引用本文： 嚴新安, Walter M Chirume, 方躍. 銀納米對不同骨科生物材料上金黃色葡萄球菌生物膜的影響. 華西醫學, 2023, 38(7): 1047-1052. doi: 10.7507/1002-0179.202110174 復制
內植物相關感染是骨科臨床工作中的常見問題，研究顯示，全髖關節置換術后感染率為 2.2%，脊柱手術術后感染率為 2.0%[1-2]，使用外固定支架的患者中近一半發生了針道感染[3-4]。對于這種情況，常用治療方案是手術清創聯合抗菌藥物。但隨著細菌耐藥形勢愈加嚴重，抗菌藥物治療效果常常欠佳。當骨科內植物發生感染時，細菌接觸并黏附到內植物表面，并分泌細胞外聚合物基質，形成生物膜，而生物膜通過阻礙抗菌藥物滲透，將進一步誘導加重細菌耐藥性[5]。此類感染通常需要手術去除內植物和死骨。因此，探索一種抑制細菌生物膜形成的內植物材料或涂層的重要性不言而喻。目前已有多種材料包括季銨化合物、銅離子、銀離子殼聚糖納米顆粒等[6-10]被發現有抗菌作用，作為植入物的表面活性物質。銀離子已被證明具有較強的抗菌特性，同時銀離子還可以制成銀納米顆粒（silver nanoparticle, AgNP），以改善其物理、化學和生物特性[11-12]。因其抗菌及生物特性，AgNP 在骨科領域可能用途廣泛，骨科植入物表面覆蓋 AgNP 涂層可能是一個骨科內植物感染預防及治療方案。本研究通過 AgNP 在體外環境下干預 3 種內植物材料（鈦合金、氧化鈦和不銹鋼）上的金黃色葡萄球菌生物膜實驗來評估 AgNP 能否預防或治療骨科內植物感染。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗菌株
金黃色葡萄球菌 ATCC 25923，由四川大學華西醫院實驗醫學科臨床微生物室提供，已通過基因測序。
1.1.2 AgNP
使用的 AgNP 為南京新飛納米材料科技有限公司的銀納米膠體，產品名稱：Nano silver 膠體銀；濃度：0.1 mg/mL；粒子直徑：（15±5） nm；溶劑：水。
1.1.3 內植物材料
3 種植入物材料分別是氧化鈦、鈦合金和不銹鋼（山東威高控股有限公司提供），大體見圖1。所有圓盤半徑 18 mm，厚度 3 mm，經過 2000 粒度砂紙拋光，圓盤浸泡在 0.2% 市售洗滌劑中過夜，更換洗滌劑在 40℃的超聲波浴清潔 5 min，蒸餾水沖洗 3 次，滅菌，備用。
圖1
3 種內植物材料大體觀
1.2 實驗方法
1.2.1 AgNP 對金黃色葡萄球菌浮游菌及生物膜的藥敏試驗
使用美國臨床和實驗室標準化協會描述的肉湯稀釋方法[13]確定 AgNP 對金黃色葡萄球菌的最低抑制浮游菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC）和最低抑制生物膜濃度（minimal biofilm inhibitory concentration, MBIC），并確定萬古霉素對金黃色葡萄球菌的 MBIC。菌株復蘇后，于新鮮胰酶大豆肉湯中培養 2 h，至對數生長期，加入適量新鮮 Mueller-Hinton 肉湯（Mueller-Hinton broth, MHB），使用肉湯稀釋法制備 AgNP 溶液濃度梯度，獲得 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL 的濃度梯度，現用現配。使用麥氏比濁儀將細菌濃度調整至 0.5 麥氏點（約 1×108 CFU/mL），將 0.5 麥氏點菌液使用 MHB 稀釋 50 倍，現用現配。將細菌溶液加入不同濃度的 AgNP-MHB 溶液中，比例為 50 μL 菌液與 50 μL 不同濃度梯度的 AgNP-MHB 溶液。最終細菌初始培養濃度為 5×105 CFU/mL。同時建立僅由無菌 MHB 組成的陰性對照組和僅包含細菌溶液的陽性對照組，每組重復 6 次實驗。