近年來，3D 打印技術作為一種新型的材料加工技術，可以精確控制生物支架的宏觀及微觀結構，在制造結構復雜的骨修復支架方面具有傳統制造方法無法比擬的優勢。鎂離子是人體重要的微量元素之一，參與著機體眾多生理活動，對維持生物體正常生理運轉有著十分重要的作用。此外，鎂離子還具備促進成骨細胞分泌成骨相關蛋白以及間充質干細胞成骨分化等特點。通過與 3D 打印技術結合，越來越多的個性化鎂基生物支架被制作出來并應用于體內外骨再生研究之中。因此，該文對 3D 打印鎂基生物材料在骨再生修復領域的應用與研究進展作一綜述。
引用本文： 邢飛, 江家寶, 王杰, 盛寧, 劉明. 3D 打印鎂基生物支架在骨再生領域的應用與研究進展. 華西醫學, 2023, 38(5): 770-776. doi: 10.7507/1002-0179.202112138 復制
對于由外傷、腫瘤、感染、遺傳等原因導致的骨組織缺損的治療一直是臨床骨科醫生需要面對的一個治療難題[1]。目前，臨床上對骨缺損常用的治療方式主要包括自體骨移植、同種異體骨移植、骨搬運，但這些治療方式存在取材有限、潛在免疫排斥、多次手術創傷、治療周期久、取骨區域疼痛及感染等不足[2]。此外，骨缺損部位及大小形狀差異巨大，傳統方法制造出的支架無法針對不同的缺損情況進行個性化定制。近年來，3D 打印技術作為一種新型的材料加工技術，可以精確控制生物支架的宏觀及微觀結構，在制造結構復雜的骨修復支架方面具有傳統制造方法無法比擬的優勢[3]。鎂離子是人體重要的微量元素之一，參與著機體眾多生理活動，對維持生物體正常生理運轉有著十分重要的作用。此外，鎂離子還具備促進成骨細胞分泌成骨相關蛋白以及間充質干細胞成骨分化等特點。通過與 3D 打印技術結合，越來越多的個性化鎂基生物支架被制作出來并應用于體內外骨再生研究之中。因此，本文對 3D 打印鎂基生物材料在骨再生修復領域的應用與研究進展作一綜述。
1 鎂離子的生物學作用
鎂離子是機體中位列第 4 的陽離子，其中 65%的鎂離子在骨骼中礦化沉積，32%的鎂離子可以與核酸和蛋白質結合，其余的鎂離子與血漿結合在體內均勻分布[4]。鎂離子參與了包括能量代謝以及蛋白質合成等多種不同的生理反應，是維持生物體各系統正常運轉的重要離子之一[4-5]。作為一種天然的鈣拮抗劑，鎂離子在骨組織中的再生修復作用近年來逐漸受到研究者的關注[6]。
1.1 鎂離子促進骨再生
鎂是骨骼發育和礦化所必需的元素，通過激活相關信號通路直接參與骨組織形成。此外，鎂離子可以促進間充質干細胞向成骨細胞分化，同時促進局部微環境中羥基磷灰石（hydroxyapatite, HA）晶體的形成與沉積[7]。Liu 等[8]構建了一種搭載鎂離子的聚乙二醇復合水凝膠體系，發現了水凝膠中的鎂離子可以通過磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/糖原合成酶激酶 3β/β-連環蛋白信號通路有效上調成骨特異性轉錄因子（runt-related transcription factor 2, Runx2）、Ⅰ型膠原（collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）和骨保護素等成骨相關基因的表達；該研究還發現水凝膠中的鎂離子可以有效促進骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSC）體外增殖。Díaz-Tocados 等[9]還發現鎂離子可以激活 Notch 信號通路促進大鼠 BMSC 向成骨細胞分化，同時促進 Runx2 等成骨相關基因蛋白的表達。Zhang 等[10]證實了鎂離子可以有效募集成骨細胞，還可以通過激活 TRPM7/PI3K 信號通路加速細胞外鈣鹽沉積。Hung 等[11]發現并證實了鎂金屬骨板可以有效促進兔尺骨骨折區域的新生骨形成，其進一步研究發現鎂離子可以通過抑制β-連環蛋白的胞內降解來調控 BMSC 的成骨分化。
鎂離子不但可以直接促進成骨細胞的成骨能力，還可以通過一系列的免疫調節過程間接促進成骨。破骨細胞起源于單核-巨噬細胞系統，是一類具有骨質吸收功能的細胞，鎂離子則可通過抑制破骨細胞間接達到促進成骨的作用[12]。Zhai 等[13]在體外研究了不同鎂離子濃度對破骨細胞的影響，結果發現鎂離子可以通過延緩核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）的降解和 NF-κB 核易位效應從而顯著抑制 NF-κB 信號通路的激活，進而實現抑制破骨細胞的形成。活化的巨噬細胞可分為促進炎癥的 M1 表型和抑制炎癥 M2 表型，在骨折愈合過程中 M2 表型巨噬細胞可改善骨折部位的炎癥反應，促進新生骨痂的形成，對骨折的早期愈合有重要作用[14]。Tan 等[15]構建了一種含金屬鎂微球的可注射骨水泥，體外研究發現鎂離子的加入可顯著增強小鼠單核巨噬細胞白血病細胞 264.7（mouse leukemia cells of monocyte macrophage 264.7, RAW 264.7）的活性以及 M2 型巨噬細胞的細胞比例。此外，該研究還發現鎂離子可以有效促進 RAW 264.7 細胞與小鼠 BMSC 共培養體系中 Col-1、Runx2 等成骨基因的表達。
