引用本文： 張靜, 潘曉華, 劉國榮, 郭立志, 倪朝文, 王越, 于英英. 沉默 NLRP3 基因對促炎劑誘導大鼠腦微血管內皮細胞表達炎癥因子的影響研究. 華西醫學, 2022, 37(6): 855-862. doi: 10.7507/1002-0179.202205008 復制
NOD 樣受體家族含 pyrin 結構域蛋白 3（NOD-like receptor family, pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎癥小體是胞漿內模式識別受體[1]，表達于免疫細胞及內皮細胞等非免疫細胞[2]，可因線粒體功能障礙、活性氧產生、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）等觸發而激活，并進一步激活下游炎癥因子產生炎癥反應[3-4]。腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cell，BMEC）表面具有很多獨特的蛋白成分，是探索腦卒中發病機制、延緩腦動脈粥樣硬化、構建血腦屏障模型等常用的細胞[5]，腦小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）就是一類發生于顱內由微小血管病變引起的綜合征[6-7]。由炎性或免疫介導的慢性炎癥在 CSVD 的發病機制中發揮著重要作用，然而相關的炎癥反應通路證據不足，研究還有待深入。我們在前期臨床試驗中通過檢測 CSVD 患者血清白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 的濃度，發現 IL-1β 表達明顯升高（P<0.05），推測炎癥因子 IL-1β 與 CSVD 的發病有相關性[8]；在細胞學實驗中將體外分離培養的 BMEC 分為正常對照組、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激組和 LPS+ATP 共同刺激組，采用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對各組細胞進行檢測，結果發現兩種促炎劑 LPS+ATP 可誘導 BMEC 產生炎癥因子 IL-1β 和 IL-18，且與正常對照組及 LPS 單獨刺激組相比表達顯著升高（P<0.05）[9]。為此我們在已有結論的支持下，并根據相關文獻報道中的方法，結合 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術，進一步研究 NLRP3 炎癥小體相關通路在大鼠 BMEC 經促炎劑作用形成的 CSVD 細胞模型中的作用及調控機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與材料
1.1.1 實驗動物
12 只 4 周齡無特定病原體級雄性 Wistar 大鼠，體重（100±10）g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。本研究通過內蒙古科技大學包頭醫學院動物倫理委員會批準。
1.1.2 藥物及試劑
內皮細胞專用培養基套裝（美國 ScicenCell 公司）；牛血清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司）；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（北京索萊寶科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶（美國 Sigma 公司）；膠原酶/分散酶（瑞士 Roche 公司）；DNA 酶Ⅰ（美國 Sigma 公司）；Ⅷ因子相關抗原（von Willebrand factor protein，vWF）抗體（美國 Proteintech 公司）；膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（美國 Proteintech 公司）；熒光 647 標記驢抗兔免疫球蛋白 G 抗體（美國 Biolegend 公司）；熒光 488 標記山羊抗兔免疫球蛋白 G（H+L）（北京中杉金橋生物技術有限公司）；兔抗-重組抗-NLRP3 抗體（英國 Abcam 公司）；兔抗-Caspase-1 抗體（美國 Proteintech 公司）；LPS（美國 Sigma 公司）；ATP 二鈉鹽水合物（美國 Sigma 公司）；Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen 公司）；減血清培養基（含酚紅）（美國 Invitrogen 公司）。
1.1.3 實驗地點及儀器設備
實驗地點：包頭市中心醫院神經內科實驗室。以下設備均由該實驗室提供：BC-J80S 二氧化碳細胞培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；IX73 奧林巴斯顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；SCIENTZ-ⅡD 超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Centrifuge 5430R 高速冷凍離心機（德國 Eppendorf 公司）；Model 680 酶標儀（美國 Bio-Rad 公司）； ChemiDoctmXRS+凝膠成像儀（美國 Bio-Rad 公司）；PowerPac Universal 電泳儀（美國 Bio-Rad 公司）。