37℃靜置培養 24 h 后，肉眼觀察 MIC。按上述方式，0.5 麥氏點菌液稀釋 100 倍，微孔板內每孔加入 100 μL 菌液，37℃靜置培養 24 h 后吸去微孔板內的菌液，無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）輕柔沖洗 3 次以洗去浮游細菌。每孔加入 150 μL AgNP-MHB 溶液以完全浸沒生物膜，AgNP-MHB 溶液濃度梯度分別為 32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL，加入不含 AgNP 的 MHB 溶液為陰性對照。每組重復 6 次實驗。37℃靜置培養 24 h，肉眼觀察 MBIC。以同法測試出萬古霉素 MBIC，以萬古霉素 MBIC 為陽性對照。吸去微孔板內的菌液，每個微孔內無菌 PBS 輕柔沖洗 3 次，自然風干使用結晶紫染色法染色，用多功能酶標儀測定 595 nm 光密度（optical density, OD）值。
1.2.2 掃描電子顯微鏡（電鏡）下觀察 AgNP 對生物膜的影響
使用直徑 10 mm 圓形玻璃蓋玻片作為載體培養生物膜，放置在 12 孔微孔板孔底部。將如前 1.2.1 所述制備 500 μL 菌液吸入孔中，然后使用 AgNP-MHB 溶液填充至 1000 μL，確保蓋玻片完全浸沒。AgNP 濃度梯度為 32、16、8、4、2 μg/mL，不含 AgNP 的無菌 MHB 為陰性對照，萬古霉素 MBIC 為陽性對照。以與 MBIC 實驗相同的方式培養。培養完成后，蓋玻片分別經過 3 次 PBS 緩慢沖洗、2.5% 戊二醛固定以及梯度乙醇脫水。實驗重復 2 次。使用離子濺射儀在每個蓋玻片上噴金染色，掃描電鏡［賽默飛世爾（中國）科技有限公司］下觀察，隨機取視野拍照。
1.2.3 AgNP 對各種骨科生物材料生物膜形成的影響
將內植物圓盤置入 12 孔微孔板中，同 1.2.1 制備菌液，每孔加入 1000 μL 菌液，完全浸沒圓盤，37℃靜置培養 24 h，取出圓盤，無菌 PBS 輕輕沖洗 3 次，放入新的 12 孔微孔板內，加入 1000 μL 不同濃度梯度的 AgNP-MHB 溶液，AgNP 濃度梯度為 32、16、8、4、2 μg/mL，每種濃度重復 6 次。37℃靜置培養 24 h 后獲得 AgNP 溶液 MBIC，同時測定生物膜 OD 值。
1.3 統計學方法
使用 SPSS 25 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，使用單因素方差分析比較實驗組間差異，若有統計學意義則使用 Tukey 事后檢驗法進行組間兩兩比較，并計算兩兩之間的均數差和 95%置信區間。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 AgNP MIC 實驗結果
AgNP 對金黃色葡萄球菌的 MIC 為 16 μg/mL。
2.2 AgNP MBIC 實驗結果
AgNP 對金黃色葡萄球菌的 MBIC 為 16 μg/mL。陽性對照萬古霉素的 MBIC 為 64 μg/mL。AgNP 干預金黃色葡萄球菌生物膜的 OD 值見表1。
表1
AgNP 干預金黃色葡萄球菌生物膜的 OD 值（n=6）
2.3 掃描電鏡下觀察 AgNP 抑制細菌生物膜
在沒有 AgNP 的情況下（0 μg/mL 濃度，陰性對照組），細菌形成大量簇狀結構，證明該菌株在沒有任何阻礙因素的情況下具有形成生物膜的能力。除去呈蘑菇狀的簇狀生物膜結構，還觀察到大量的浮游菌。在陽性對照組中無明顯簇狀生物膜形成，但仍然有一定的菌量。在低濃度的 AgNP（2 μg/mL）干預下，形成的細菌數量沒有顯著減少，大多數細菌仍然存在于形成的生物膜簇中。在 4 μg/mL 濃度時，盡管周圍浮游細菌顯著減少，但觀察到的情況幾乎相同，其中仍觀察到生物膜。在 8 μg/mL 時，生物膜形成減少，大量浮游菌仍可見，且有形成菌落的趨勢。在作為 MBIC 值的 16 μg/mL 時，生物膜形成受到明顯抑制，浮游菌明顯減少。在 32 μg/mL AgNP 的濃度下，未見浮游菌生長。見圖2。
