骨組織再生與血管形成密不可分，如何實現骨替代材料的血管化是目前骨組織工程領域迫切需要解決的問題。骨的生長發育、礦化成熟、改造塑型和組織再生都基于優異的血管化網絡形成。近年來，越來越多的研究者通過水凝膠搭載不同細胞、細胞因子、金屬離子、小分子物質進行體外血管化構建并應用于骨再生之中。在此背景之下，該文對骨組織工程領域基于水凝膠的血管化策略進行綜述。
引用本文： 江家寶, 者漫, 邢飛, 羅榮, 陳釗, 黃富國, 項舟, 劉明. 骨組織工程領域基于水凝膠的血管化策略. 華西醫學, 2023, 38(4): 608-615. doi: 10.7507/1002-0179.202112137 復制
由外傷、腫瘤及感染等原因導致的大塊骨缺損是目前臨床治療的難點，傳統治療方法如骨移植、骨搬運等技術存在著供骨量有限、手術周期長、治療費用高等問題[1]。骨組織工程技術能夠制備具有良好骨誘導能力的骨替代材料治療骨缺損而備受關注[2]。但骨組織再生與血管形成密不可分，如何實現骨替代材料的血管化是目前骨組織工程領域迫切需要解決的問題[3]。骨是具有高度血管化的組織結構，其血流量占靜息心輸出量的 10%～15%，骨的生長發育、礦化成熟、改造塑型和組織再生都基于優異的血管化網絡形成[4]。生物體內正常的骨骼形成方式主要包括膜內成骨和軟骨內成骨，而這兩種成骨方式均需要成熟的血管化網絡來進行細胞傳送、氧氣及營養物質運輸、代謝廢物排出[5-7]。水凝膠是指一類由天然或合成聚合物通過物理或化學方式交聯形成的三維網狀結構，可以充分模擬細胞外基質，具備良好的生物相容性和生物可降解性。因此，基于水凝膠的血管化策略被認為是一種促進骨替代材料血管化的有效方法。近年來，越來越多的國內外研究者利用水凝膠搭載不同物質進行體外血管化構建并應用于骨再生之中。在此背景之下，本文對骨組織工程領域基于水凝膠的血管化策略進行綜述。
1 血管的形成
血管的形成主要包括血管生成和血管發芽兩種方式。血管生成被定義為胚胎發育過程中由中胚層和內胚層發育而來的血管內皮祖細胞或血管祖細胞分化為血管內皮細胞（endothelial cell, EC）逐漸形成原始血管網絡，是血管從無到有的過程；血管發芽是原有血管腔在一氧化氮和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的刺激下，血管腔擴張，基底膜局部降解，EC 向此處遷移隨分裂增殖成芽，芽與芽之間相互連接成環，形成新血管腔，隨后周細胞和平滑肌細胞包裹 EC 形成新的基底膜，局部血管網絡重建，是血管從少到多的過程[8]。血管形成是一個受多種細胞因子調控的復雜過程，目前研究表明 VEGF、堿性成纖維生長因子（fibroblast growth factor, bFGF）、血小板衍生生長因子、轉化生長因子 β、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）-2 和 BMP-7 細胞因子等能夠直接或間接刺激 EC 的增殖遷移和活化，促進新生血管的穩定與成熟[7, 9]。如今組織工程的血管化策略主要是通過植入物直接負載具有血管分化潛能的細胞、成血管相關細胞因子或者負載具有促血管生成特性的金屬離子或藥物實現的。
2 水凝膠在構建血管化骨組織方面的優勢
目前，骨組織工程領域的支架材料包括金屬、生物陶瓷、水凝膠和合成聚合物等。這些材料具有不同的理化和生物學特性，在不同的應用場景中都有著獨特的優勢。水凝膠是指一類由天然或合成聚合物通過物理或化學方式交聯形成的三維網狀結構，其特點在于結構內能夠吸收并保留大量水分，具有可控的力學性能以及良好的生物相容性和生物可降解性，是骨組織工程領域十分有前途的生物材料[10]。與金屬及生物陶瓷等硬性支架相比，水凝膠支架在血管構建方面具有獨特的優勢。這種支架的多孔網絡結構與細胞外基質相似，能刺激 EC 產生 VEGF、bFGF、轉化生長因子 β 等促血管活性的細胞因子，進而導致基質金屬蛋白酶的產生，通過降解細胞外基質重建血管結構，這對調控新生血管的生長具有至關重要的作用[11-12]。此外，水凝膠的三維網狀結構能夠直接作為細胞、細胞因子及小分子物質的載體材料，這些具有生物活性的物質能在水凝膠內保持活性并在支架植入部位緩慢釋放，達到藥物遞送、細胞封裝的目的，最終促進局部成骨或成血管[13]。水凝膠作為一種軟性材料，還可根據具體應用情況制備為任何形狀，精準地與缺損部位相匹配，減少與周圍細胞及軟組織的炎性反應[10]。
3 基于水凝膠載體的血管化
3.1 水凝膠載 EC
EC 是循環系統中覆蓋在血管內表面的細胞群，它構成了血管壁與血液的交界面，是血管形成的基礎。當局部血管受損后，位于骨髓內的內皮組細胞及具有分化潛能的干細胞在 VEGF、基質細胞趨化因子-1 等細胞因子的作用下向受損部位遷移并分化為功能化 EC，參與血管的形成與修復[14]。活化的內皮細胞又可以分泌 VEGF、骨保護素、BMP 等促成骨細胞因子，影響成骨細胞與破骨細胞之間的平衡，進而實現骨組織的再生[15]。Thébaud 等[16]將普魯蘭、葡聚糖、巖藻聚糖 3 種多糖通過三偏磷酸鈉化學交聯形成水凝膠體系，研究發現在無血清條件下內皮組細胞可以在水凝膠上表現出超過 80% 的高黏附水平，有望成為組織工程領域促進血管化的有效方法。