鎂離子還可以通過調控體內的激素及多肽類物質的產生或活化進而調控骨組織的形成。甲狀旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）和 1, 25-二羥維生素 D3 等鈣離子調節因子在骨組織代謝中具有重大意義，維生素 D 分別在肝臟和腎臟進行 25-羥基化和 1α-羥基化代謝形成具有生物活性的 1, 25-二羥維生素 D3 是一個依賴鎂的過程，缺鎂會導致機體 1, 25-二羥維生素 D3 水平降低和 PTH 反應受損[16]。Sahota 等[17]在一項前瞻性臨床試驗中證明了骨質疏松合并低維生素 D 及低 PTH 的特殊人群，口服鎂劑可以有效增加患者維生素 D 及 PTH 水平，血清Col-Ⅰ交聯 C 端肽和Ⅰ型原膠原氨基末端前肽等骨轉換標志物升高，患者骨量明顯增加。骨膜是富含感覺神經的結締組織包膜，在骨折愈合過程中，這些感覺神經元末梢能夠分泌與成骨相關的神經肽促進成骨，降鈣素基因相關肽（calcitonin-gene related peptide, CGRP）是其中重要的骨代謝肽之一[18]。研究發現在大鼠股骨遠端植入一純鎂針可以明顯地刺激大量新生骨并伴隨著 CGRP 的大量增加，為了探索 CGRP 與骨再生之間的關系，通過破壞局部的骨膜及感覺神經或在體內敲除 CGRP 受體的基因后，可觀察到新生骨量的明顯減少，該研究證明了鎂離子可通過刺激 CGRP 的產生進而影響成骨[19]。
1.2 鎂離子促進血管化
骨骼是一類高度血管化的組織，在血管網絡發育良好的情況下，間充質干細胞才能分化為骨細胞，促進礦鹽沉積最終形成新生骨，這一過程需要血管的長入提供氧氣供應及排出代謝廢物[20]。此外，骨的生長發育包括膜內成骨和軟骨內成骨兩種方式。在軟骨內成骨的過程中，間充質祖細胞聚集并分化為軟骨細胞，在各種促血管生成因子的刺激下伴隨著新生血管的生長，軟骨組織逐漸被骨組織所取代，是一種先天性血管化骨的形式[21]。因此，在骨修復領域新生血管生長的速度影響著骨缺損的修復效率。而鎂離子能夠有效地促進血管內皮細胞聚集及相關成血管基因表達，在血管化骨的構建中具備良好的應用前景。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）被認為是促進血管形成最關鍵的信號蛋白，是胚胎發生過程中生理血管形成的重要調節因子[22]。內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）能夠調節血管內皮功能[23]。已有研究證實鎂離子能夠刺激人臍靜脈內皮細胞（human umblical vein endothelial cells, HUVEC）中 VEGF 和 eNOS 基因表達增加，促進血管形成[24]。Liu 等[25]證明了鎂離子不僅可以直接促進 HUVEC 增殖，還可以刺激小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（mouse embryonic osteoblast precursor somatic cell cells-E1, MC3T3-E1）分泌血小板衍生生長因子，有效地促進 HUVEC 的血管生成能力。Hamushan 等[26]發現鎂離子可以通過缺氧誘導因子-1/VEGF 信號通路促進血管再生，并在大鼠牽張成骨模型中植入高純度鎂針，經組織學分析證實植入部位新生血管較不銹鋼植入組明顯增加。Lin 等[27]發現鎂離子還可以通過結合細胞膜上鎂離子轉運蛋白 1，進而促進血管內皮細胞遷移促進新生血管形成。
1.3 鎂離子的抗感染
在臨床中使用各種類型植入物治療相關疾病時，感染是一種較為常見但卻難以治療的并發癥，尤其是部分開放性骨折患者[28]。傳統的治療方法包括反復清創、抗菌藥物的應用和抗菌藥物骨水泥的使用。但這些治療方法存在手術周期長、治療費用高等不足。鎂金屬在體內降解的過程中會在其周圍產生堿性環境，這種環境具有廣譜殺菌能力[29-30]。Ma 等[30]制備了鎂基支架并對其抗菌機制進行了研究，發現與對照組相比含鎂支架可以有效地降低金黃色葡萄球菌的黏附，且能抑制金黃色葡萄球菌定植時產生的由多糖-蛋白質復合物構成的生物膜。Xie 等[29]在體外研究中證明鎂基植入物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗感染率分別為 90.1%和 92.1%，并在兔模型中驗證了鎂基植入物可以有效預防耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導的相關感染。Noori 等[31]將納米氧化鎂離子加入傳統玻璃離子體水泥中進行抗菌能力的實驗，證明了氧化鎂離子能對變形鏈球菌和遠緣鏈球菌產生良好的抗菌活性并能減少細菌生物膜的產生。鎂基生物材料能在降解過程中提供局部的堿性環境，可有效減少細菌黏附及細菌生物膜的形成，能夠有效預防植入物相關感染，但抑制效果與鎂離子濃度的相關性及具體抑制機制有待進一步研究。
2 3D 打印技術