圖2
AgNP 生物膜處理的掃描電子顯微鏡結果
a. 32 μg/mL AgNP 干預（×1000）；b. 32 μg/mL AgNP 干預（×3000）；c. 16 μg/mL AgNP 干預（×1000）；d. 16 μg/mL AgNP 干預（×3000）；e. 8 μg/mL AgNP 干預（×1000）；f. 8 μg/mL AgNP 干預（×3000）；g. 4 μg/mL AgNP 干預（×1000）；h. 4 μg/mL AgNP 干預（×3000）；i. 2 μg/mL AgNP 干預（×1000）；j. 2 μg/mL AgNP 干預（×3000）；k. 無 AgNP 干預（×1000）；l. 無 AgNP 干預（×3000）；m. 64 μg/mL 萬古霉素干預（×1000）；n. 64 μg/mL 萬古霉素干預（×3000）。AgNP：銀納米顆粒
2.4 AgNP 對不同骨科生物材料上生物膜的影響
AgNP 在氧化鈦上 MBIC 為 16 μg/mL，在鈦合金和不銹鋼材料上 MBIC 為 32 μg/mL。3 種材料中，氧化鈦上 OD 值最低，鈦合金上 OD 值最高。在 MBIC 時，鈦合金 OD 值幾乎是不銹鋼的 2 倍，而在低于 MBIC 濃度下鈦合金 OD 值是氧化鈦和不銹鋼材料的 2～3 倍。單因素方差分析顯示，在不同的濃度 AgNP 及陰性對照和陽性對照處理下，3 種生物材料上生物膜 OD 值差異均有統計學意義（P<0.05）。Turkey 法兩兩比較結果顯示，在 AgNP 8 μg/mL 濃度時氧化鈦和不銹鋼上 OD 值比較，兩者差異無統計學意義（P>0.05），其余組間兩兩比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2、3。
表2
不同濃度 AgNP 時不同骨科生物材料上生物膜 OD 值比較（n=6）
表3
不同濃度 AgNP 時不同骨科生物材料上生物膜 OD 值的兩兩比較（n=6）
3 討論
銀已被證明具有根除多種微生物（包括細菌、真菌和病毒）的能力[14]。銀通過釋放銀離子，與細菌的各種成分（如細胞壁、細胞膜和細菌 DNA）結合并中斷 DNA 的復制而發揮抗菌作用[15-16]。由于尺寸小，納米粒子可與周圍生物環境相互作用，其中小于 100 nm 的結構被證明可以改變或增強生物反應[17-19]。顆粒的大小和分布決定了 AgNP 的許多特征，例如毒性、生物學結果和特異性靶向能力[20]。較小的顆粒更容易與細胞和其他身體成分相互作用，能夠輕松穿過血腦屏障、細胞壁和細胞膜等結構。本研究選擇使用（15±5） nm 的顆粒，這一尺寸可以達到理想的效果，文獻中使用的顆粒直徑范圍為 5～40 nm[21-22]。
本實驗通過掃描電鏡發現，AgNP 不僅抑制生物膜形成，而且高濃度時還顯著降低細菌黏附。值得注意的是，本研究中 MBIC 和 MIC 的濃度基本相等，這表明 AgNP 具有很強的抗生物膜特性。Mala 等[23]的研究中 AgNP 在尿管涂層表面也顯示出這種特性。掃描電鏡觀察顯示，在 32 μg/mL 和 16 μg/mL 的濃度下，AgNP 顯示出了完全的生物膜抑制能力；但隨著濃度降低，菌落逐漸增加。在某些研究中，濃度低于 50 μg/mL 的 AgNP 可以表現出良好的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌生物膜活性[24]。在另一項使用安息香膠提取物形成的 AgNP 干預大腸埃希菌生物膜研究中，研究者發現 AgNP 在 10 μg/mL 濃度時就表現出了抗生物膜活性[25]。AgNP 抑制細菌生物膜的機制尚不清楚。Qin 等[26]在鈦內植物表面修飾 AgNP 的研究表明，AgNP 可抑制細菌對內植物表面的黏附，這一作用可能是通過抑制 icaAD 基因的轉錄來實現的。