Mihaila 等[17]將脂肪來源的 EC 封裝在由殼聚糖及卡拉膠微纖維構成的水凝膠中，體外研究發現 EC 在水凝膠中培養 21 d 時活細胞比例仍可保持 60%，并能向外緩慢釋放，形成管狀微血管結構，表明了該三維水凝膠系統能夠有效負載 EC 并不會改變細胞表型，可作為構建血管化骨支架材料。Santos 等[18]在體外實驗中證明了聚丙酰胺水凝膠不僅可以保持人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）活性，還能在基因和蛋白水平上調 VEGF 受體 2、小泡蛋白-1、β 連環蛋白等促血管因子及 BMP-2、bFGF、Wnt2 蛋白等成骨因子的表達。此外，Zhao 等[19]制備了負載骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cell, BMSC）來源 EC 的明膠納米顆粒水凝膠，該水凝膠體系能有效改善鉭金屬支架血管化不足的問題，植入小鼠體內 4 周后可觀察到成熟的毛細血管網絡形成，顯示了水凝膠負載 EC 實現組織工程骨血管化的可行性。
近年來，細胞共培養系統的優勢逐漸被研究者們發現，通過不同類型的細胞共同培養可以模擬生理環境中組織修復的真實情況。共培養系統可分為直接共培養與間接共培養，直接共培養是指將 2 種或以上不同類型的細胞混合培養在同一介質中，細胞間的相互作用既可通過細胞間直接黏附和細胞與細胞外基質黏附進行信號傳遞，也可通過旁分泌生物活性因子進行調控；而間接共培養是指不同類型的細胞在同一介質中培養，但不同類型細胞之間是物理分離的，細胞之間通過旁分泌因子進行信號傳遞[20]。有研究表明，間充質干細胞既可分泌 VEGF、bFGF 等促血管細胞因子，誘導 EC 增殖和聚集，調控細胞間的黏附進而促進血管再生；也可分化為血管周細胞和平滑肌細胞的支持細胞，促進血管的成熟與穩定[21]。而 EC 也可分泌 BMP-2、bFGF 等細胞因子誘導間充質干細胞成骨分化及礦鹽沉積[22]。因此，目前有學者通過水凝膠體系負載干細胞與內皮細胞共培養系統，來達到克服骨組織工程領域血管化的問題。Wenz 等[23]將人脂肪干細胞與人皮膚微血管內皮細胞包裹在甲基丙烯酰改性明膠的軟水凝膠中，并與含有甲基丙烯酸改性透明質酸和羥基磷灰石顆粒的硬水凝膠包被的人脂肪干細胞進行間接共培養，14 d 后與單一培養組相比，該共培養系統的軟凝膠中形成了復雜且成熟的毛細血管網絡，硬凝膠中成骨相關蛋白明顯增加。Barre 等[24]構建了一種基于海藻酸鹽的水凝膠負載 BMSC 和 EC 進行直接共培養，體外細胞相容性實驗發現該水凝膠能維持細胞的生存能力和代謝活性，裸鼠皮下實驗植入該支架 2 個月后經組織學染色和免疫熒光染色發現大量新生血管形成及 BMSC 成骨分化，表明了該共培養系統的成骨及成血管潛能，是一種操作簡便且生物活性良好的骨組織工程植入材料。Liu 等[25]開發了一種直接共培養系統，將 HUVEC 與人骨髓基質細胞共同封裝于甲基丙烯酸酐化明膠水凝膠內，體外研究發現相較于單獨細胞培養組，共培養能形成完整管狀結構的血管組織，CD31、CD105、CD144 等血管標志物明顯升高；體內實驗發現共培養組血管組織侵入程度高，與周圍組織聯系緊密；此外該研究還發現骨髓基質細胞能向血管周細胞分化，促進血管形成。Yang 等[26]基于動態共價鍵和離子間的相互作用制備了一種乙二醇殼聚糖和海藻酸鈣的原位可注射雙網絡水凝膠，將 EC 與 BMSC 封裝在該水凝膠體系內進行直接共培養，研究發現該共培養系統較單一細胞培養組顯著促進了 2 種細胞的增殖活性，明顯上調 RUNX2、ALP、OPN 等成骨基因及 VEGF-A、PECAM1 和 vWF 等促血管基因的表達，同時增強成骨和成血管功能，且植入小鼠皮下 6 周后觀察到更多新生血管的形成，顯示了該共培養系統在血管化骨再生領域的潛力。表1 簡單概括了目前通過水凝膠負載細胞構建血管化骨替代材料的研究[16-19, 23-26]。
表1
通過水凝膠負載細胞構建血管化骨替代材料
3.2 水凝膠載成血管相關因子
血管生成是一個涉及多種組份參與的復雜過程，各種促血管的細胞因子在此過程中具有重要作用。VEGF 是血管 EC 中含量最豐富中的細胞因子，能夠促進 EC 遷移及增殖，刺激一氧化氮產生導致血管擴張，改變血管通透性，明顯促進血管生成，對于骨修復的炎癥機化、軟骨內成骨、膜內成骨及骨痂改造塑型期均有明顯促進作用[9]。此外血小板衍生生長因子、BMP、bFGF 等因子能夠誘導血管周細胞及平滑肌細胞聚集，促進新生血管的成熟與穩定[27]。然而細胞因子具有半衰期短、穩定性差、大劑量使用存在細胞毒性等缺點，限制了其在缺損部位的直接應用[28]。目前通過水凝膠負載細胞因子可以實現長期保持生物活性及可控緩慢釋放的特點，是一種十分有前景的血管化方法（表2）[29-32]。Juhl 等[29]將 VEGF 負載在適體功能化纖維蛋白水凝膠中，對 VEGF 的體外釋放動力學及體內血管生成和成骨能力進行評估，發現該水凝膠體系能夠長期釋放 VEGF 14 d 以上，與未負載因子組相比，該體系能顯著減少小鼠顱骨缺損面積，頭顱血管造影顯示血管密度增多、血管之間吻合度更好，這表明了該體系具有良好的誘導骨骼再生及血管生成的能力。