3D 打印技術又稱為增材制造，是一種與計算機輔助設計相結合的制造物體復雜三維結構的技術[32]。因其能夠根據不同類型的缺損部位精細化控制支架的幾何形態、孔徑率、孔徑相連率和各種類型的細胞、生長因子、藥物和生物材料的分布，在器官和組織修復應用方面展現出巨大的前景[33]。3D 打印技術可按制造方式的不同分為粉末床熔合、定向能量沉積、薄片疊層、黏合劑噴射和材料擠壓 5 種技術，在組織工程領域常用粉末床熔合、黏合劑噴射及材料擠壓技術制備生物支架[34]。粉末床熔合是指在使用激光或電子束選擇性熔化金屬粉末，通過不同層面的燒結熔化來實現立體結構，常用于金屬支架的制備，但制備過程中局部溫度過高，容易導致材料產生裂紋，選擇性激光熔化是目前最常用的一種粉末床熔合技術[35]。黏合劑噴射原理與粉末床熔合相似，但不是利用熱能來熔合粉末原料，而是將黏合劑液體涂在粉末制備所需結構，通常需要后續熱處理去除黏合劑[34]。材料擠壓是目前組織工程領域中使用最廣泛的 3D 打印技術，通過一個或多個噴嘴擠壓出原材料形成三維結構，操作簡便易于控制，但打印分辨率依賴于噴嘴直徑及材料粒徑[36]。在科技不斷發展的過程中，已有不少學者通過不同類型 3D 打印技術將鎂與不同類型的材料混合制造出性能更全面的鎂基生物支架，且在體內或體外實驗中展現出了優異的成骨表現，是一類非常有前景的生物可降解材料。
3 3D 打印鎂基生物支架在骨組織工程的應用
3.1 無機材料
在組織修復工程領域，各種類型的無機材料，如 HA、β-磷酸三鈣（β-triphosphate, β-TCP）和硅酸鈣（calcium silicate, CSi）等生物陶瓷因具有與正常骨組織相仿的礦物成分的優點廣泛應用與骨再生修復領域。在上述生物陶瓷的基礎上加入鎂離子可以有效地增加支架的成骨誘導性能。研究表明將鎂與β-TCP 混合通過基于擠壓的低溫 3D 打印技術制造不同質量分數的含鎂支架，該支架的孔徑率約 400 μm，孔隙率均在 60%～70%，抗壓強度與正常松質骨相似，能夠滿足細胞遷移及營養交換的需求；同時在支架提取物中培養人 BMSC 和 HUVEC 中發現含鎂支架組能夠有效地刺激細胞增殖及細胞活力，增加 Runx-2、ALP、Col-1 等成骨相關基因和因 VEGF、eNOS 等成血管相關基因的表達，但隨著支架中含鎂量增加，鎂質量分數為 4%支架組會對細胞活性產生抑制作用[24]。Chen 等[37]通過仿生礦化的方法制備了鎂取代 HA 中部分鈣離子的新型復合材料，將新型復合材料與殼聚糖及明膠混合通過 3D 打印技術制備含鎂支架，他們在體外實驗中發現該支架具有互相連通的多孔結構并能緩慢釋放鎂離子，有效促進 MC3T3-E1 細胞黏附及增殖，促進 ALP、OCN 及 Col-1 等成骨基因表達，證明 3D 打印復合支架是骨修復領域良好的備選材料。此外，以 CSi 為代表性的硅酸鹽生物陶瓷作為一類新的生物材料，因其能在模擬體液的環境中顯示出優異的磷灰石礦化作用，并且在溶解過程中的離子產物已被證明可以增強干細胞的增殖、成骨分化和基因表達[38]。Tsai 等[39]使用激光粉末床融合技術制備了由含鎂 CSi 包裹的鈦支架，相較于純鈦組此類支架由于含鎂 CSi 的加入具有良好的親水性，可以更好的促進間充質干細胞黏附及增殖，細胞分泌 ALP 及HA含量顯著提高；體內實驗表明該支架可以有效促進兔股骨缺損模型中的骨骼再生。
3.2 有機材料
聚乳酸、聚已內酯（polycaprolactone, PCL）、聚乳酸-羥基乙醇酸（polylactic-co-glycolic acid, PLGA）等高分子有機材料因價格低廉，且具有良好的生物相容性和形態可控性，常被用于制造各種復雜結構的支架，但往往其因太過靈活導致機械強度不足，而且大多數有機材料為疏水性材料，細胞黏附性差，不利于骨組織再生，需通過調整組成聚合物的比例或添加新的聚合物來實現理想支架的特性[40-41]。Zhao 等[7]通過熔融混合技術制備了不同質量分數的圓餅型含鎂 PCL 支架，分為單純 PCL、含 5%鎂/PCL 復合支架、含 10%鎂/PCL 復合支架、含 15%鎂/PCL 復合支架 4 組，他們通過與大鼠 BMSC 培養發現相較于單純 PCL 組，含鎂支架組均擁有良好的細胞黏附性、組織相容性及成骨分化能力，且含 10%鎂/PCL 復合支架組誘導 BMSC 成骨分化能力最強；于是進一步在大鼠顱骨缺損模型中植入該組支架進行體內實驗，結果表明能有效地促進早期和晚期骨形成，同時在植入 12 周后抽取血液樣本，顯示該支架不會造成腎或肝損傷，各器官組織學分析未見任何實質性損傷，是一種安全有效地骨修復支架材料。此外，Dong 等[42]創新性開發了基于融熔沉積法制造的含鎂 PCL 支架，這種可降解的無細胞支架具有均一的孔隙率、合適的彈性模量和良好的綜合性能；由于鎂在支架中的均勻分布，不僅增加了支架表面的親水性，促進了HA沉積，同時鎂在降解的過程中局部形成的堿性環境加速了 PCL 的降解速率，改善了 PCL 支架在體內難以降解的問題；在大白兔脛骨結節處制作了直徑 6 mm、深度 4.5 mm 的骨缺損模型，含鎂支架在植入 12 周后缺損部位完全愈合，相較于純 PCL 支架擁有更好的新生骨形成能力。也有學者使用基于擠壓的低溫快速成形技術將 PLGA 與鎂相結合制備多孔支架，通過鎂的加入能夠有效地解決 PLGA 機械強度不足及降解過程中酸性副產物的問題，證明了含鎂 PLGA 支架能夠導致局部 pH 值升高，能夠抑制細菌生長及生物膜的形成，且鎂含量越高抑制作用越強[43]。
3.3 復合材料