1.2 研究方法
1.2.1 大鼠 BMEC 體外分離培養及鑒定
取 12 只 4 周齡雄性 Wistar 大鼠，腹腔注射質量分數為 1% 的水合氯醛（0.5 mL/100 g），無菌條件下斷頭、取腦、剝離除大腦皮質外的其余組織，并用濾紙粘除軟腦膜及大血管，漂洗、剪碎最終獲得大小約 1 mm3 的組織。依次加入 0.1% 的Ⅱ型膠原酶、0.1% 的膠原酶/分散酶、2 kU/mL DNA 酶Ⅰ充分混勻并離心即獲取腦微血管段，再根據不同種類細胞貼壁時間不同差速培養以去除雜質細胞，最終獲得大鼠 BMEC。待細胞培養到第 4 代后進行免疫熒光鑒定。按照預先分組分別加入稀釋的 1 mL vWF（1∶200）或 GFAP 溶液（1∶100），置于 4℃冰箱中孵育 8～12 h。再加入稀釋的 1 mL 488 熒光染料（1∶300）或 647 熒光染料（1∶300），室溫避光孵育 2 h 后染核，相差顯微鏡下觀察。
1.2.2 細胞轉染
采用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）分子對 BMEC 內的特定基因 NLRP3 進行沉默。由于短發卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）分子能夠通過質粒載體導入細胞，并利用細胞內的酶切機制得到 siRNA 而最終發揮 RNAi 作用，故我們選取質粒作為載體，借助于轉染試劑 Lipofectamine 2000 將載有目的基因序列的 shRNA 分子導入 BMEC 中。為了便于對照，我們同時也對 BMEC 轉染了未載有目的基因序列的質粒陰性對照，兩種表達載體及基因序列均由蘇州吉瑪基因股份有限公司設計合成。將加入轉染試劑的細胞繼續培養 48 h 后給予促炎劑處理并進一步提取蛋白及 mRNA 檢測 NLRP3 和 Caspase-1 的表達情況。序列如表1 所示。
表1
shRNA 和 shNC 表達載體基因序列
1.2.3 細胞分組及干預
正常培養的細胞分為空白對照組和 LPS+ATP 組（加入濃度為 1 μg/mL 的 LPS 于細胞培養箱內培養 5.5 h，再加入終濃度達 5 mmol/L 的 ATP 繼續培養 0.5 h[10]）；RNAi 技術培養的細胞分為 siNC 組（未沉默目的基因）、siNLRP3 組（沉默目的基因）、siNC+LPS+ATP 組（未沉默目的基因及加促炎劑）和 siNLRP3+LPS+ATP 組（沉默目的基因及加促炎劑）。本研究各組均設置 6 個樣本。
1.2.4 蛋白質印跡法檢測 BMEC 中 NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達水平
向細胞沉淀中加入含有蛋白酶抑制劑苯基甲烷磺酰氟化物的細胞裂解液（比例為 100∶1），經超聲波粉碎得到蛋白樣品溶液并測定濃度以保證每個泳道加入的體積中均含有 50 μg 蛋白質。采用蛋白質印跡法進行電泳、轉模、封閉后敷抗體，其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白抗體稀釋濃度為 1∶2000，NLRP3 抗體稀釋濃度為 1∶500，Caspase-1 抗體稀釋濃度為 1∶1000，辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋濃度為 1∶2000。將滴有超敏發光液的聚偏氟乙烯膜置于凝膠發光成像儀中曝光，拍照。用 Image J 軟件進行灰度值分析。
1.2.5 實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測 BMEC 中 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 表達水平
根據 RNA 提取試劑盒步驟提取細胞 RNA 并測定濃度，逆轉錄合成互補 DNA 后通過 RT-PCR 檢測各基因的相對表達量。對于獲取的數據采用 ΔΔCt 法進行處理。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，并進行 DNA 質譜檢測，DNA 序列正確。各引物序列見表2。
表2
引物序列
1.3 統計學方法
應用 SPSS 25.0 統計軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩獨立樣本比較采用 t 檢驗；4 組樣本均數間比較首先進行 Levene 方差齊性檢驗，若滿足 P>0.10 則進行析因設計的方差分析，并采用 LSD 法進行單獨效應的分析。不符合正態分布則以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，兩獨立樣本比較采用 Wilcoxon 秩和檢驗。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠 BMEC 的形態結構