Zhang 等[30]使用 RATEA16 肽構建了 2 種載因子可注射水凝膠支架，分別是負載 VEGF 的 RA-VEGF 組和負載 BMP-2 的 RA-BMP2 組，他們發現 RA-VEGF 組能在體外穩定釋放 VEGF，12 d 內有 1.6% 的 VEGF 從支架中釋放出來，與培養基中直接加入 VEGF 組相比，RA-VEGF 組中 VEGF 的可控釋放能有效增加 HUVEC 增殖活性，劃痕實驗、Transwell 實驗及細胞管形成實驗均表明其能更好地促進 HUVEC 遷移、聚集成管；而 RA-BMP2 組 12 d 內有 0.4% 的 BMP-2 從支架中釋放出來，能顯著上調根尖乳頭干細胞中 ALP、OPN、COL-1 等成骨基因的表達，表明了該水凝膠支架能夠穩定負載和高效傳遞細胞因子，在骨修復領域展現出巨大前景。此外，Divband 等[31]使用殼聚糖雙胍與羥甲基纖維素為基礎制備了同時負載 BMP-2 和 VEGF 的水凝膠，在體外進行了釋放動力學及生物誘導性檢測，發現該水凝膠支架能夠同時釋放 BMP-2 和 VEGF 24 d 以上，VEGF 的釋放速度快于 BMP-2，符合骨再生過程中血管化的要求，且隨著水凝膠中羧甲基纖維素含量的增高，因子釋放更為持久；能夠促進牙髓干細胞成骨相關基因表達，鈣鹽沉積，但未進行體內實驗進一步驗證。Lee 等[32]構建了一種不同釋放動力學的雙冷凍水凝膠系統，外層由明膠/殼聚糖負載 VEGF、內層由明膠/肝素負載 BMP-4 構成，體外實驗發現該系統能夠實現早期釋放 VEGF，BMP-4 持續釋放 30 d 以上，堿性磷酸酶染色、茜素紅染色及聚合酶鏈反應結果均顯示該體系能有效促進脂肪干細胞成骨分化，有望實現協同成骨分化與血管生成促進骨再生；體內實驗進一步表明該雙冷凍水凝膠能有效修復小鼠顱骨缺損模型，微 CT 顯示該雙冷凍水凝膠相較于其他實驗組擁有最高的骨體積及表面積分數。
表2
通過水凝膠負載細胞因子構建血管化骨替代材料
3.3 水凝膠載金屬離子
如今許多金屬離子在組織工程領域表現出了優異的成骨和成血管特性而被廣泛研究，不同于血管源性細胞和細胞因子，金屬離子簡便易得、性質穩定，通過水凝膠負載不同類型的金屬離子實現早期血管化也是一種有效途徑（表3）[33-36]。
表3
通過水凝膠負載金屬離子構建血管化骨替代材料
鎂離子是人體中位列第四的陽離子，參與多種酶促反應，促進蛋白質合成，在維持正常機體功能方面具有重要功能[37]。最近研究發現鎂離子不僅可以促進 BMSC 增殖，上調 ALP、OCN、Col-1 等成骨基因表達，還能刺激 HUVEC 增殖、遷移并分泌 VEGF 和內皮型一氧化氮合酶加速早期血管形成，在構建血管化組織工程骨方面有巨大潛能[38]。因此有學者嘗試將鎂離子引入水凝膠體系中，改善骨組織工程中血管化不足的問題。Liu 等[33]構建了一個基于甲基丙烯酸酐化明膠的可注射復合水凝膠，通過將磷酸氨鎂和牙髓干細胞引入體系中，用于血管化骨再生研究，他們先在體外證明了濃度為 500 μg/mL 磷酸氨鎂具有最好的成骨及成血管作用，隨后構建了復合水凝膠體系，研究發現該體系能緩釋鎂離子 20 d 以上，相較于純水凝膠組，鎂離子的加入使水凝膠具有更好的膨脹性能，能更好地貼合缺損部位，并顯著提高牙髓干細胞中 ALP、OCN、BMP-2、RUNX2 等成骨相關基因表達及 VEGF、Ang-2、HIF-1α 等成血管基因表達，并促進了細胞的遷移。Zhang 等[34]通過甲基丙烯酸酐化明膠、硫代殼聚糖和改性多面體寡聚倍半硅氧烷納米粒子進行光交聯制備了一種雙交聯水凝膠，并通過鎂的配位鍵將活性鎂離子引入體系中，該體系具有良好的機械強度、穩定的網絡結構及合適的降解性能，研究者發現鎂離子的釋放不僅能促進 BMSC 的成骨分化，還能促進體外的血管生成，并在大鼠顱骨缺損模型中得到了類似的結果。
銅離子是人體中必不可少的微量元素，在維持造血功能及氧化應激反應中具有重要意義，機體銅離子的紊亂與帕金森病、糖尿病及心血管疾病的發生發展均有密切關系[39]。銅離子可以有效促進細胞表達缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor, HIF）-1α 和 VEGF 誘導血管生成，還同時具備抗菌能力和成骨誘導性[40]。此外，銅離子還可以通過激活 HUVEC 的 HIF-1α 和腫瘤壞死因子-α 通路促進骨再生[41]。Wu 等[35]將含銅生物活性玻璃納米粒子包裹在殼聚糖、絲素蛋白和甘油磷酸復合物中，制備了一種無細胞的可注射水凝膠，該水凝膠能在生理環境中持續釋放安全濃度的銅離子，體外實驗表明該水凝膠能夠誘導 HUVEC 和 MC3T3 細胞成骨和成血管分化，體內實驗進一步顯示該含銅水凝膠可以在 8 周內完全修復大鼠顱骨缺損，形成血管化良好的骨組織，無需使用任何細胞或生長因子，具有巨大的臨床應用前景。
鈷離子作為人體中的一種微量元素，可以在正常生理環境中與 HIF-1α 結合并阻止其降解，導致 HIF-1α 蓄積并形成 HIF 復合物，模擬局部的缺氧環境，從而刺激 VEGF 等血管生成基因表達增加[42]。在傳統生物玻璃中摻入鈷離子可以顯著提高 VEGF 的表達，促進新生血管，是提高生物玻璃血管誘導性能的有效方法[43]。Perez 等[36]設計了一種能夠順序遞送物質的水凝膠支架，支架外殼為負載鈷離子的海藻酸鹽，核心為負載 BMP-2 的膠原蛋白，通過早期傳遞鈷離子促進新生血管來協調骨再生，體外實驗表明該支架可以在 1 周內迅速釋放鈷離子，BMP-2 能在幾個月時間內長期釋放，可以促進小鼠間充質干細胞分泌 VEGF，并形成管狀網絡結構；將支架植入大鼠顱骨缺損處 6 周后，與僅含 BMP-2 水凝膠組比，該支架組擁有更高的新生骨體積及新生血管組織。