本實驗中，我們將 MBIC 濃度的萬古霉素設置為陽性對照。雖然在陽性對照中可以看到抗菌作用，但在同樣的濃度與 AgNP 相比，抑菌效果欠佳。
鈦及其變體和不銹鋼是最常用的骨科生物材料。鈦由于其良好的生物相容性而成為目前應用最廣泛的生物材料[27]。Arens 等[28]的動物實驗研究報道，不銹鋼接骨板的感染率遠高于純鈦，可能與鈦的表面光滑度、表面電荷和疏水性有關[29]。因此，為了獲得公正客觀的結果，本研究中的所有內植物必須事先拋光以獲得均勻的表面光滑度，以盡可能減少由材料表面光滑度引起的誤差。Schildhauer 等[30]研究表明，與純鈦相比，金黃色葡萄球菌對鈦合金的黏附性明顯更高。Malhotra 等[31]研究也表明，與其他生物材料相比，細菌對鈦合金的附著力較高。本研究結果也發現，細菌對鈦合金的附著力較高，MBIC 為 32 μg/mL，其生物膜 OD 值最高；而氧化鈦 MBIC 為 16 μg/mL，這也表明細菌對氧化鈦的附著力較低。氧化鈦是通過鈦原子電解成四價鈦離子，與氧結合，在表面形成氧化層[32]。與鈦合金和不銹鋼相比，氧化鈦 OD 值最低。鈦氧化過程中形成的氧化膜可能是細菌在表面附著減少的原因。Sharma 等[33]提出了銀納米與氧化鈦的相互作用：氧化鈦能促進 AgNP 釋放銀離子，從而增加納米顆粒的殺菌作用，并且具有降低 AgNP 毒性的能力。這跟我們的結果相符而且能解釋為什么氧化鈦具有最低的生物膜附著力。
相關臨床研究表明，使用銀處理醫療器械后細菌污染可有所減少[34-36]。Paná?ek 等[37]研究發現 AgNP 不同于一般抗菌藥物抗感染等機制，使其可作為一種治療耐藥菌株（如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）的有效替代方案。但 AgNP 的主要缺點是其潛在的毒性，但這還具有爭議。大多數研究認為 AgNP 具有毒性，毒性取決于其大小、形狀和濃度[38]。有研究在大鼠中靜脈注射 AgNP 以監測 20～100 nm 大小顆粒的毒性作用，結果顯示脾臟顯著增大，T 和 B 細胞數量增加，表明較大的顆粒具有嚴重的副作用[39]。本研究使用 AgNP 多在 10～20 nm，這一規格的 AgNP 毒性還需要后續實驗繼續研究。
綜上所述，與氧化鈦和不銹鋼相比，鈦合金上生物膜形成最多，而氧化鈦上最少，不銹鋼則介于兩者之間。AgNP 具有很強的抗菌和抗生物膜特性，可有效抑制內植物上的生物膜形成，但其生物毒性還需進一步研究。根據本研究結果，氧化鈦最適合進行表面改性，因為它與 AgNP 的協同作用具有最好的結果。AgNP 直接修飾植入物以及它們在體內環境中的行為有待進一步研究。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
內植物相關感染是骨科臨床工作中的常見問題，研究顯示，全髖關節置換術后感染率為 2.2%，脊柱手術術后感染率為 2.0%[1-2]，使用外固定支架的患者中近一半發生了針道感染[3-4]。對于這種情況，常用治療方案是手術清創聯合抗菌藥物。但隨著細菌耐藥形勢愈加嚴重，抗菌藥物治療效果常常欠佳。當骨科內植物發生感染時，細菌接觸并黏附到內植物表面，并分泌細胞外聚合物基質，形成生物膜，而生物膜通過阻礙抗菌藥物滲透，將進一步誘導加重細菌耐藥性[5]。此類感染通常需要手術去除內植物和死骨。因此，探索一種抑制細菌生物膜形成的內植物材料或涂層的重要性不言而喻。目前已有多種材料包括季銨化合物、銅離子、銀離子殼聚糖納米顆粒等[6-10]被發現有抗菌作用，作為植入物的表面活性物質。