分離培養 24 h 后可見腦微血管段呈“串珠狀”貼壁出芽生長，周圍長出內皮細胞（圖1a）；48 h 后細胞團呈“島嶼狀”，細胞集落擴大成團簇樣分布（圖1b）；72 h 后腦微血管段塌陷，細胞呈典型的“鋪路石”樣單層貼壁生長（圖1c）；第 4～6 天在腦微血管段周圍長出的內皮細胞越來越密集（圖1d）；第 8～10 天 BMEC 匯合度達 80%，短縮形或“紡錘形”細胞形態明顯，細胞核清晰可見，此為第 1 代 BMEC（圖1e），可進行分瓶傳代培養。第 1 次傳代培養的細胞相互聚集呈“鋪路石”或“旋渦狀”，仍保持原代細胞的形態結構（圖1f）。
圖1
相差顯微鏡下觀察細胞形態結構
a. 10 倍鏡下觀察腦微血管段分離培養 24 h 后呈“串珠狀”； b. 10 倍鏡下觀察 BMEC 培養 48 h 后呈“島嶼狀”細胞團；c. 4 倍鏡下觀察 BMEC 培養 72 h 后呈“鋪路石”樣單層貼壁生長；d. 4 倍鏡下觀察 BMEC 培養 4～6 d 后細胞越來越密集；e. 10 倍鏡下觀察培養 8～10 d 后的第 1 代 BMEC，細胞呈短縮形或“紡錘形”，細胞核清晰可見；f. 4 倍鏡下觀察第 1 次傳代培養的細胞呈“鋪路石”或“旋渦狀”，仍保持原代細胞的形態結構
2.2 vWF 免疫熒光染色
綠色熒光標記 BMEC 表面 vWF 96% 以上細胞均被標記為綠色，紅色熒光標記 GFAP 蛋白表達可見零星幾點，本次提取的 BMEC 純度達 96%，免疫熒光染色后鏡下觀察細胞形態見圖2。
圖2
BMEC 經過免疫熒光染色后相差顯微鏡 10 倍鏡下觀察細胞形態結構
綠色熒光標記的為 BMEC；紅色熒光標記的為星形膠質細胞，可見零星幾點
2.3 NLRP3、Caspase-1 的表達水平
2.3.1 正常培養的細胞
NLRP3、Caspase-1 的蛋白及 mRNA 相對表達量在 LPS+ATP 組均較空白對照組升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3、表3。
圖3
正常培養大鼠 BMEC NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達條帶
表3
空白對照組與 LPS+ATP 組 NLRP3、Caspase-1 相對表達水平比較（n=6）
2.3.2 RNAi 技術培養的細胞
對于 NLRP3、Caspase-1 的蛋白和 mRNA 相對表達量，給予轉染質粒和促炎劑干預的主效應均有統計學意義（P<0.05）；對于 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 相對表達量，轉染質粒和促炎劑干預的交互效應有統計學意義（P<0.05）。NLRP3、Caspase-1 的蛋白及 mRNA 相對表達量兩兩比較結果顯示，siNLRP3 組較 siNC 組、siNLRP3+LPS+ATP 組較 siNC+LPS+ATP 組表達量均降低（P<0.05），siNC+LPS+ATP 組較 siNC 組、siNLRP3+LPS+ATP 組較 siNLRP3 組表達量均升高（P<0.05）。見表4、5，圖4。
圖4
RNAi 培養大鼠 BMEC NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達條帶
表4
RNAi 培養的 BMEC 蛋白相對表達水平比較（n=6，
）
表5
RNAi 培養的 BMEC mRNA 相對表達水平比較（n=6，
）
3 討論
BMEC 處在一個流動性的液體環境中，在腦的代謝及限制血液中物質進出等方面發揮關鍵作用，近年來越來越多的研究強調了 BMEC 在中樞神經系統中的重要地位。Wang 等[11]研究指出，大腦內血液流動過程中產生的流體剪切應力能夠作用于 BMEC 促進其分化并進一步完善腦內的屏障功能，這種生理性的血流動力能夠抑制炎癥信號的傳遞和穩定細胞的形態結構，然而對于腦動脈疾病血管搭橋術后的患者，因超出生理范圍的流體剪切應力作用而造成 BMEC 的損傷最終導致腦出血。LPS 是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分，可對 BMEC 造成損傷進而促進腦血管炎癥的發生及發展，故常用于誘導神經炎癥模型[12-13]。有研究指出，處于有氧條件下的液體環境中的 BMEC 其表面具有的藥物代謝酶也能發揮和肝細胞類似的代謝能力，是阻止藥物在組織間進行轉移的重要代謝屏障[14]。由于腦部微小血管病變能夠導致 CSVD 的發生，同樣的我們的實驗提取了大鼠大腦皮質的 BMEC 為研究對象進一步探索 CSVD 基于腦部微血管病變的發病機制。