3.4 水凝膠載小分子物質
目前研究發現許多小分子蛋白、藥物能夠直接調控 EC 功能或促進機體分泌成血管相關因子促進局部血管生成，且相較于細胞因子具有更好的生物學穩定性[44]。水凝膠由于其具有良好的黏附性、生物相容性和可降解性，能夠包裹這些小分子物質向缺損部位釋放，在局部產生效應，增強血管生成能力。二甲基草酰甘氨酸（dimethyloxallyl glycine, DMOG）是一種競爭性的 HIF 脯氨酰羥化酶抑制劑，作為一種小分子藥物其通過穩定 HIF-1α 的表達進而調控細胞通透性，具有良好的促血管生成和促成骨分化能力[45]。Yegappan 等[46]構建了一種負載白磷礦石納米顆粒和 DMOG 的卡拉膠復合水凝膠，該水凝膠具有可注射性、機械穩定性、細胞相容性及良好的蛋白質吸附性，能夠持續釋放 DMOG 7 d 以上，體外血管形成實驗表明該復合水凝膠顯著提高了誘導 HUVEC 形成管樣結構的能力，并能上調 Runx2、ALP、COL、OPN 等成骨基因的表達，表明該復合水凝膠具有良好的成骨成血管特性，是骨組織工程良好的植入材料。胸腺肽 β4 是胸腺分泌的小分子活性蛋白，由 43 個氨基酸分子組成，研究表明其可促進 EC 增殖、黏附和分化，還能誘導血管內皮基質分解，促進血管發芽[47]。Kraehenbuehl 等[48]以合成的基質金屬蛋白酶響應型聚乙二醇水凝膠為載體封裝胸腺肽 β4，在體外進行血管生成能力研究，發現該水凝膠體系能可控性釋放胸腺肽 β4；與不含胸腺肽 β4 組相比，胸腺肽 β4 的釋放使 HUVEC 的存活率及黏附率明顯提高，血管內皮鈣黏蛋白的表達增加了 7 倍，血管生成素 2 的表達增加了 2 倍，可以有效誘導血管樣網絡的形成。去鐵胺是一種鐵離子螯合劑，臨床上用于治療地中海貧血及帕金森病等疾病，有研究發現它可以促進 VEGF、環氧化酶-2 表達，激活 EC 功能促進血管重建[49]。Cheng 等[44]構建了一種可注射仿生水凝膠，將去鐵胺和 BMP-2 負載到納米絲素纖維和羥基磷灰石納米顆粒水凝膠中，體外研究表明該體系無細胞毒性，能夠釋放去鐵胺及 BMP-2 40 d 以上，體外血管生成實驗表明該體系能夠有效誘導 HUVEC 形成管狀結構，成骨分化實驗表明該體系能顯著上調 BMSC 中 ALP、Runx-2、OCN、OPN 等成骨基因表達；體內實驗表明該體系能夠有效改善大鼠顱骨缺陷模型的血管和骨生成。此外，Wang 等[50]將去鐵胺同樣負載在上述 2 種成分的水凝膠中，研究發現該水凝膠體系可以緩釋去鐵胺 60 d 以上。與不含去鐵胺的對照組相比，實驗組的體內外實驗均表現出更強的血管生成和成骨能力，證明了該無機成分、有機成分及化學藥物仿生水凝膠體系在骨組織工程中的臨床應用潛力。表4 簡單概括了目前通過水凝膠負載小分子物質構建血管化骨替代材料的研究[44, 46, 48, 50]。
表4
通過水凝膠負載小分子物質構建血管化骨替代材料
4 基于水凝膠 3D 生物打印的血管化
3D 生物打印技術是近年來發展迅速的一項材料加工技術，利用 3D 打印可將具有生物活性的生物墨水個性化制造成不同類型的合成結構[51]。其優點在于能夠精確控制合成結構的宏觀形狀及微觀組份的空間分布，以滿足復雜的目標器官和組織結構需求[52]。目前，3D 生物打印技術已經被廣泛應用于骨組織工程等領域。水凝膠是目前最常用的生物墨水，通過封裝不同類型的細胞、細胞因子，進而利用 3D 打印技術制造出復雜結構的支架，是實現血管化組織工程骨的有效策略[53]。Anada 等[54]為了模擬體內自然骨骼的發育過程，通過 3D 打印技術將 3D 培養的 HUVEC 及磷酸八鈣均勻分布在甲基丙烯酸明膠水凝膠中，該水凝膠外層為富含磷酸八鈣模擬皮質骨，內層為富含 HUVEC 模擬骨髓的仿生雙環結構，體外結果顯示該水凝膠能夠有效促進小鼠間充質干細胞增殖，上調 ALP 表達，并能在體外構建出毛細血管結構，是具有潛力的骨組織工程植入物。
5 結語
血管化在組織工程骨修復支架的構建方面扮演著十分重要的角色，直接決定并影響著生物支架的骨修復效果。支架內部良好的血管化可以為植入骨缺損內的支架與宿主周圍組織營養物質和代謝廢物交換提供通道。結合水凝膠自身良好的理化特性，越來越多的研究者將水凝膠作為 EC、成血管相關因子、金屬離子、小分子藥物的載體用于血管化的構建之中并取得了良好的成血管效果。但是，如何提高水凝膠材料的可控性和穩定性，以確保其在長期應用過程中不會失去生物活性，仍需進一步研究。而且，目前的水凝膠材料雖然能夠提供良好的生物相容性，但其力學強度卻較低，不能滿足臨床上對于骨組織工程材料的力學需求。因此，如何解決水凝膠材料的機械和生物性能不平衡問題仍是未來的研究重點。目前基于水凝膠的血管化策略仍集中在動物實驗階段，尚需進一步的體內實驗驗證。此外，如何利用水凝膠實現早期有序血管化再生以及如何快速建立支架與周圍組織的血管網絡仍需進一步研究探討。總之，骨組織工程領域基于水凝膠的血管化策略具有廣闊的應用前景，但是還需要通過不斷的研究和探索解決目前存在的技術難點，以推動其在臨床上的應用和發展。