隨著組織工程技術的不斷發展，將部分有機材料與無機材料相混合制備出具有理想性能的復合支架是目前一大趨勢，此類支架既可結合 PCL、PLGA 等有機材料的價格低廉、生產方便等優點，又可結合生物陶瓷等無機材料骨誘導性及傳導性等優點而被廣泛研究[41]。Petretta 等[44]首次通過精確擠壓沉積技術將 PCL 與新型含鎂的生物玻璃混合制作出了一種復合支架，并在體外進行了微觀形態，納米壓痕以及生物相容性測試，他們的研究得出由 PCL 與含鎂生物玻璃進行 1∶1 混合時制成的復合支架表面分布均勻，具有合適的粗糙度適合細胞黏附，與純 PCL 支架相比，該支架的物理性能更接近正常骨組織，且由于鎂離子的加入該支架在模擬體液溶液中，具有更好的生物活性及生物相容性。國內學者將不同濃度的鎂加入到 PLGA/β-TCP 體系中，利用基于擠壓的低溫快速成型技術制備濃度為 5、10、15wt%的多孔含鎂 PLGA/β-TCP 復合支架，分別標記為 PT5M、PT10M、PT15M 及對照 PT 組，該支架體系的設計理念是將β-TCP 良好剛度及骨傳導的特性與 PLGA 優異的柔韌性相結合，通過鎂的引入增強支架的抗感染性能，同時 PLGA 降解過程中產生的酸性環境可以被β-TCP 及鎂降解的堿性環境所中和；體外實驗表明與對照 PT 組相比，其他組均可顯著降低細菌黏附，防止生物膜的形成，保護種植體免受細菌污染，對新骨形成有促進作用，且 PT10M 和 PT15M 的抗生物膜能力明顯強于 PT5M，但在細胞形容性實驗中 PT15M 組不利于 MC3T3-E1 細胞的黏附及增殖，從抑菌活性劑細胞相容性角度而言，PT10M 組的含鎂支架是最合適的[30]。Lai 等[45]使用相同方法相同材料 3D 打印出了含鎂 PLGA/β-TCP 支架，他們在體外研究了該支架的物理特性，并將支架植入激素相關骨壞死的兔子模型中來評估其成骨、成血管及生物安全性。研究表明含鎂復合支架具有與骨小梁相似的結構及彈性模量，植入兔子模型 12 周后可觀察到大量的新生骨形成，且隨著時間推移新骨形成與支架降解速度相匹配，含鎂支架組平均骨體積比純 PLGA/β-TCP 對照組多 56.3%；動態增強MRI成像和微 CT 血管造影結果顯示，含鎂支架組可增加血液灌注，促進新血管生長，植入 8 周后可觀察到大量結構完整的新生血管。而且植入兔子體內后未引起血清鎂的波動，植入部位及主要器官功能未見異常改變。鎂基復合材料支架在體外及體內實驗中均能夠有效地促進成骨、成血管及抗感染能力。由于鎂的加入改變了原有材料機械性能不足，生物誘導活性差等缺點，為新生血管的長入及鈣鹽的沉積提供了條件。這種類型的支架安全有效、具有廣闊的臨床應用前景。
3.4 合金材料
金屬鎂作為一種新興的金屬植入材料，具有與骨皮質相接近的彈性模量、可降解性、良好的生物誘導性及抗菌性備受關注，是一種很有前途的骨再生材[45]。相較于傳統的鈦合金或不銹鋼合金制造的骨科植入物能有效地減少因彈性模量太高引起的應力屏障，且能避免植入物遠期相關并發癥及二次手術。但鎂作為一種活性金屬，植入體內后會快速降解導致機械強度急劇下降，而且降解的過程中會伴隨大量氫氣的釋放導致局部炎癥反應，限制了其在骨組織工程的應用[46]。
由鎂合金材料制備的生物材料因具有完全可將降解性及生物相容性等特點，可以有效地減少植入物相關遠期并發癥的發生，迄今為止已有少量鎂合金螺釘和支架在臨床上正式用于治療骨科及心內科相關疾病[47]。但由于鎂具有高度易氧化的化學特性，特別是應用于 3D 打印時需制成粉末狀或線狀，增加了與空氣中氧氣的反應導致燃燒的風險[47]，因此使用 3D 打印技術制造在生物可降解鎂合金植入物仍有一定的挑戰性和危險性，僅有少量學者進行了這方面的研究。Wang 等[48]首次成功合成了新型鎂合金粉末，使用優化參數后的選擇性激光熔化技術制備了模仿松質骨的仿生結構、鉆石菱形結構和螺旋結構 3 種多孔鎂合金支架。在體外進行了力學性能及降解性的檢測實驗中發現，螺旋結構的鎂合金支架具有良好的耐腐蝕性及最好的力學性能，與人體松質骨相似，能夠滿足組織工程支架的基本要求，但未進行相應的體內實驗。隨后，Xie 等[29]使用相同技術制備了孔徑為（324.6±25.7）μm 具有合適力學性能的多孔鎂合金支架，在體外與 MC3T3-E1 和 RAW267.4 細胞培養中表現出了良好的成骨誘導性及細胞相容性；將該支架植入兔股骨缺損模型中，術后 4 周與鈦植入組相比，該支架能有效阻止植入物相關骨髓炎、骨破壞和骨膜反應的發生，吉姆薩染色僅可見少量菌落，證明該支架可以增強巨噬細胞的吞噬能力，有效預防細菌相關感染，具有良好的生物相容性，是具有潛力的骨科植入體。
4 小結
鎂具備促進成骨、成血管以及抗感染等多種生物學特性。作為近些年骨再生修復領域的熱點之一，3D 打印鎂基生物支架開始廣泛的應用于多種不同的骨再生環境之中，并展現了良好的體內外骨再生能力。3D 打印鎂基生物支架既可以具備鎂離子的生物學特性，還可以與陶瓷、高分子等成分混合用于改進原有支架的理化性質，展現出了優異的臨床應用前景。鎂合金在降解過程中會釋放氫氣，而過量的氫氣可能會一定程度上抑制骨組織的愈合，如何通過調控鎂合金的降解速度進而降低氫氣的釋放仍是目前的研究難點。通過對鎂合金支架進行表面功能化涂層可以降低鎂合金支架的腐蝕速率，進而降低鎂合金植入物體內早期機械損失。富含生物活性因子的生物涂層還可以賦予鎂合金支架抗菌、抗腫瘤等特殊生物學功能。稀土元素的引入同樣可以調控鎂合金支架的體內降解速率。
雖然鎂合金骨修復螺釘開始逐漸被應用于臨床前期研究之中，但 3D 打印構建的個性化鎂合金支架目前未被應用于臨床前期研究之中。制定關于 3D 打印鎂合金支架的臨床應用標準以及適應證仍需開發者與臨床醫生進一步研究確認。盡管鎂合金材料在骨科領域展現了巨大的應用潛力，但受限于鎂自身具備的高氧親和力、低沸點的固有特性，鎂合金的 3D 打印仍充滿挑戰。設計不同孔隙結構以及拓撲形貌的 3D 打印鎂合金植入物可以實現對不同部位骨折的個性化精準修復。目前仍無研究報道鎂合金的體內長期植入結果，關于鎂合金在體內的長期轉歸仍需進一步研究。此外，如何優化 3D 打印技術的具體參數，精細控制鎂基支架中鎂離子的穩定釋放及鎂離子最佳濃度方面仍待進一步研究。