而對于 BMEC 的體外分離培養方法，近年來在逐步的改進以求獲取精細的、雜質含量少的細胞結構。王義寶等[15]對提取 Wistar 胎鼠的腦組織進行玻璃勻漿器搗碎，使用 15% 葡聚糖溶液進行高速梯度離心后再給予膠原酶消化而獲得 BMEC，完成了大鼠 BMEC 體外培養的初步探索，并指出隨著原代細胞傳代次數的增加其屏障特性逐漸減弱。鹿文葆等[16]對于體外提取的大鼠大腦組織首先使用濾紙吸附軟腦膜和大血管，后采用機械剪碎法將大腦皮質剪碎成約 1 mm3 大小的組織，再給予Ⅱ型膠原酶、膠原酶/分散酶和 DNA 酶Ⅰ聯合消化去除多余的蛋白成分，使用含有機溶劑的 Percoll 細胞分離液連續梯度離心，最終獲得了純度較高的大鼠 BMEC，避免了勻漿搗碎對微血管活力的損傷。同樣，徐平湘等[17]對大鼠 BMEC 的分離過程采用了 3 種酶聯合消化大腦皮質的方法，并根據不同細胞類型的貼壁時間不同，采用差速貼壁培養法最終獲取純度較高的大鼠 BMEC，替代了以前的勻漿器勻漿及有機溶劑離心的方法，進一步減少對腦微血管段的機械損傷。我們的實驗即采用 3 種酶聯合消化、差速貼壁培養的方法并最終獲得純度較高的 BMEC。顯微鏡下所觀察到的細胞形態結構與相關文獻報道中的細胞特征類似[15-18]，且傳代細胞仍然保持原代細胞的特性，BMEC 的成功提取是后續實驗的前提和基礎。
我們的研究對提取的 BMEC 給予促炎劑 LPS+ATP 誘導，初步構建了 CSVD 的炎性細胞模型，基于課題小組前期細胞實驗初步得出的結論[9]，即兩種促炎劑 LPS+ATP 可誘導 BMEC 產生炎癥因子 IL-1β 和 IL-18，為了進一步驗證 NLRP3 炎癥小體也參與促炎劑誘導 BMEC 的炎癥反應過程，我們首先采用蛋白質印跡法和 RT-PCR 兩種技術，對未經藥物干預處理的細胞和經 LPS+ATP 干預處理的細胞分別檢測了 NLRP3 和下游炎癥因子 Caspase-1 的表達，結果與預期結果相吻合。這與劉蓓樺等[10]通過對小鼠巨噬細胞給予 LPS+ATP 共同刺激后采用 RT-PCR 和 ELISA 技術檢測 NLRP3、Caspase-1 及 IL-1β 的結果相一致。盧曉星等[19]使用 LPS 與 ATP 聯合誘導小鼠小膠質細胞后，發現細胞存活率明顯降低，細胞上清液中乳酸脫氫酶活力顯著升高，即 LPS+ATP 可以改變細胞膜的完整性，加重細胞的損傷；采用蛋白質印跡法和 ELISA 技術檢測 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18 其表達明顯升高。故促炎劑 LPS 和 ATP 聯合誘導能夠產生 NLRP3 炎癥小體，并進一步促進下游炎癥因子 Caspase-1 的釋放。
在對大鼠 BMEC 給予 siRNA NLRP3 下調 NLRP3 的表達，經促炎劑 LPS+ATP 誘導后發現，siNLRP3+LPS+ATP 組與 siNLRP3 組相比 NLRP3 炎癥小體及下游炎癥因子 Caspase-1 的表達升高，轉染質粒陰性對照的 siNC+LPS+ATP 組與 siNC 組相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表達升高，說明促炎劑 LPS+ATP 能夠誘導大鼠 BMEC 產生炎癥因子，與未經轉染的 BMEC 通過蛋白質印跡法和 RT-PCR 技術檢測的結果一致。siNLRP3 組與 siNC 組相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表達降低，siNLRP3+LPS+ATP 組與 siNC+LPS+ATP 組相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表達降低，說明 BMEC 經過 RNAi 技術沉默 NLRP3 基因表達后，給予促炎劑 LPS+ATP 和不給予促炎劑進行干預都能降低 NLRP3 的產生，同時也進一步抑制下游炎癥因子 Caspase-1 的釋放，符合 NLRP3 炎癥小體信號通路參與炎癥反應過程的特點。由于我們在轉染過程中未檢測細胞的存活及凋亡，也不除外轉染后一部分新生細胞在經過促炎劑誘導而產生炎癥因子，但是對轉染后的沉默基因組和質粒陰性對照組再次給予促炎劑誘導后檢測 NLRP3、Caspase-1 的表達差異明顯，說明了沉默 NLRP3 基因表達進而抑制炎癥因子產生的效果顯著。
本實驗在這一步得出的結論與相關文獻報道的相似研究得出的結論類似。李鈺婷等[20]對野生型 C57BL/6 小鼠和 NLRP3 基因敲除小鼠先后給予 Triton-WR1339、芹菜素灌胃處理后，發現基因敲除小鼠給予芹菜素后血清生化指標總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均明顯降低，高密度脂蛋白明顯升高；而 NLRP3 炎癥小體的相關炎性指標 IL-1β、IL-6 也顯著降低，說明 NLRP3 炎癥小體能夠干預芹菜素的降脂療效。薛鴻等[21]對人肺動脈內皮細胞給予沉默 NLRP3 基因表達后，加用香煙煙霧提取物誘導內皮細胞的凋亡發現，其細胞存活率較未給予沉默基因表達的陰性對照組明顯增加；對人肺動脈內皮細胞給予香煙煙霧提取物，再加用乙酰半胱氨酸處理后發現，與未加用乙酰半胱氨酸處理的細胞相比，其炎癥因子 NLRP3、Caspase-1 的表達明顯下降。即這一提取物能夠導致人肺動脈內皮細胞發生凋亡并產生炎癥，經過沉默 NLRP3 基因的表達，或是給予乙酰半胱氨酸處理后這種損傷作用可進一步減輕。
總之，我們的實驗結果進一步證實促炎劑 LPS+ATP 共同誘導能夠促進大鼠 BMEC 中 NLRP3 炎癥小體和下游炎癥因子 Caspase-1 的釋放；沉默 NLRP3 基因表達能夠降低大鼠 BMEC 經促炎劑 LPS+ATP 誘導產生 NLRP3 炎癥小體及下游炎癥因子 Caspase-1。NLRP3 炎癥小體信號通路可能在大鼠 BMEC 經促炎劑作用形成的 CSVD 細胞模型中發揮作用。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