作者貢獻：江家寶、邢飛、者漫、羅榮、陳釗負責綜述構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改；劉明負責綜述立題、構思建議，文章初稿修改；黃富國、項舟對綜述構思提出建議。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
由外傷、腫瘤及感染等原因導致的大塊骨缺損是目前臨床治療的難點，傳統治療方法如骨移植、骨搬運等技術存在著供骨量有限、手術周期長、治療費用高等問題[1]。骨組織工程技術能夠制備具有良好骨誘導能力的骨替代材料治療骨缺損而備受關注[2]。但骨組織再生與血管形成密不可分，如何實現骨替代材料的血管化是目前骨組織工程領域迫切需要解決的問題[3]。骨是具有高度血管化的組織結構，其血流量占靜息心輸出量的 10%～15%，骨的生長發育、礦化成熟、改造塑型和組織再生都基于優異的血管化網絡形成[4]。生物體內正常的骨骼形成方式主要包括膜內成骨和軟骨內成骨，而這兩種成骨方式均需要成熟的血管化網絡來進行細胞傳送、氧氣及營養物質運輸、代謝廢物排出[5-7]。水凝膠是指一類由天然或合成聚合物通過物理或化學方式交聯形成的三維網狀結構，可以充分模擬細胞外基質，具備良好的生物相容性和生物可降解性。因此，基于水凝膠的血管化策略被認為是一種促進骨替代材料血管化的有效方法。近年來，越來越多的國內外研究者利用水凝膠搭載不同物質進行體外血管化構建并應用于骨再生之中。在此背景之下，本文對骨組織工程領域基于水凝膠的血管化策略進行綜述。
1 血管的形成
血管的形成主要包括血管生成和血管發芽兩種方式。血管生成被定義為胚胎發育過程中由中胚層和內胚層發育而來的血管內皮祖細胞或血管祖細胞分化為血管內皮細胞（endothelial cell, EC）逐漸形成原始血管網絡，是血管從無到有的過程；血管發芽是原有血管腔在一氧化氮和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的刺激下，血管腔擴張，基底膜局部降解，EC 向此處遷移隨分裂增殖成芽，芽與芽之間相互連接成環，形成新血管腔，隨后周細胞和平滑肌細胞包裹 EC 形成新的基底膜，局部血管網絡重建，是血管從少到多的過程[8]。血管形成是一個受多種細胞因子調控的復雜過程，目前研究表明 VEGF、堿性成纖維生長因子（fibroblast growth factor, bFGF）、血小板衍生生長因子、轉化生長因子 β、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）-2 和 BMP-7 細胞因子等能夠直接或間接刺激 EC 的增殖遷移和活化，促進新生血管的穩定與成熟[7, 9]。如今組織工程的血管化策略主要是通過植入物直接負載具有血管分化潛能的細胞、成血管相關細胞因子或者負載具有促血管生成特性的金屬離子或藥物實現的。
2 水凝膠在構建血管化骨組織方面的優勢
目前，骨組織工程領域的支架材料包括金屬、生物陶瓷、水凝膠和合成聚合物等。這些材料具有不同的理化和生物學特性，在不同的應用場景中都有著獨特的優勢。水凝膠是指一類由天然或合成聚合物通過物理或化學方式交聯形成的三維網狀結構，其特點在于結構內能夠吸收并保留大量水分，具有可控的力學性能以及良好的生物相容性和生物可降解性，是骨組織工程領域十分有前途的生物材料[10]。與金屬及生物陶瓷等硬性支架相比，水凝膠支架在血管構建方面具有獨特的優勢。這種支架的多孔網絡結構與細胞外基質相似，能刺激 EC 產生 VEGF、bFGF、轉化生長因子 β 等促血管活性的細胞因子，進而導致基質金屬蛋白酶的產生，通過降解細胞外基質重建血管結構，這對調控新生血管的生長具有至關重要的作用[11-12]。此外，水凝膠的三維網狀結構能夠直接作為細胞、細胞因子及小分子物質的載體材料，這些具有生物活性的物質能在水凝膠內保持活性并在支架植入部位緩慢釋放，達到藥物遞送、細胞封裝的目的，最終促進局部成骨或成血管[13]。水凝膠作為一種軟性材料，還可根據具體應用情況制備為任何形狀，精準地與缺損部位相匹配，減少與周圍細胞及軟組織的炎性反應[10]。
3 基于水凝膠載體的血管化
3.1 水凝膠載 EC
EC 是循環系統中覆蓋在血管內表面的細胞群，它構成了血管壁與血液的交界面，是血管形成的基礎。當局部血管受損后，位于骨髓內的內皮組細胞及具有分化潛能的干細胞在 VEGF、基質細胞趨化因子-1 等細胞因子的作用下向受損部位遷移并分化為功能化 EC，參與血管的形成與修復[14]。活化的內皮細胞又可以分泌 VEGF、骨保護素、BMP 等促成骨細胞因子，影響成骨細胞與破骨細胞之間的平衡，進而實現骨組織的再生[15]。Thébaud 等[16]將普魯蘭、葡聚糖、巖藻聚糖 3 種多糖通過三偏磷酸鈉化學交聯形成水凝膠體系，研究發現在無血清條件下內皮組細胞可以在水凝膠上表現出超過 80% 的高黏附水平，有望成為組織工程領域促進血管化的有效方法。Mihaila 等[17]將脂肪來源的 EC 封裝在由殼聚糖及卡拉膠微纖維構成的水凝膠中，體外研究發現 EC 在水凝膠中培養 21 d 時活細胞比例仍可保持 60%，并能向外緩慢釋放，形成管狀微血管結構，表明了該三維水凝膠系統能夠有效負載 EC 并不會改變細胞表型，可作為構建血管化骨支架材料。Santos 等[18]在體外實驗中證明了聚丙酰胺水凝膠不僅可以保持人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）活性，還能在基因和蛋白水平上調 VEGF 受體 2、小泡蛋白-1、β 連環蛋白等促血管因子及 BMP-2、bFGF、Wnt2 蛋白等成骨因子的表達。此外，Zhao 等[19]制備了負載骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cell, BMSC）來源 EC 的明膠納米顆粒水凝膠，該水凝膠體系能有效改善鉭金屬支架血管化不足的問題，植入小鼠體內 4 周后可觀察到成熟的毛細血管網絡形成，顯示了水凝膠負載 EC 實現組織工程骨血管化的可行性。
