與空白組比較，
2.3 COP 對大鼠肌肉相關指標的影響
COP 干預 33 d 后，大鼠肌肉相關指標中存在組間差異的指標見表2。
表2
COP 干預 33 d 后各組大鼠肌肉相關指標比較（n=9）
2.3.1 抓力
與空白組大鼠相比，模型對照組大鼠抓力略降低，但差異無統計學意義（P>0.05）。與模型對照組大鼠相比，COP-L 組、COP-M 組大鼠抓力提高，差異有統計學意義（P<0.01）。
2.3.2 肌肉系數
與空白組大鼠相比，模型對照組大鼠腓腸肌、比目魚肌、跖肌的肌肉系數均一定程度減小，但差異無統計學意義（P>0.05）。與模型對照組大鼠相比，COP-L 組大鼠腓腸肌、比目魚肌、跖肌的肌肉系數均增大（P<0.05），COP-M 組大鼠跖肌的肌肉系數增大（P<0.05），COP-H 組大鼠腓腸肌、比目魚肌的肌肉系數增大（P<0.05）。各組脛骨前肌肌肉系數差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.3 肌纖維直徑
與空白組大鼠相比，模型對照組大鼠脛骨前肌肌纖維直徑顯著減小，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型對照組相比，COP-L 組大鼠脛骨前肌肌纖維直徑增大（P<0.05），COP-M 組和 COP-H 組大鼠脛骨前肌和跖肌肌纖維直徑增大（P<0.05）。各組腓腸肌、比目魚肌肌纖維直徑差異無統計學意義（P>0.05）。
此外，HE 染色后鏡下可見空白組大鼠 3 種肌肉肌纖維結構完整，肌纖維細胞排列整齊且緊密。模型對照組大鼠腓腸肌、脛骨前肌肌纖維變細，肌纖維之間的間隙增大，肌纖維細胞排列不整齊，結構不完整。而 COP 干預后大鼠肌纖維結構明顯恢復，肌纖維細胞排列緊密，肌纖維之間的間隙明顯縮小。見圖3。
圖3
干預結束后大鼠腓腸肌、脛骨前肌、跖肌病理檢查圖像（HE ×200）
黑箭示與模型對照組比較，COP 組肌纖維結構恢復，肌纖維細胞排列緊密，肌纖維之間的間隙明顯縮小
2.3.4 Atrogin-1 和 MuRF-1 mRNA 相對表達量
與空白組大鼠相比，模型對照組比目魚肌中 Atrogin-1 mRNA 相對表達量顯著增加（P<0.05）；與模型對照組大鼠相比，COP 3 個劑量組比目魚肌中 Atrogin-1 mRNA 相對表達量均下降（P<0.05），COP-L 組、COP-H 組比目魚肌中 MuRF-1 mRNA 相對表達量下降（P<0.05）。各組腓腸肌、脛骨前肌、跖肌中 Atrogin-1 和 MuRF-1 mRNA 相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.4 COP 對肌肉代謝的影響
2.4.1 差異代謝物篩選
本研究根據代謝物的二級質譜碎片信息對化合物進行定性后，共鑒定到 290 種代謝物，其中正離子模式下 191 個，負離子模式下 99 個。根據代謝物的檢測結果與鑒定結果在數據庫中的匹配情況，將鑒定結果劃分為不同的可信度等級，等級 1～5 的可信度依次下降。篩選等級為 1、2、3 的差異代謝物，綜合正負離子模式整合為柱狀圖進行直觀比較（圖4）。相較于模型對照組，COP-L 組共有 10 種化合物顯著升高，包括 D-葡萄糖 6-磷酸鹽、B-d-果糖 6-磷酸、精氨酸、檸檬酸鹽等，其中 D-葡萄糖 6-磷酸鹽、B-d-果糖 6-磷酸為磷酸戊糖途徑的上游代謝物。COP-M 組共有 27 種化合物顯著升高，包括色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等必需氨基酸；8 種代謝物顯著下降，如膽酸、肉蔻豆酸等。COP-H 組共有 2 種化合物顯著升高，分別是 N-乙酰基-1 天冬氨酸谷氨酸和 L-3 苯基乳酸；4 種代謝物顯著降低，包括膽酸和 4-羧基苯甘氨酸等。
圖4
差異代謝物表達倍數分析
a. COP-L 組
2.4.2 差異代謝物的代謝通路富集分析
圖5 氣泡圖顯示綜合正負離子模式篩選到的差異代謝物，COP 3 個劑量組與模型對照組相比，顯著富集的通路分別有 28、21、7 條。其中 COP-L 組顯示富集的代謝物較多且差異性較高的包括 6 條與氨基酸合成代謝相關的代謝通路、3 條與酸類代謝相關通路和 3 條與糖代謝相關通路：芳香族氨基酸的生物合成，三羧酸循環，賴氨酸生物合成，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代謝，丙酮酸代謝，牛磺酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，磷酸戊糖途徑，糖酵解與糖代謝合成。COP-M 組富集的通路包括精氨酸和脯氨酸代謝、芳香族氨基酸的生物合成、氨酰基-tRNA 生物合等成。COP-H 組差異代謝物富集的通路雖較少，但也涉及 β-丙氨酸代謝、泛酸和輔酶 A 的生物合成等與氨基酸代謝和能量代謝相關的通路。此外，嘌呤代謝通路在 COP 3 個劑量組均呈現較高的差異性且富集到的代謝物較多，但該通路的主要代謝產物尿酸在 3 組中未呈現明顯上調或下調。COP-L 組、COP-M 組顯示芳香族氨基酸的生物合成通路富集到的代謝產物較多。