NOD 樣受體家族含 pyrin 結構域蛋白 3（NOD-like receptor family, pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎癥小體是胞漿內模式識別受體[1]，表達于免疫細胞及內皮細胞等非免疫細胞[2]，可因線粒體功能障礙、活性氧產生、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）等觸發而激活，并進一步激活下游炎癥因子產生炎癥反應[3-4]。腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cell，BMEC）表面具有很多獨特的蛋白成分，是探索腦卒中發病機制、延緩腦動脈粥樣硬化、構建血腦屏障模型等常用的細胞[5]，腦小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）就是一類發生于顱內由微小血管病變引起的綜合征[6-7]。由炎性或免疫介導的慢性炎癥在 CSVD 的發病機制中發揮著重要作用，然而相關的炎癥反應通路證據不足，研究還有待深入。我們在前期臨床試驗中通過檢測 CSVD 患者血清白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 的濃度，發現 IL-1β 表達明顯升高（P<0.05），推測炎癥因子 IL-1β 與 CSVD 的發病有相關性[8]；在細胞學實驗中將體外分離培養的 BMEC 分為正常對照組、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激組和 LPS+ATP 共同刺激組，采用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對各組細胞進行檢測，結果發現兩種促炎劑 LPS+ATP 可誘導 BMEC 產生炎癥因子 IL-1β 和 IL-18，且與正常對照組及 LPS 單獨刺激組相比表達顯著升高（P<0.05）[9]。為此我們在已有結論的支持下，并根據相關文獻報道中的方法，結合 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術，進一步研究 NLRP3 炎癥小體相關通路在大鼠 BMEC 經促炎劑作用形成的 CSVD 細胞模型中的作用及調控機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與材料
1.1.1 實驗動物
12 只 4 周齡無特定病原體級雄性 Wistar 大鼠，體重（100±10）g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。本研究通過內蒙古科技大學包頭醫學院動物倫理委員會批準。
1.1.2 藥物及試劑
內皮細胞專用培養基套裝（美國 ScicenCell 公司）；牛血清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司）；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型（北京索萊寶科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶（美國 Sigma 公司）；膠原酶/分散酶（瑞士 Roche 公司）；DNA 酶Ⅰ（美國 Sigma 公司）；Ⅷ因子相關抗原（von Willebrand factor protein，vWF）抗體（美國 Proteintech 公司）；膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（美國 Proteintech 公司）；熒光 647 標記驢抗兔免疫球蛋白 G 抗體（美國 Biolegend 公司）；熒光 488 標記山羊抗兔免疫球蛋白 G（H+L）（北京中杉金橋生物技術有限公司）；兔抗-重組抗-NLRP3 抗體（英國 Abcam 公司）；兔抗-Caspase-1 抗體（美國 Proteintech 公司）；LPS（美國 Sigma 公司）；ATP 二鈉鹽水合物（美國 Sigma 公司）；Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen 公司）；減血清培養基（含酚紅）（美國 Invitrogen 公司）。
1.1.3 實驗地點及儀器設備
實驗地點：包頭市中心醫院神經內科實驗室。以下設備均由該實驗室提供：BC-J80S 二氧化碳細胞培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；IX73 奧林巴斯顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；SCIENTZ-ⅡD 超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Centrifuge 5430R 高速冷凍離心機（德國 Eppendorf 公司）；Model 680 酶標儀（美國 Bio-Rad 公司）； ChemiDoctmXRS+凝膠成像儀（美國 Bio-Rad 公司）；PowerPac Universal 電泳儀（美國 Bio-Rad 公司）。