近年來，細胞共培養系統的優勢逐漸被研究者們發現，通過不同類型的細胞共同培養可以模擬生理環境中組織修復的真實情況。共培養系統可分為直接共培養與間接共培養，直接共培養是指將 2 種或以上不同類型的細胞混合培養在同一介質中，細胞間的相互作用既可通過細胞間直接黏附和細胞與細胞外基質黏附進行信號傳遞，也可通過旁分泌生物活性因子進行調控；而間接共培養是指不同類型的細胞在同一介質中培養，但不同類型細胞之間是物理分離的，細胞之間通過旁分泌因子進行信號傳遞[20]。有研究表明，間充質干細胞既可分泌 VEGF、bFGF 等促血管細胞因子，誘導 EC 增殖和聚集，調控細胞間的黏附進而促進血管再生；也可分化為血管周細胞和平滑肌細胞的支持細胞，促進血管的成熟與穩定[21]。而 EC 也可分泌 BMP-2、bFGF 等細胞因子誘導間充質干細胞成骨分化及礦鹽沉積[22]。因此，目前有學者通過水凝膠體系負載干細胞與內皮細胞共培養系統，來達到克服骨組織工程領域血管化的問題。Wenz 等[23]將人脂肪干細胞與人皮膚微血管內皮細胞包裹在甲基丙烯酰改性明膠的軟水凝膠中，并與含有甲基丙烯酸改性透明質酸和羥基磷灰石顆粒的硬水凝膠包被的人脂肪干細胞進行間接共培養，14 d 后與單一培養組相比，該共培養系統的軟凝膠中形成了復雜且成熟的毛細血管網絡，硬凝膠中成骨相關蛋白明顯增加。Barre 等[24]構建了一種基于海藻酸鹽的水凝膠負載 BMSC 和 EC 進行直接共培養，體外細胞相容性實驗發現該水凝膠能維持細胞的生存能力和代謝活性，裸鼠皮下實驗植入該支架 2 個月后經組織學染色和免疫熒光染色發現大量新生血管形成及 BMSC 成骨分化，表明了該共培養系統的成骨及成血管潛能，是一種操作簡便且生物活性良好的骨組織工程植入材料。Liu 等[25]開發了一種直接共培養系統，將 HUVEC 與人骨髓基質細胞共同封裝于甲基丙烯酸酐化明膠水凝膠內，體外研究發現相較于單獨細胞培養組，共培養能形成完整管狀結構的血管組織，CD31、CD105、CD144 等血管標志物明顯升高；體內實驗發現共培養組血管組織侵入程度高，與周圍組織聯系緊密；此外該研究還發現骨髓基質細胞能向血管周細胞分化，促進血管形成。Yang 等[26]基于動態共價鍵和離子間的相互作用制備了一種乙二醇殼聚糖和海藻酸鈣的原位可注射雙網絡水凝膠，將 EC 與 BMSC 封裝在該水凝膠體系內進行直接共培養，研究發現該共培養系統較單一細胞培養組顯著促進了 2 種細胞的增殖活性，明顯上調 RUNX2、ALP、OPN 等成骨基因及 VEGF-A、PECAM1 和 vWF 等促血管基因的表達，同時增強成骨和成血管功能，且植入小鼠皮下 6 周后觀察到更多新生血管的形成，顯示了該共培養系統在血管化骨再生領域的潛力。表1 簡單概括了目前通過水凝膠負載細胞構建血管化骨替代材料的研究[16-19, 23-26]。
表1
通過水凝膠負載細胞構建血管化骨替代材料
3.2 水凝膠載成血管相關因子
血管生成是一個涉及多種組份參與的復雜過程，各種促血管的細胞因子在此過程中具有重要作用。VEGF 是血管 EC 中含量最豐富中的細胞因子，能夠促進 EC 遷移及增殖，刺激一氧化氮產生導致血管擴張，改變血管通透性，明顯促進血管生成，對于骨修復的炎癥機化、軟骨內成骨、膜內成骨及骨痂改造塑型期均有明顯促進作用[9]。此外血小板衍生生長因子、BMP、bFGF 等因子能夠誘導血管周細胞及平滑肌細胞聚集，促進新生血管的成熟與穩定[27]。然而細胞因子具有半衰期短、穩定性差、大劑量使用存在細胞毒性等缺點，限制了其在缺損部位的直接應用[28]。目前通過水凝膠負載細胞因子可以實現長期保持生物活性及可控緩慢釋放的特點，是一種十分有前景的血管化方法（表2）[29-32]。Juhl 等[29]將 VEGF 負載在適體功能化纖維蛋白水凝膠中，對 VEGF 的體外釋放動力學及體內血管生成和成骨能力進行評估，發現該水凝膠體系能夠長期釋放 VEGF 14 d 以上，與未負載因子組相比，該體系能顯著減少小鼠顱骨缺損面積，頭顱血管造影顯示血管密度增多、血管之間吻合度更好，這表明了該體系具有良好的誘導骨骼再生及血管生成的能力。Zhang 等[30]使用 RATEA16 肽構建了 2 種載因子可注射水凝膠支架，分別是負載 VEGF 的 RA-VEGF 組和負載 BMP-2 的 RA-BMP2 組，他們發現 RA-VEGF 組能在體外穩定釋放 VEGF，12 d 內有 1.6% 的 VEGF 從支架中釋放出來，與培養基中直接加入 VEGF 組相比，RA-VEGF 組中 VEGF 的可控釋放能有效增加 HUVEC 增殖活性，劃痕實驗、Transwell 實驗及細胞管形成實驗均表明其能更好地促進 HUVEC 遷移、聚集成管；而 RA-BMP2 組 12 d 內有 0.4% 的 BMP-2 從支架中釋放出來，能顯著上調根尖乳頭干細胞中 ALP、OPN、COL-1 等成骨基因的表達，表明了該水凝膠支架能夠穩定負載和高效傳遞細胞因子，在骨修復領域展現出巨大前景。