銀離子已被證明具有較強的抗菌特性，同時銀離子還可以制成銀納米顆粒（silver nanoparticle, AgNP），以改善其物理、化學和生物特性[11-12]。因其抗菌及生物特性，AgNP 在骨科領域可能用途廣泛，骨科植入物表面覆蓋 AgNP 涂層可能是一個骨科內植物感染預防及治療方案。本研究通過 AgNP 在體外環境下干預 3 種內植物材料（鈦合金、氧化鈦和不銹鋼）上的金黃色葡萄球菌生物膜實驗來評估 AgNP 能否預防或治療骨科內植物感染。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗菌株
金黃色葡萄球菌 ATCC 25923，由四川大學華西醫院實驗醫學科臨床微生物室提供，已通過基因測序。
1.1.2 AgNP
使用的 AgNP 為南京新飛納米材料科技有限公司的銀納米膠體，產品名稱：Nano silver 膠體銀；濃度：0.1 mg/mL；粒子直徑：（15±5） nm；溶劑：水。
1.1.3 內植物材料
3 種植入物材料分別是氧化鈦、鈦合金和不銹鋼（山東威高控股有限公司提供），大體見圖1。所有圓盤半徑 18 mm，厚度 3 mm，經過 2000 粒度砂紙拋光，圓盤浸泡在 0.2% 市售洗滌劑中過夜，更換洗滌劑在 40℃的超聲波浴清潔 5 min，蒸餾水沖洗 3 次，滅菌，備用。
圖1
3 種內植物材料大體觀
1.2 實驗方法
1.2.1 AgNP 對金黃色葡萄球菌浮游菌及生物膜的藥敏試驗
使用美國臨床和實驗室標準化協會描述的肉湯稀釋方法[13]確定 AgNP 對金黃色葡萄球菌的最低抑制浮游菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC）和最低抑制生物膜濃度（minimal biofilm inhibitory concentration, MBIC），并確定萬古霉素對金黃色葡萄球菌的 MBIC。菌株復蘇后，于新鮮胰酶大豆肉湯中培養 2 h，至對數生長期，加入適量新鮮 Mueller-Hinton 肉湯（Mueller-Hinton broth, MHB），使用肉湯稀釋法制備 AgNP 溶液濃度梯度，獲得 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL 的濃度梯度，現用現配。使用麥氏比濁儀將細菌濃度調整至 0.5 麥氏點（約 1×108 CFU/mL），將 0.5 麥氏點菌液使用 MHB 稀釋 50 倍，現用現配。將細菌溶液加入不同濃度的 AgNP-MHB 溶液中，比例為 50 μL 菌液與 50 μL 不同濃度梯度的 AgNP-MHB 溶液。最終細菌初始培養濃度為 5×105 CFU/mL。同時建立僅由無菌 MHB 組成的陰性對照組和僅包含細菌溶液的陽性對照組，每組重復 6 次實驗。37℃靜置培養 24 h 后，肉眼觀察 MIC。按上述方式，0.5 麥氏點菌液稀釋 100 倍，微孔板內每孔加入 100 μL 菌液，37℃靜置培養 24 h 后吸去微孔板內的菌液，無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）輕柔沖洗 3 次以洗去浮游細菌。每孔加入 150 μL AgNP-MHB 溶液以完全浸沒生物膜，AgNP-MHB 溶液濃度梯度分別為 32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL，加入不含 AgNP 的 MHB 溶液為陰性對照。每組重復 6 次實驗。37℃靜置培養 24 h，肉眼觀察 MBIC。以同法測試出萬古霉素 MBIC，以萬古霉素 MBIC 為陽性對照。吸去微孔板內的菌液，每個微孔內無菌 PBS 輕柔沖洗 3 次，自然風干使用結晶紫染色法染色，用多功能酶標儀測定 595 nm 光密度（optical density, OD）值。