1.2 研究方法
1.2.1 大鼠 BMEC 體外分離培養及鑒定
取 12 只 4 周齡雄性 Wistar 大鼠，腹腔注射質量分數為 1% 的水合氯醛（0.5 mL/100 g），無菌條件下斷頭、取腦、剝離除大腦皮質外的其余組織，并用濾紙粘除軟腦膜及大血管，漂洗、剪碎最終獲得大小約 1 mm3 的組織。依次加入 0.1% 的Ⅱ型膠原酶、0.1% 的膠原酶/分散酶、2 kU/mL DNA 酶Ⅰ充分混勻并離心即獲取腦微血管段，再根據不同種類細胞貼壁時間不同差速培養以去除雜質細胞，最終獲得大鼠 BMEC。待細胞培養到第 4 代后進行免疫熒光鑒定。按照預先分組分別加入稀釋的 1 mL vWF（1∶200）或 GFAP 溶液（1∶100），置于 4℃冰箱中孵育 8～12 h。再加入稀釋的 1 mL 488 熒光染料（1∶300）或 647 熒光染料（1∶300），室溫避光孵育 2 h 后染核，相差顯微鏡下觀察。
1.2.2 細胞轉染
采用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）分子對 BMEC 內的特定基因 NLRP3 進行沉默。由于短發卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）分子能夠通過質粒載體導入細胞，并利用細胞內的酶切機制得到 siRNA 而最終發揮 RNAi 作用，故我們選取質粒作為載體，借助于轉染試劑 Lipofectamine 2000 將載有目的基因序列的 shRNA 分子導入 BMEC 中。為了便于對照，我們同時也對 BMEC 轉染了未載有目的基因序列的質粒陰性對照，兩種表達載體及基因序列均由蘇州吉瑪基因股份有限公司設計合成。將加入轉染試劑的細胞繼續培養 48 h 后給予促炎劑處理并進一步提取蛋白及 mRNA 檢測 NLRP3 和 Caspase-1 的表達情況。序列如表1 所示。
表1
shRNA 和 shNC 表達載體基因序列
1.2.3 細胞分組及干預
正常培養的細胞分為空白對照組和 LPS+ATP 組（加入濃度為 1 μg/mL 的 LPS 于細胞培養箱內培養 5.5 h，再加入終濃度達 5 mmol/L 的 ATP 繼續培養 0.5 h[10]）；RNAi 技術培養的細胞分為 siNC 組（未沉默目的基因）、siNLRP3 組（沉默目的基因）、siNC+LPS+ATP 組（未沉默目的基因及加促炎劑）和 siNLRP3+LPS+ATP 組（沉默目的基因及加促炎劑）。本研究各組均設置 6 個樣本。
1.2.4 蛋白質印跡法檢測 BMEC 中 NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達水平
向細胞沉淀中加入含有蛋白酶抑制劑苯基甲烷磺酰氟化物的細胞裂解液（比例為 100∶1），經超聲波粉碎得到蛋白樣品溶液并測定濃度以保證每個泳道加入的體積中均含有 50 μg 蛋白質。采用蛋白質印跡法進行電泳、轉模、封閉后敷抗體，其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白抗體稀釋濃度為 1∶2000，NLRP3 抗體稀釋濃度為 1∶500，Caspase-1 抗體稀釋濃度為 1∶1000，辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋濃度為 1∶2000。將滴有超敏發光液的聚偏氟乙烯膜置于凝膠發光成像儀中曝光，拍照。用 Image J 軟件進行灰度值分析。
1.2.5 實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測 BMEC 中 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 表達水平
根據 RNA 提取試劑盒步驟提取細胞 RNA 并測定濃度，逆轉錄合成互補 DNA 后通過 RT-PCR 檢測各基因的相對表達量。對于獲取的數據采用 ΔΔCt 法進行處理。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，并進行 DNA 質譜檢測，DNA 序列正確。各引物序列見表2。
表2
引物序列
1.3 統計學方法
應用 SPSS 25.0 統計軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩獨立樣本比較采用 t 檢驗；4 組樣本均數間比較首先進行 Levene 方差齊性檢驗，若滿足 P>0.10 則進行析因設計的方差分析，并采用 LSD 法進行單獨效應的分析。不符合正態分布則以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，兩獨立樣本比較采用 Wilcoxon 秩和檢驗。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠 BMEC 的形態結構