此外，Divband 等[31]使用殼聚糖雙胍與羥甲基纖維素為基礎制備了同時負載 BMP-2 和 VEGF 的水凝膠，在體外進行了釋放動力學及生物誘導性檢測，發現該水凝膠支架能夠同時釋放 BMP-2 和 VEGF 24 d 以上，VEGF 的釋放速度快于 BMP-2，符合骨再生過程中血管化的要求，且隨著水凝膠中羧甲基纖維素含量的增高，因子釋放更為持久；能夠促進牙髓干細胞成骨相關基因表達，鈣鹽沉積，但未進行體內實驗進一步驗證。Lee 等[32]構建了一種不同釋放動力學的雙冷凍水凝膠系統，外層由明膠/殼聚糖負載 VEGF、內層由明膠/肝素負載 BMP-4 構成，體外實驗發現該系統能夠實現早期釋放 VEGF，BMP-4 持續釋放 30 d 以上，堿性磷酸酶染色、茜素紅染色及聚合酶鏈反應結果均顯示該體系能有效促進脂肪干細胞成骨分化，有望實現協同成骨分化與血管生成促進骨再生；體內實驗進一步表明該雙冷凍水凝膠能有效修復小鼠顱骨缺損模型，微 CT 顯示該雙冷凍水凝膠相較于其他實驗組擁有最高的骨體積及表面積分數。
表2
通過水凝膠負載細胞因子構建血管化骨替代材料
3.3 水凝膠載金屬離子
如今許多金屬離子在組織工程領域表現出了優異的成骨和成血管特性而被廣泛研究，不同于血管源性細胞和細胞因子，金屬離子簡便易得、性質穩定，通過水凝膠負載不同類型的金屬離子實現早期血管化也是一種有效途徑（表3）[33-36]。
表3
通過水凝膠負載金屬離子構建血管化骨替代材料
鎂離子是人體中位列第四的陽離子，參與多種酶促反應，促進蛋白質合成，在維持正常機體功能方面具有重要功能[37]。最近研究發現鎂離子不僅可以促進 BMSC 增殖，上調 ALP、OCN、Col-1 等成骨基因表達，還能刺激 HUVEC 增殖、遷移并分泌 VEGF 和內皮型一氧化氮合酶加速早期血管形成，在構建血管化組織工程骨方面有巨大潛能[38]。因此有學者嘗試將鎂離子引入水凝膠體系中，改善骨組織工程中血管化不足的問題。Liu 等[33]構建了一個基于甲基丙烯酸酐化明膠的可注射復合水凝膠，通過將磷酸氨鎂和牙髓干細胞引入體系中，用于血管化骨再生研究，他們先在體外證明了濃度為 500 μg/mL 磷酸氨鎂具有最好的成骨及成血管作用，隨后構建了復合水凝膠體系，研究發現該體系能緩釋鎂離子 20 d 以上，相較于純水凝膠組，鎂離子的加入使水凝膠具有更好的膨脹性能，能更好地貼合缺損部位，并顯著提高牙髓干細胞中 ALP、OCN、BMP-2、RUNX2 等成骨相關基因表達及 VEGF、Ang-2、HIF-1α 等成血管基因表達，并促進了細胞的遷移。Zhang 等[34]通過甲基丙烯酸酐化明膠、硫代殼聚糖和改性多面體寡聚倍半硅氧烷納米粒子進行光交聯制備了一種雙交聯水凝膠，并通過鎂的配位鍵將活性鎂離子引入體系中，該體系具有良好的機械強度、穩定的網絡結構及合適的降解性能，研究者發現鎂離子的釋放不僅能促進 BMSC 的成骨分化，還能促進體外的血管生成，并在大鼠顱骨缺損模型中得到了類似的結果。
銅離子是人體中必不可少的微量元素，在維持造血功能及氧化應激反應中具有重要意義，機體銅離子的紊亂與帕金森病、糖尿病及心血管疾病的發生發展均有密切關系[39]。銅離子可以有效促進細胞表達缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor, HIF）-1α 和 VEGF 誘導血管生成，還同時具備抗菌能力和成骨誘導性[40]。此外，銅離子還可以通過激活 HUVEC 的 HIF-1α 和腫瘤壞死因子-α 通路促進骨再生[41]。Wu 等[35]將含銅生物活性玻璃納米粒子包裹在殼聚糖、絲素蛋白和甘油磷酸復合物中，制備了一種無細胞的可注射水凝膠，該水凝膠能在生理環境中持續釋放安全濃度的銅離子，體外實驗表明該水凝膠能夠誘導 HUVEC 和 MC3T3 細胞成骨和成血管分化，體內實驗進一步顯示該含銅水凝膠可以在 8 周內完全修復大鼠顱骨缺損，形成血管化良好的骨組織，無需使用任何細胞或生長因子，具有巨大的臨床應用前景。
鈷離子作為人體中的一種微量元素，可以在正常生理環境中與 HIF-1α 結合并阻止其降解，導致 HIF-1α 蓄積并形成 HIF 復合物，模擬局部的缺氧環境，從而刺激 VEGF 等血管生成基因表達增加[42]。在傳統生物玻璃中摻入鈷離子可以顯著提高 VEGF 的表達，促進新生血管，是提高生物玻璃血管誘導性能的有效方法[43]。Perez 等[36]設計了一種能夠順序遞送物質的水凝膠支架，支架外殼為負載鈷離子的海藻酸鹽，核心為負載 BMP-2 的膠原蛋白，通過早期傳遞鈷離子促進新生血管來協調骨再生，體外實驗表明該支架可以在 1 周內迅速釋放鈷離子，BMP-2 能在幾個月時間內長期釋放，可以促進小鼠間充質干細胞分泌 VEGF，并形成管狀網絡結構；將支架植入大鼠顱骨缺損處 6 周后，與僅含 BMP-2 水凝膠組比，該支架組擁有更高的新生骨體積及新生血管組織。
3.4 水凝膠載小分子物質