1.2.2 掃描電子顯微鏡（電鏡）下觀察 AgNP 對生物膜的影響
使用直徑 10 mm 圓形玻璃蓋玻片作為載體培養生物膜，放置在 12 孔微孔板孔底部。將如前 1.2.1 所述制備 500 μL 菌液吸入孔中，然后使用 AgNP-MHB 溶液填充至 1000 μL，確保蓋玻片完全浸沒。AgNP 濃度梯度為 32、16、8、4、2 μg/mL，不含 AgNP 的無菌 MHB 為陰性對照，萬古霉素 MBIC 為陽性對照。以與 MBIC 實驗相同的方式培養。培養完成后，蓋玻片分別經過 3 次 PBS 緩慢沖洗、2.5% 戊二醛固定以及梯度乙醇脫水。實驗重復 2 次。使用離子濺射儀在每個蓋玻片上噴金染色，掃描電鏡［賽默飛世爾（中國）科技有限公司］下觀察，隨機取視野拍照。
1.2.3 AgNP 對各種骨科生物材料生物膜形成的影響
將內植物圓盤置入 12 孔微孔板中，同 1.2.1 制備菌液，每孔加入 1000 μL 菌液，完全浸沒圓盤，37℃靜置培養 24 h，取出圓盤，無菌 PBS 輕輕沖洗 3 次，放入新的 12 孔微孔板內，加入 1000 μL 不同濃度梯度的 AgNP-MHB 溶液，AgNP 濃度梯度為 32、16、8、4、2 μg/mL，每種濃度重復 6 次。37℃靜置培養 24 h 后獲得 AgNP 溶液 MBIC，同時測定生物膜 OD 值。
1.3 統計學方法
使用 SPSS 25 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，使用單因素方差分析比較實驗組間差異，若有統計學意義則使用 Tukey 事后檢驗法進行組間兩兩比較，并計算兩兩之間的均數差和 95%置信區間。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 AgNP MIC 實驗結果
AgNP 對金黃色葡萄球菌的 MIC 為 16 μg/mL。
2.2 AgNP MBIC 實驗結果
AgNP 對金黃色葡萄球菌的 MBIC 為 16 μg/mL。陽性對照萬古霉素的 MBIC 為 64 μg/mL。AgNP 干預金黃色葡萄球菌生物膜的 OD 值見表1。
表1
AgNP 干預金黃色葡萄球菌生物膜的 OD 值（n=6）
2.3 掃描電鏡下觀察 AgNP 抑制細菌生物膜
在沒有 AgNP 的情況下（0 μg/mL 濃度，陰性對照組），細菌形成大量簇狀結構，證明該菌株在沒有任何阻礙因素的情況下具有形成生物膜的能力。除去呈蘑菇狀的簇狀生物膜結構，還觀察到大量的浮游菌。在陽性對照組中無明顯簇狀生物膜形成，但仍然有一定的菌量。在低濃度的 AgNP（2 μg/mL）干預下，形成的細菌數量沒有顯著減少，大多數細菌仍然存在于形成的生物膜簇中。在 4 μg/mL 濃度時，盡管周圍浮游細菌顯著減少，但觀察到的情況幾乎相同，其中仍觀察到生物膜。在 8 μg/mL 時，生物膜形成減少，大量浮游菌仍可見，且有形成菌落的趨勢。在作為 MBIC 值的 16 μg/mL 時，生物膜形成受到明顯抑制，浮游菌明顯減少。在 32 μg/mL AgNP 的濃度下，未見浮游菌生長。見圖2。
圖2
AgNP 生物膜處理的掃描電子顯微鏡結果
a. 32 μg/mL AgNP 干預（×1000）；b. 32 μg/mL AgNP 干預（×3000）；c. 16 μg/mL AgNP 干預（×1000）；d. 16 μg/mL AgNP 干預（×3000）；e. 8 μg/mL AgNP 干預（×1000）；f. 8 μg/mL AgNP 干預（×3000）；g. 4 μg/mL AgNP 干預（×1000）；h. 4 μg/mL AgNP 干預（×3000）；i. 2 μg/mL AgNP 干預（×1000）；j. 2 μg/mL AgNP 干預（×3000）；k. 無 AgNP 干預（×1000）；l. 無 AgNP 干預（×3000）；m. 64 μg/mL 萬古霉素干預（×1000）；n. 64 μg/mL 萬古霉素干預（×3000）。AgNP：銀納米顆粒