作者貢獻：邢飛、江家寶負責綜述構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改；劉明負責綜述立題、構思建議，文章初稿修改；王杰、盛寧對綜述構思提出建議。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
對于由外傷、腫瘤、感染、遺傳等原因導致的骨組織缺損的治療一直是臨床骨科醫生需要面對的一個治療難題[1]。目前，臨床上對骨缺損常用的治療方式主要包括自體骨移植、同種異體骨移植、骨搬運，但這些治療方式存在取材有限、潛在免疫排斥、多次手術創傷、治療周期久、取骨區域疼痛及感染等不足[2]。此外，骨缺損部位及大小形狀差異巨大，傳統方法制造出的支架無法針對不同的缺損情況進行個性化定制。近年來，3D 打印技術作為一種新型的材料加工技術，可以精確控制生物支架的宏觀及微觀結構，在制造結構復雜的骨修復支架方面具有傳統制造方法無法比擬的優勢[3]。鎂離子是人體重要的微量元素之一，參與著機體眾多生理活動，對維持生物體正常生理運轉有著十分重要的作用。此外，鎂離子還具備促進成骨細胞分泌成骨相關蛋白以及間充質干細胞成骨分化等特點。通過與 3D 打印技術結合，越來越多的個性化鎂基生物支架被制作出來并應用于體內外骨再生研究之中。因此，本文對 3D 打印鎂基生物材料在骨再生修復領域的應用與研究進展作一綜述。
1 鎂離子的生物學作用
鎂離子是機體中位列第 4 的陽離子，其中 65%的鎂離子在骨骼中礦化沉積，32%的鎂離子可以與核酸和蛋白質結合，其余的鎂離子與血漿結合在體內均勻分布[4]。鎂離子參與了包括能量代謝以及蛋白質合成等多種不同的生理反應，是維持生物體各系統正常運轉的重要離子之一[4-5]。作為一種天然的鈣拮抗劑，鎂離子在骨組織中的再生修復作用近年來逐漸受到研究者的關注[6]。
1.1 鎂離子促進骨再生
鎂是骨骼發育和礦化所必需的元素，通過激活相關信號通路直接參與骨組織形成。此外，鎂離子可以促進間充質干細胞向成骨細胞分化，同時促進局部微環境中羥基磷灰石（hydroxyapatite, HA）晶體的形成與沉積[7]。Liu 等[8]構建了一種搭載鎂離子的聚乙二醇復合水凝膠體系，發現了水凝膠中的鎂離子可以通過磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/糖原合成酶激酶 3β/β-連環蛋白信號通路有效上調成骨特異性轉錄因子（runt-related transcription factor 2, Runx2）、Ⅰ型膠原（collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）和骨保護素等成骨相關基因的表達；該研究還發現水凝膠中的鎂離子可以有效促進骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSC）體外增殖。Díaz-Tocados 等[9]還發現鎂離子可以激活 Notch 信號通路促進大鼠 BMSC 向成骨細胞分化，同時促進 Runx2 等成骨相關基因蛋白的表達。Zhang 等[10]證實了鎂離子可以有效募集成骨細胞，還可以通過激活 TRPM7/PI3K 信號通路加速細胞外鈣鹽沉積。Hung 等[11]發現并證實了鎂金屬骨板可以有效促進兔尺骨骨折區域的新生骨形成，其進一步研究發現鎂離子可以通過抑制β-連環蛋白的胞內降解來調控 BMSC 的成骨分化。
鎂離子不但可以直接促進成骨細胞的成骨能力，還可以通過一系列的免疫調節過程間接促進成骨。破骨細胞起源于單核-巨噬細胞系統，是一類具有骨質吸收功能的細胞，鎂離子則可通過抑制破骨細胞間接達到促進成骨的作用[12]。Zhai 等[13]在體外研究了不同鎂離子濃度對破骨細胞的影響，結果發現鎂離子可以通過延緩核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）的降解和 NF-κB 核易位效應從而顯著抑制 NF-κB 信號通路的激活，進而實現抑制破骨細胞的形成。活化的巨噬細胞可分為促進炎癥的 M1 表型和抑制炎癥 M2 表型，在骨折愈合過程中 M2 表型巨噬細胞可改善骨折部位的炎癥反應，促進新生骨痂的形成，對骨折的早期愈合有重要作用[14]。Tan 等[15]構建了一種含金屬鎂微球的可注射骨水泥，體外研究發現鎂離子的加入可顯著增強小鼠單核巨噬細胞白血病細胞 264.7（mouse leukemia cells of monocyte macrophage 264.7, RAW 264.7）的活性以及 M2 型巨噬細胞的細胞比例。此外，該研究還發現鎂離子可以有效促進 RAW 264.7 細胞與小鼠 BMSC 共培養體系中 Col-1、Runx2 等成骨基因的表達。