圖5
代謝通路富集分析氣泡圖
a. COP-L 組
3 討論
肌肉萎縮的臨床癥狀表現為肌肉力量的減弱，肌纖維變細甚至消失，肌肉體積縮小[1]。大量研究表明，低聚肽、氨基酸以及其代謝物可改善肌肉萎縮[14-17]。在本研究中，連續給予大鼠 33 d COP 后，由地塞米松誘導的腓腸肌、脛骨前肌、跖肌肌纖維萎縮得到明顯改善，抓力也明顯提高，這與 Yamamoto 等[18]連續喂養支鏈氨基酸 5 d 后可改善由地塞米松誘導的大鼠比目魚肌肌纖維直徑減小相似。但與模型對照組相比，3 個劑量組大鼠體重均未出現差異，這可能與干預時間相對較短，尚未引起體重明顯改變有關。
泛素-蛋白酶體途徑在骨骼肌蛋白分解中起重要作用，E3 泛素連接酶 MuRF-1 和 Atrogin-1 mRNA 相對表達量是判斷蛋白降解的關鍵指標[19-20]。動物和細胞實驗發現，在肌肉分解過程中 MuRF-1 和 Atrogin-1 表達增加[20-21]。本研究結果顯示，地塞米松導致大鼠比目魚肌中 Atrogin-1 和 MuRF-1 的 mRNA 表達量增加，而 COP 可減小兩者的表達，這可能與 COP 中含有較高比例支鏈氨基酸密切相關。研究表明，支鏈氨基酸中的亮氨酸可抑制肌肉萎縮時 MuRF-1 和 Atrogin-1 表達量上調，調控泛素-蛋白酶體途徑，抑制骨骼肌蛋白的降解[19-23]。因此，我們猜測 COP 改善肌肉萎縮的機制可能與支鏈氨基酸類似。
這也與我們對差異代謝物及其富集的代謝通路分析發現相一致，給予 COP 干預后，亮氨酸、甘氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸等代謝產物增加，氨基酸代謝通路如三羧酸循環、芳香族氨基酸代謝通路等被激活。現有研究表明，氨基酸水平的改變可以無差別地刺激肌肉蛋白的合成[24]。谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等與骨骼肌質量指數、握力相關[25]。氨基酸、肉堿和脂肪酸氧化標志物與體質量指數、脂肪百分比和四肢骨骼肌肉量相關性較強[26]。由此可見，COP 可能通過三羧酸循環、芳香族氨基酸合成等通路，生成亮氨酸、纈氨酸以及苯丙氨酸等，可為肌肉蛋白合成提供底物，改善地塞米松誘導的肌肉萎縮。
酸性化合物在體內積累，可破壞體內的酸堿平衡，肌肉在酸性環境中降解的幅度增大，我們發現 COP 可激活與酸類物質代謝相關的通路，與之對應的泛酸、膽酸等酸性物質明顯下調，根據楊蕾[27]對中老年人肌少癥血液代謝組學結果，即肌少癥血液中酸性物質明顯增加，我們猜測 COP 可通過激活酸降解通路，減少酸性物質在體內的蓄積，改善骨骼肌蛋白所處酸性環境。此外，研究表明，萎縮中的骨骼肌糖酵解代謝明顯減少，引起下游產物減少以及上游代謝物積累[28]，本研究中，與模型對照組相比，COP-L 組 3 條糖代謝通路雖被激活，但磷酸戊糖途徑中的上游代謝物 D-葡萄糖 6-磷酸鹽和 B-d-果糖 6-磷酸上調，而 COP-H 組未發現兩者的累積且與能量代謝相關的泛酸和輔酶 A 的生物合成途徑被激活，我們猜測 COP-L 逆轉糖酵解的強度較低，COP-H 可進一步增強肌肉糖酵解與能量供應。綜上，本研究表明 COP 可為骨骼肌蛋白合成提供底物，改善由地塞米松誘導的大鼠肌纖維萎縮，機制可能與通過減小泛素-蛋白酶體途徑中 E3 泛素連接酶的表達和增加肌肉中重要氨基酸的生物合成有關。
目前，臨床上干預肌肉萎縮的營養措施多為動物蛋白（如牛肉和乳清蛋白）和優質植物蛋白（大豆分離蛋白），雖已納入專家診療意見，但相比于低聚肽、氨基酸等，分子量較大，進入消化道后不可直接吸收，轉運速度慢，耗能高，消化率和利用率受機體因素影響大。所以開發以低聚肽、氨基酸等為營養底物的復配營養制劑至關重要，可一定程度上彌補動植物蛋白的缺點，本研究發現的 COP 改善肌肉萎縮作用，可為肌肉萎縮精準臨床干預提供新的營養底物。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