分離培養 24 h 后可見腦微血管段呈“串珠狀”貼壁出芽生長，周圍長出內皮細胞（圖1a）；48 h 后細胞團呈“島嶼狀”，細胞集落擴大成團簇樣分布（圖1b）；72 h 后腦微血管段塌陷，細胞呈典型的“鋪路石”樣單層貼壁生長（圖1c）；第 4～6 天在腦微血管段周圍長出的內皮細胞越來越密集（圖1d）；第 8～10 天 BMEC 匯合度達 80%，短縮形或“紡錘形”細胞形態明顯，細胞核清晰可見，此為第 1 代 BMEC（圖1e），可進行分瓶傳代培養。第 1 次傳代培養的細胞相互聚集呈“鋪路石”或“旋渦狀”，仍保持原代細胞的形態結構（圖1f）。
圖1
相差顯微鏡下觀察細胞形態結構
a. 10 倍鏡下觀察腦微血管段分離培養 24 h 后呈“串珠狀”； b. 10 倍鏡下觀察 BMEC 培養 48 h 后呈“島嶼狀”細胞團；c. 4 倍鏡下觀察 BMEC 培養 72 h 后呈“鋪路石”樣單層貼壁生長；d. 4 倍鏡下觀察 BMEC 培養 4～6 d 后細胞越來越密集；e. 10 倍鏡下觀察培養 8～10 d 后的第 1 代 BMEC，細胞呈短縮形或“紡錘形”，細胞核清晰可見；f. 4 倍鏡下觀察第 1 次傳代培養的細胞呈“鋪路石”或“旋渦狀”，仍保持原代細胞的形態結構
2.2 vWF 免疫熒光染色
綠色熒光標記 BMEC 表面 vWF 96% 以上細胞均被標記為綠色，紅色熒光標記 GFAP 蛋白表達可見零星幾點，本次提取的 BMEC 純度達 96%，免疫熒光染色后鏡下觀察細胞形態見圖2。
圖2
BMEC 經過免疫熒光染色后相差顯微鏡 10 倍鏡下觀察細胞形態結構
綠色熒光標記的為 BMEC；紅色熒光標記的為星形膠質細胞，可見零星幾點
2.3 NLRP3、Caspase-1 的表達水平
2.3.1 正常培養的細胞
NLRP3、Caspase-1 的蛋白及 mRNA 相對表達量在 LPS+ATP 組均較空白對照組升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3、表3。
圖3
正常培養大鼠 BMEC NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達條帶
表3
空白對照組與 LPS+ATP 組 NLRP3、Caspase-1 相對表達水平比較（n=6）
2.3.2 RNAi 技術培養的細胞
對于 NLRP3、Caspase-1 的蛋白和 mRNA 相對表達量，給予轉染質粒和促炎劑干預的主效應均有統計學意義（P<0.05）；對于 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 相對表達量，轉染質粒和促炎劑干預的交互效應有統計學意義（P<0.05）。NLRP3、Caspase-1 的蛋白及 mRNA 相對表達量兩兩比較結果顯示，siNLRP3 組較 siNC 組、siNLRP3+LPS+ATP 組較 siNC+LPS+ATP 組表達量均降低（P<0.05），siNC+LPS+ATP 組較 siNC 組、siNLRP3+LPS+ATP 組較 siNLRP3 組表達量均升高（P<0.05）。見表4、5，圖4。
圖4
RNAi 培養大鼠 BMEC NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達條帶
表4
RNAi 培養的 BMEC 蛋白相對表達水平比較（n=6，）
表5
RNAi 培養的 BMEC mRNA 相對表達水平比較（n=6，）
3 討論
BMEC 處在一個流動性的液體環境中，在腦的代謝及限制血液中物質進出等方面發揮關鍵作用，近年來越來越多的研究強調了 BMEC 在中樞神經系統中的重要地位。Wang 等[11]研究指出，大腦內血液流動過程中產生的流體剪切應力能夠作用于 BMEC 促進其分化并進一步完善腦內的屏障功能，這種生理性的血流動力能夠抑制炎癥信號的傳遞和穩定細胞的形態結構，然而對于腦動脈疾病血管搭橋術后的患者，因超出生理范圍的流體剪切應力作用而造成 BMEC 的損傷最終導致腦出血。LPS 是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分，可對 BMEC 造成損傷進而促進腦血管炎癥的發生及發展，故常用于誘導神經炎癥模型[12-13]。有研究指出，處于有氧條件下的液體環境中的 BMEC 其表面具有的藥物代謝酶也能發揮和肝細胞類似的代謝能力，是阻止藥物在組織間進行轉移的重要代謝屏障[14]。由于腦部微小血管病變能夠導致 CSVD 的發生，同樣的我們的實驗提取了大鼠大腦皮質的 BMEC 為研究對象進一步探索 CSVD 基于腦部微血管病變的發病機制。
而對于 BMEC 的體外分離培養方法，近年來在逐步的改進以求獲取精細的、雜質含量少的細胞結構。王義寶等[15]對提取 Wistar 胎鼠的腦組織進行玻璃勻漿器搗碎，使用 15% 葡聚糖溶液進行高速梯度離心后再給予膠原酶消化而獲得 BMEC，完成了大鼠 BMEC 體外培養的初步探索，并指出隨著原代細胞傳代次數的增加其屏障特性逐漸減弱。鹿文葆等[16]對于體外提取的大鼠大腦組織首先使用濾紙吸附軟腦膜和大血管，后采用機械剪碎法將大腦皮質剪碎成約 1 mm3 大小的組織，再給予Ⅱ型膠原酶、膠原酶/分散酶和 DNA 酶Ⅰ聯合消化去除多余的蛋白成分，使用含有機溶劑的 Percoll 細胞分離液連續梯度離心，最終獲得了純度較高的大鼠 BMEC，避免了勻漿搗碎對微血管活力的損傷。同樣，徐平湘等[17]對大鼠 BMEC 的分離過程采用了 3 種酶聯合消化大腦皮質的方法，并根據不同細胞類型的貼壁時間不同，采用差速貼壁培養法最終獲取純度較高的大鼠 BMEC，替代了以前的勻漿器勻漿及有機溶劑離心的方法，進一步減少對腦微血管段的機械損傷。我們的實驗即采用 3 種酶聯合消化、差速貼壁培養的方法并最終獲得純度較高的 BMEC。顯微鏡下所觀察到的細胞形態結構與相關文獻報道中的細胞特征類似[15-18]，且傳代細胞仍然保持原代細胞的特性，BMEC 的成功提取是后續實驗的前提和基礎。