鎂離子還可以通過調控體內的激素及多肽類物質的產生或活化進而調控骨組織的形成。甲狀旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）和 1, 25-二羥維生素 D3 等鈣離子調節因子在骨組織代謝中具有重大意義，維生素 D 分別在肝臟和腎臟進行 25-羥基化和 1α-羥基化代謝形成具有生物活性的 1, 25-二羥維生素 D3 是一個依賴鎂的過程，缺鎂會導致機體 1, 25-二羥維生素 D3 水平降低和 PTH 反應受損[16]。Sahota 等[17]在一項前瞻性臨床試驗中證明了骨質疏松合并低維生素 D 及低 PTH 的特殊人群，口服鎂劑可以有效增加患者維生素 D 及 PTH 水平，血清Col-Ⅰ交聯 C 端肽和Ⅰ型原膠原氨基末端前肽等骨轉換標志物升高，患者骨量明顯增加。骨膜是富含感覺神經的結締組織包膜，在骨折愈合過程中，這些感覺神經元末梢能夠分泌與成骨相關的神經肽促進成骨，降鈣素基因相關肽（calcitonin-gene related peptide, CGRP）是其中重要的骨代謝肽之一[18]。研究發現在大鼠股骨遠端植入一純鎂針可以明顯地刺激大量新生骨并伴隨著 CGRP 的大量增加，為了探索 CGRP 與骨再生之間的關系，通過破壞局部的骨膜及感覺神經或在體內敲除 CGRP 受體的基因后，可觀察到新生骨量的明顯減少，該研究證明了鎂離子可通過刺激 CGRP 的產生進而影響成骨[19]。
1.2 鎂離子促進血管化
骨骼是一類高度血管化的組織，在血管網絡發育良好的情況下，間充質干細胞才能分化為骨細胞，促進礦鹽沉積最終形成新生骨，這一過程需要血管的長入提供氧氣供應及排出代謝廢物[20]。此外，骨的生長發育包括膜內成骨和軟骨內成骨兩種方式。在軟骨內成骨的過程中，間充質祖細胞聚集并分化為軟骨細胞，在各種促血管生成因子的刺激下伴隨著新生血管的生長，軟骨組織逐漸被骨組織所取代，是一種先天性血管化骨的形式[21]。因此，在骨修復領域新生血管生長的速度影響著骨缺損的修復效率。而鎂離子能夠有效地促進血管內皮細胞聚集及相關成血管基因表達，在血管化骨的構建中具備良好的應用前景。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）被認為是促進血管形成最關鍵的信號蛋白，是胚胎發生過程中生理血管形成的重要調節因子[22]。內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）能夠調節血管內皮功能[23]。已有研究證實鎂離子能夠刺激人臍靜脈內皮細胞（human umblical vein endothelial cells, HUVEC）中 VEGF 和 eNOS 基因表達增加，促進血管形成[24]。Liu 等[25]證明了鎂離子不僅可以直接促進 HUVEC 增殖，還可以刺激小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（mouse embryonic osteoblast precursor somatic cell cells-E1, MC3T3-E1）分泌血小板衍生生長因子，有效地促進 HUVEC 的血管生成能力。Hamushan 等[26]發現鎂離子可以通過缺氧誘導因子-1/VEGF 信號通路促進血管再生，并在大鼠牽張成骨模型中植入高純度鎂針，經組織學分析證實植入部位新生血管較不銹鋼植入組明顯增加。Lin 等[27]發現鎂離子還可以通過結合細胞膜上鎂離子轉運蛋白 1，進而促進血管內皮細胞遷移促進新生血管形成。
1.3 鎂離子的抗感染
在臨床中使用各種類型植入物治療相關疾病時，感染是一種較為常見但卻難以治療的并發癥，尤其是部分開放性骨折患者[28]。傳統的治療方法包括反復清創、抗菌藥物的應用和抗菌藥物骨水泥的使用。但這些治療方法存在手術周期長、治療費用高等不足。鎂金屬在體內降解的過程中會在其周圍產生堿性環境，這種環境具有廣譜殺菌能力[29-30]。Ma 等[30]制備了鎂基支架并對其抗菌機制進行了研究，發現與對照組相比含鎂支架可以有效地降低金黃色葡萄球菌的黏附，且能抑制金黃色葡萄球菌定植時產生的由多糖-蛋白質復合物構成的生物膜。Xie 等[29]在體外研究中證明鎂基植入物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗感染率分別為 90.1%和 92.1%，并在兔模型中驗證了鎂基植入物可以有效預防耐甲氧西林金黃色葡萄球菌誘導的相關感染。Noori 等[31]將納米氧化鎂離子加入傳統玻璃離子體水泥中進行抗菌能力的實驗，證明了氧化鎂離子能對變形鏈球菌和遠緣鏈球菌產生良好的抗菌活性并能減少細菌生物膜的產生。鎂基生物材料能在降解過程中提供局部的堿性環境，可有效減少細菌黏附及細菌生物膜的形成，能夠有效預防植入物相關感染，但抑制效果與鎂離子濃度的相關性及具體抑制機制有待進一步研究。
2 3D 打印技術
3D 打印技術又稱為增材制造，是一種與計算機輔助設計相結合的制造物體復雜三維結構的技術[32]。因其能夠根據不同類型的缺損部位精細化控制支架的幾何形態、孔徑率、孔徑相連率和各種類型的細胞、生長因子、藥物和生物材料的分布，在器官和組織修復應用方面展現出巨大的前景[33]。3D 打印技術可按制造方式的不同分為粉末床熔合、定向能量沉積、薄片疊層、黏合劑噴射和材料擠壓 5 種技術，在組織工程領域常用粉末床熔合、黏合劑噴射及材料擠壓技術制備生物支架[34]。粉末床熔合是指在使用激光或電子束選擇性熔化金屬粉末，通過不同層面的燒結熔化來實現立體結構，常用于金屬支架的制備，但制備過程中局部溫度過高，容易導致材料產生裂紋，選擇性激光熔化是目前最常用的一種粉末床熔合技術[35]。黏合劑噴射原理與粉末床熔合相似，但不是利用熱能來熔合粉末原料，而是將黏合劑液體涂在粉末制備所需結構，通常需要后續熱處理去除黏合劑[34]。材料擠壓是目前組織工程領域中使用最廣泛的 3D 打印技術，通過一個或多個噴嘴擠壓出原材料形成三維結構，操作簡便易于控制，但打印分辨率依賴于噴嘴直徑及材料粒徑[36]。在科技不斷發展的過程中，已有不少學者通過不同類型 3D 打印技術將鎂與不同類型的材料混合制造出性能更全面的鎂基生物支架，且在體內或體外實驗中展現出了優異的成骨表現，是一類非常有前景的生物可降解材料。