目前研究發現許多小分子蛋白、藥物能夠直接調控 EC 功能或促進機體分泌成血管相關因子促進局部血管生成，且相較于細胞因子具有更好的生物學穩定性[44]。水凝膠由于其具有良好的黏附性、生物相容性和可降解性，能夠包裹這些小分子物質向缺損部位釋放，在局部產生效應，增強血管生成能力。二甲基草酰甘氨酸（dimethyloxallyl glycine, DMOG）是一種競爭性的 HIF 脯氨酰羥化酶抑制劑，作為一種小分子藥物其通過穩定 HIF-1α 的表達進而調控細胞通透性，具有良好的促血管生成和促成骨分化能力[45]。Yegappan 等[46]構建了一種負載白磷礦石納米顆粒和 DMOG 的卡拉膠復合水凝膠，該水凝膠具有可注射性、機械穩定性、細胞相容性及良好的蛋白質吸附性，能夠持續釋放 DMOG 7 d 以上，體外血管形成實驗表明該復合水凝膠顯著提高了誘導 HUVEC 形成管樣結構的能力，并能上調 Runx2、ALP、COL、OPN 等成骨基因的表達，表明該復合水凝膠具有良好的成骨成血管特性，是骨組織工程良好的植入材料。胸腺肽 β4 是胸腺分泌的小分子活性蛋白，由 43 個氨基酸分子組成，研究表明其可促進 EC 增殖、黏附和分化，還能誘導血管內皮基質分解，促進血管發芽[47]。Kraehenbuehl 等[48]以合成的基質金屬蛋白酶響應型聚乙二醇水凝膠為載體封裝胸腺肽 β4，在體外進行血管生成能力研究，發現該水凝膠體系能可控性釋放胸腺肽 β4；與不含胸腺肽 β4 組相比，胸腺肽 β4 的釋放使 HUVEC 的存活率及黏附率明顯提高，血管內皮鈣黏蛋白的表達增加了 7 倍，血管生成素 2 的表達增加了 2 倍，可以有效誘導血管樣網絡的形成。去鐵胺是一種鐵離子螯合劑，臨床上用于治療地中海貧血及帕金森病等疾病，有研究發現它可以促進 VEGF、環氧化酶-2 表達，激活 EC 功能促進血管重建[49]。Cheng 等[44]構建了一種可注射仿生水凝膠，將去鐵胺和 BMP-2 負載到納米絲素纖維和羥基磷灰石納米顆粒水凝膠中，體外研究表明該體系無細胞毒性，能夠釋放去鐵胺及 BMP-2 40 d 以上，體外血管生成實驗表明該體系能夠有效誘導 HUVEC 形成管狀結構，成骨分化實驗表明該體系能顯著上調 BMSC 中 ALP、Runx-2、OCN、OPN 等成骨基因表達；體內實驗表明該體系能夠有效改善大鼠顱骨缺陷模型的血管和骨生成。此外，Wang 等[50]將去鐵胺同樣負載在上述 2 種成分的水凝膠中，研究發現該水凝膠體系可以緩釋去鐵胺 60 d 以上。與不含去鐵胺的對照組相比，實驗組的體內外實驗均表現出更強的血管生成和成骨能力，證明了該無機成分、有機成分及化學藥物仿生水凝膠體系在骨組織工程中的臨床應用潛力。表4 簡單概括了目前通過水凝膠負載小分子物質構建血管化骨替代材料的研究[44, 46, 48, 50]。
表4
通過水凝膠負載小分子物質構建血管化骨替代材料
4 基于水凝膠 3D 生物打印的血管化
3D 生物打印技術是近年來發展迅速的一項材料加工技術，利用 3D 打印可將具有生物活性的生物墨水個性化制造成不同類型的合成結構[51]。其優點在于能夠精確控制合成結構的宏觀形狀及微觀組份的空間分布，以滿足復雜的目標器官和組織結構需求[52]。目前，3D 生物打印技術已經被廣泛應用于骨組織工程等領域。水凝膠是目前最常用的生物墨水，通過封裝不同類型的細胞、細胞因子，進而利用 3D 打印技術制造出復雜結構的支架，是實現血管化組織工程骨的有效策略[53]。Anada 等[54]為了模擬體內自然骨骼的發育過程，通過 3D 打印技術將 3D 培養的 HUVEC 及磷酸八鈣均勻分布在甲基丙烯酸明膠水凝膠中，該水凝膠外層為富含磷酸八鈣模擬皮質骨，內層為富含 HUVEC 模擬骨髓的仿生雙環結構，體外結果顯示該水凝膠能夠有效促進小鼠間充質干細胞增殖，上調 ALP 表達，并能在體外構建出毛細血管結構，是具有潛力的骨組織工程植入物。
5 結語
血管化在組織工程骨修復支架的構建方面扮演著十分重要的角色，直接決定并影響著生物支架的骨修復效果。支架內部良好的血管化可以為植入骨缺損內的支架與宿主周圍組織營養物質和代謝廢物交換提供通道。結合水凝膠自身良好的理化特性，越來越多的研究者將水凝膠作為 EC、成血管相關因子、金屬離子、小分子藥物的載體用于血管化的構建之中并取得了良好的成血管效果。但是，如何提高水凝膠材料的可控性和穩定性，以確保其在長期應用過程中不會失去生物活性，仍需進一步研究。而且，目前的水凝膠材料雖然能夠提供良好的生物相容性，但其力學強度卻較低，不能滿足臨床上對于骨組織工程材料的力學需求。因此，如何解決水凝膠材料的機械和生物性能不平衡問題仍是未來的研究重點。目前基于水凝膠的血管化策略仍集中在動物實驗階段，尚需進一步的體內實驗驗證。此外，如何利用水凝膠實現早期有序血管化再生以及如何快速建立支架與周圍組織的血管網絡仍需進一步研究探討。總之，骨組織工程領域基于水凝膠的血管化策略具有廣闊的應用前景，但是還需要通過不斷的研究和探索解決目前存在的技術難點，以推動其在臨床上的應用和發展。
作者貢獻：江家寶、邢飛、者漫、羅榮、陳釗負責綜述構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改；劉明負責綜述立題、構思建議，文章初稿修改；黃富國、項舟對綜述構思提出建議。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