我們的研究對提取的 BMEC 給予促炎劑 LPS+ATP 誘導，初步構建了 CSVD 的炎性細胞模型，基于課題小組前期細胞實驗初步得出的結論[9]，即兩種促炎劑 LPS+ATP 可誘導 BMEC 產生炎癥因子 IL-1β 和 IL-18，為了進一步驗證 NLRP3 炎癥小體也參與促炎劑誘導 BMEC 的炎癥反應過程，我們首先采用蛋白質印跡法和 RT-PCR 兩種技術，對未經藥物干預處理的細胞和經 LPS+ATP 干預處理的細胞分別檢測了 NLRP3 和下游炎癥因子 Caspase-1 的表達，結果與預期結果相吻合。這與劉蓓樺等[10]通過對小鼠巨噬細胞給予 LPS+ATP 共同刺激后采用 RT-PCR 和 ELISA 技術檢測 NLRP3、Caspase-1 及 IL-1β 的結果相一致。盧曉星等[19]使用 LPS 與 ATP 聯合誘導小鼠小膠質細胞后，發現細胞存活率明顯降低，細胞上清液中乳酸脫氫酶活力顯著升高，即 LPS+ATP 可以改變細胞膜的完整性，加重細胞的損傷；采用蛋白質印跡法和 ELISA 技術檢測 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18 其表達明顯升高。故促炎劑 LPS 和 ATP 聯合誘導能夠產生 NLRP3 炎癥小體，并進一步促進下游炎癥因子 Caspase-1 的釋放。
在對大鼠 BMEC 給予 siRNA NLRP3 下調 NLRP3 的表達，經促炎劑 LPS+ATP 誘導后發現，siNLRP3+LPS+ATP 組與 siNLRP3 組相比 NLRP3 炎癥小體及下游炎癥因子 Caspase-1 的表達升高，轉染質粒陰性對照的 siNC+LPS+ATP 組與 siNC 組相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表達升高，說明促炎劑 LPS+ATP 能夠誘導大鼠 BMEC 產生炎癥因子，與未經轉染的 BMEC 通過蛋白質印跡法和 RT-PCR 技術檢測的結果一致。siNLRP3 組與 siNC 組相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表達降低，siNLRP3+LPS+ATP 組與 siNC+LPS+ATP 組相比 NLRP3 及 Caspase-1 的表達降低，說明 BMEC 經過 RNAi 技術沉默 NLRP3 基因表達后，給予促炎劑 LPS+ATP 和不給予促炎劑進行干預都能降低 NLRP3 的產生，同時也進一步抑制下游炎癥因子 Caspase-1 的釋放，符合 NLRP3 炎癥小體信號通路參與炎癥反應過程的特點。由于我們在轉染過程中未檢測細胞的存活及凋亡，也不除外轉染后一部分新生細胞在經過促炎劑誘導而產生炎癥因子，但是對轉染后的沉默基因組和質粒陰性對照組再次給予促炎劑誘導后檢測 NLRP3、Caspase-1 的表達差異明顯，說明了沉默 NLRP3 基因表達進而抑制炎癥因子產生的效果顯著。
本實驗在這一步得出的結論與相關文獻報道的相似研究得出的結論類似。李鈺婷等[20]對野生型 C57BL/6 小鼠和 NLRP3 基因敲除小鼠先后給予 Triton-WR1339、芹菜素灌胃處理后，發現基因敲除小鼠給予芹菜素后血清生化指標總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均明顯降低，高密度脂蛋白明顯升高；而 NLRP3 炎癥小體的相關炎性指標 IL-1β、IL-6 也顯著降低，說明 NLRP3 炎癥小體能夠干預芹菜素的降脂療效。薛鴻等[21]對人肺動脈內皮細胞給予沉默 NLRP3 基因表達后，加用香煙煙霧提取物誘導內皮細胞的凋亡發現，其細胞存活率較未給予沉默基因表達的陰性對照組明顯增加；對人肺動脈內皮細胞給予香煙煙霧提取物，再加用乙酰半胱氨酸處理后發現，與未加用乙酰半胱氨酸處理的細胞相比，其炎癥因子 NLRP3、Caspase-1 的表達明顯下降。即這一提取物能夠導致人肺動脈內皮細胞發生凋亡并產生炎癥，經過沉默 NLRP3 基因的表達，或是給予乙酰半胱氨酸處理后這種損傷作用可進一步減輕。
總之，我們的實驗結果進一步證實促炎劑 LPS+ATP 共同誘導能夠促進大鼠 BMEC 中 NLRP3 炎癥小體和下游炎癥因子 Caspase-1 的釋放；沉默 NLRP3 基因表達能夠降低大鼠 BMEC 經促炎劑 LPS+ATP 誘導產生 NLRP3 炎癥小體及下游炎癥因子 Caspase-1。NLRP3 炎癥小體信號通路可能在大鼠 BMEC 經促炎劑作用形成的 CSVD 細胞模型中發揮作用。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