3 3D 打印鎂基生物支架在骨組織工程的應用
3.1 無機材料
在組織修復工程領域，各種類型的無機材料，如 HA、β-磷酸三鈣（β-triphosphate, β-TCP）和硅酸鈣（calcium silicate, CSi）等生物陶瓷因具有與正常骨組織相仿的礦物成分的優點廣泛應用與骨再生修復領域。在上述生物陶瓷的基礎上加入鎂離子可以有效地增加支架的成骨誘導性能。研究表明將鎂與β-TCP 混合通過基于擠壓的低溫 3D 打印技術制造不同質量分數的含鎂支架，該支架的孔徑率約 400 μm，孔隙率均在 60%～70%，抗壓強度與正常松質骨相似，能夠滿足細胞遷移及營養交換的需求；同時在支架提取物中培養人 BMSC 和 HUVEC 中發現含鎂支架組能夠有效地刺激細胞增殖及細胞活力，增加 Runx-2、ALP、Col-1 等成骨相關基因和因 VEGF、eNOS 等成血管相關基因的表達，但隨著支架中含鎂量增加，鎂質量分數為 4%支架組會對細胞活性產生抑制作用[24]。Chen 等[37]通過仿生礦化的方法制備了鎂取代 HA 中部分鈣離子的新型復合材料，將新型復合材料與殼聚糖及明膠混合通過 3D 打印技術制備含鎂支架，他們在體外實驗中發現該支架具有互相連通的多孔結構并能緩慢釋放鎂離子，有效促進 MC3T3-E1 細胞黏附及增殖，促進 ALP、OCN 及 Col-1 等成骨基因表達，證明 3D 打印復合支架是骨修復領域良好的備選材料。此外，以 CSi 為代表性的硅酸鹽生物陶瓷作為一類新的生物材料，因其能在模擬體液的環境中顯示出優異的磷灰石礦化作用，并且在溶解過程中的離子產物已被證明可以增強干細胞的增殖、成骨分化和基因表達[38]。Tsai 等[39]使用激光粉末床融合技術制備了由含鎂 CSi 包裹的鈦支架，相較于純鈦組此類支架由于含鎂 CSi 的加入具有良好的親水性，可以更好的促進間充質干細胞黏附及增殖，細胞分泌 ALP 及HA含量顯著提高；體內實驗表明該支架可以有效促進兔股骨缺損模型中的骨骼再生。
3.2 有機材料
聚乳酸、聚已內酯（polycaprolactone, PCL）、聚乳酸-羥基乙醇酸（polylactic-co-glycolic acid, PLGA）等高分子有機材料因價格低廉，且具有良好的生物相容性和形態可控性，常被用于制造各種復雜結構的支架，但往往其因太過靈活導致機械強度不足，而且大多數有機材料為疏水性材料，細胞黏附性差，不利于骨組織再生，需通過調整組成聚合物的比例或添加新的聚合物來實現理想支架的特性[40-41]。Zhao 等[7]通過熔融混合技術制備了不同質量分數的圓餅型含鎂 PCL 支架，分為單純 PCL、含 5%鎂/PCL 復合支架、含 10%鎂/PCL 復合支架、含 15%鎂/PCL 復合支架 4 組，他們通過與大鼠 BMSC 培養發現相較于單純 PCL 組，含鎂支架組均擁有良好的細胞黏附性、組織相容性及成骨分化能力，且含 10%鎂/PCL 復合支架組誘導 BMSC 成骨分化能力最強；于是進一步在大鼠顱骨缺損模型中植入該組支架進行體內實驗，結果表明能有效地促進早期和晚期骨形成，同時在植入 12 周后抽取血液樣本，顯示該支架不會造成腎或肝損傷，各器官組織學分析未見任何實質性損傷，是一種安全有效地骨修復支架材料。此外，Dong 等[42]創新性開發了基于融熔沉積法制造的含鎂 PCL 支架，這種可降解的無細胞支架具有均一的孔隙率、合適的彈性模量和良好的綜合性能；由于鎂在支架中的均勻分布，不僅增加了支架表面的親水性，促進了HA沉積，同時鎂在降解的過程中局部形成的堿性環境加速了 PCL 的降解速率，改善了 PCL 支架在體內難以降解的問題；在大白兔脛骨結節處制作了直徑 6 mm、深度 4.5 mm 的骨缺損模型，含鎂支架在植入 12 周后缺損部位完全愈合，相較于純 PCL 支架擁有更好的新生骨形成能力。也有學者使用基于擠壓的低溫快速成形技術將 PLGA 與鎂相結合制備多孔支架，通過鎂的加入能夠有效地解決 PLGA 機械強度不足及降解過程中酸性副產物的問題，證明了含鎂 PLGA 支架能夠導致局部 pH 值升高，能夠抑制細菌生長及生物膜的形成，且鎂含量越高抑制作用越強[43]。
3.3 復合材料
隨著組織工程技術的不斷發展，將部分有機材料與無機材料相混合制備出具有理想性能的復合支架是目前一大趨勢，此類支架既可結合 PCL、PLGA 等有機材料的價格低廉、生產方便等優點，又可結合生物陶瓷等無機材料骨誘導性及傳導性等優點而被廣泛研究[41]。Petretta 等[44]首次通過精確擠壓沉積技術將 PCL 與新型含鎂的生物玻璃混合制作出了一種復合支架，并在體外進行了微觀形態，納米壓痕以及生物相容性測試，他們的研究得出由 PCL 與含鎂生物玻璃進行 1∶1 混合時制成的復合支架表面分布均勻，具有合適的粗糙度適合細胞黏附，與純 PCL 支架相比，該支架的物理性能更接近正常骨組織，且由于鎂離子的加入該支架在模擬體液溶液中，具有更好的生物活性及生物相容性。國內學者將不同濃度的鎂加入到 PLGA/β-TCP 體系中，利用基于擠壓的低溫快速成型技術制備濃度為 5、10、15wt%的多孔含鎂 PLGA/β-TCP 復合支架，分別標記為 PT5M、PT10M、PT15M 及對照 PT 組，該支架體系的設計理念是將β-TCP 良好剛度及骨傳導的特性與 PLGA 優異的柔韌性相結合，通過鎂的引入增強支架的抗感染性能，同時 PLGA 降解過程中產生的酸性環境可以被β-TCP 及鎂降解的堿性環境所中和；體外實驗表明與對照 PT 組相比，其他組均可顯著降低細菌黏附，防止生物膜的形成，保護種植體免受細菌污染，對新骨形成有促進作用，且 PT10M 和 PT15M 的抗生物膜能力明顯強于 PT5M，但在細胞形容性實驗中 PT15M 組不利于 MC3T3-E1 細胞的黏附及增殖，從抑菌活性劑細胞相容性角度而言，PT10M 組的含鎂支架是最合適的[30]。Lai 等[45]使用相同方法相同材料 3D 打印出了含鎂 PLGA/β-TCP 支架，他們在體外研究了該支架的物理特性，并將支架植入激素相關骨壞死的兔子模型中來評估其成骨、成血管及生物安全性。研究表明含鎂復合支架具有與骨小梁相似的結構及彈性模量，植入兔子模型 12 周后可觀察到大量的新生骨形成，且隨著時間推移新骨形成與支架降解速度相匹配，含鎂支架組平均骨體積比純 PLGA/β-TCP 對照組多 56.3%；動態增強MRI成像和微 CT 血管造影結果顯示，含鎂支架組可增加血液灌注，促進新血管生長，植入 8 周后可觀察到大量結構完整的新生血管。而且植入兔子體內后未引起血清鎂的波動，植入部位及主要器官功能未見異常改變。鎂基復合材料支架在體外及體內實驗中均能夠有效地促進成骨、成血管及抗感染能力。由于鎂的加入改變了原有材料機械性能不足，生物誘導活性差等缺點，為新生血管的長入及鈣鹽的沉積提供了條件。這種類型的支架安全有效、具有廣闊的臨床應用前景。
3.4 合金材料
金屬鎂作為一種新興的金屬植入材料，具有與骨皮質相接近的彈性模量、可降解性、良好的生物誘導性及抗菌性備受關注，是一種很有前途的骨再生材[45]。相較于傳統的鈦合金或不銹鋼合金制造的骨科植入物能有效地減少因彈性模量太高引起的應力屏障，且能避免植入物遠期相關并發癥及二次手術。但鎂作為一種活性金屬，植入體內后會快速降解導致機械強度急劇下降，而且降解的過程中會伴隨大量氫氣的釋放導致局部炎癥反應，限制了其在骨組織工程的應用[46]。
由鎂合金材料制備的生物材料因具有完全可將降解性及生物相容性等特點，可以有效地減少植入物相關遠期并發癥的發生，迄今為止已有少量鎂合金螺釘和支架在臨床上正式用于治療骨科及心內科相關疾病[47]。但由于鎂具有高度易氧化的化學特性，特別是應用于 3D 打印時需制成粉末狀或線狀，增加了與空氣中氧氣的反應導致燃燒的風險[47]，因此使用 3D 打印技術制造在生物可降解鎂合金植入物仍有一定的挑戰性和危險性，僅有少量學者進行了這方面的研究。Wang 等[48]首次成功合成了新型鎂合金粉末，使用優化參數后的選擇性激光熔化技術制備了模仿松質骨的仿生結構、鉆石菱形結構和螺旋結構 3 種多孔鎂合金支架。在體外進行了力學性能及降解性的檢測實驗中發現，螺旋結構的鎂合金支架具有良好的耐腐蝕性及最好的力學性能，與人體松質骨相似，能夠滿足組織工程支架的基本要求，但未進行相應的體內實驗。隨后，Xie 等[29]使用相同技術制備了孔徑為（324.6±25.7）μm 具有合適力學性能的多孔鎂合金支架，在體外與 MC3T3-E1 和 RAW267.4 細胞培養中表現出了良好的成骨誘導性及細胞相容性；將該支架植入兔股骨缺損模型中，術后 4 周與鈦植入組相比，該支架能有效阻止植入物相關骨髓炎、骨破壞和骨膜反應的發生，吉姆薩染色僅可見少量菌落，證明該支架可以增強巨噬細胞的吞噬能力，有效預防細菌相關感染，具有良好的生物相容性，是具有潛力的骨科植入體。
4 小結
鎂具備促進成骨、成血管以及抗感染等多種生物學特性。作為近些年骨再生修復領域的熱點之一，3D 打印鎂基生物支架開始廣泛的應用于多種不同的骨再生環境之中，并展現了良好的體內外骨再生能力。3D 打印鎂基生物支架既可以具備鎂離子的生物學特性，還可以與陶瓷、高分子等成分混合用于改進原有支架的理化性質，展現出了優異的臨床應用前景。鎂合金在降解過程中會釋放氫氣，而過量的氫氣可能會一定程度上抑制骨組織的愈合，如何通過調控鎂合金的降解速度進而降低氫氣的釋放仍是目前的研究難點。通過對鎂合金支架進行表面功能化涂層可以降低鎂合金支架的腐蝕速率，進而降低鎂合金植入物體內早期機械損失。富含生物活性因子的生物涂層還可以賦予鎂合金支架抗菌、抗腫瘤等特殊生物學功能。稀土元素的引入同樣可以調控鎂合金支架的體內降解速率。
雖然鎂合金骨修復螺釘開始逐漸被應用于臨床前期研究之中，但 3D 打印構建的個性化鎂合金支架目前未被應用于臨床前期研究之中。制定關于 3D 打印鎂合金支架的臨床應用標準以及適應證仍需開發者與臨床醫生進一步研究確認。盡管鎂合金材料在骨科領域展現了巨大的應用潛力，但受限于鎂自身具備的高氧親和力、低沸點的固有特性，鎂合金的 3D 打印仍充滿挑戰。設計不同孔隙結構以及拓撲形貌的 3D 打印鎂合金植入物可以實現對不同部位骨折的個性化精準修復。目前仍無研究報道鎂合金的體內長期植入結果，關于鎂合金在體內的長期轉歸仍需進一步研究。此外，如何優化 3D 打印技術的具體參數，精細控制鎂基支架中鎂離子的穩定釋放及鎂離子最佳濃度方面仍待進一步研究。
作者貢獻：邢飛、江家寶負責綜述構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改；劉明負責綜述立題、構思建議，文章初稿修改；王杰、盛寧對綜述構思提出建議。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。