2.4 AgNP 對不同骨科生物材料上生物膜的影響
AgNP 在氧化鈦上 MBIC 為 16 μg/mL，在鈦合金和不銹鋼材料上 MBIC 為 32 μg/mL。3 種材料中，氧化鈦上 OD 值最低，鈦合金上 OD 值最高。在 MBIC 時，鈦合金 OD 值幾乎是不銹鋼的 2 倍，而在低于 MBIC 濃度下鈦合金 OD 值是氧化鈦和不銹鋼材料的 2～3 倍。單因素方差分析顯示，在不同的濃度 AgNP 及陰性對照和陽性對照處理下，3 種生物材料上生物膜 OD 值差異均有統計學意義（P<0.05）。Turkey 法兩兩比較結果顯示，在 AgNP 8 μg/mL 濃度時氧化鈦和不銹鋼上 OD 值比較，兩者差異無統計學意義（P>0.05），其余組間兩兩比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2、3。
表2
不同濃度 AgNP 時不同骨科生物材料上生物膜 OD 值比較（n=6）
表3
不同濃度 AgNP 時不同骨科生物材料上生物膜 OD 值的兩兩比較（n=6）
3 討論
銀已被證明具有根除多種微生物（包括細菌、真菌和病毒）的能力[14]。銀通過釋放銀離子，與細菌的各種成分（如細胞壁、細胞膜和細菌 DNA）結合并中斷 DNA 的復制而發揮抗菌作用[15-16]。由于尺寸小，納米粒子可與周圍生物環境相互作用，其中小于 100 nm 的結構被證明可以改變或增強生物反應[17-19]。顆粒的大小和分布決定了 AgNP 的許多特征，例如毒性、生物學結果和特異性靶向能力[20]。較小的顆粒更容易與細胞和其他身體成分相互作用，能夠輕松穿過血腦屏障、細胞壁和細胞膜等結構。本研究選擇使用（15±5） nm 的顆粒，這一尺寸可以達到理想的效果，文獻中使用的顆粒直徑范圍為 5～40 nm[21-22]。
本實驗通過掃描電鏡發現，AgNP 不僅抑制生物膜形成，而且高濃度時還顯著降低細菌黏附。值得注意的是，本研究中 MBIC 和 MIC 的濃度基本相等，這表明 AgNP 具有很強的抗生物膜特性。Mala 等[23]的研究中 AgNP 在尿管涂層表面也顯示出這種特性。掃描電鏡觀察顯示，在 32 μg/mL 和 16 μg/mL 的濃度下，AgNP 顯示出了完全的生物膜抑制能力；但隨著濃度降低，菌落逐漸增加。在某些研究中，濃度低于 50 μg/mL 的 AgNP 可以表現出良好的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌生物膜活性[24]。在另一項使用安息香膠提取物形成的 AgNP 干預大腸埃希菌生物膜研究中，研究者發現 AgNP 在 10 μg/mL 濃度時就表現出了抗生物膜活性[25]。AgNP 抑制細菌生物膜的機制尚不清楚。Qin 等[26]在鈦內植物表面修飾 AgNP 的研究表明，AgNP 可抑制細菌對內植物表面的黏附，這一作用可能是通過抑制 icaAD 基因的轉錄來實現的。
本實驗中，我們將 MBIC 濃度的萬古霉素設置為陽性對照。雖然在陽性對照中可以看到抗菌作用，但在同樣的濃度與 AgNP 相比，抑菌效果欠佳。
鈦及其變體和不銹鋼是最常用的骨科生物材料。鈦由于其良好的生物相容性而成為目前應用最廣泛的生物材料[27]。Arens 等[28]的動物實驗研究報道，不銹鋼接骨板的感染率遠高于純鈦，可能與鈦的表面光滑度、表面電荷和疏水性有關[29]。因此，為了獲得公正客觀的結果，本研究中的所有內植物必須事先拋光以獲得均勻的表面光滑度，以盡可能減少由材料表面光滑度引起的誤差。Schildhauer 等[30]研究表明，與純鈦相比，金黃色葡萄球菌對鈦合金的黏附性明顯更高。Malhotra 等[31]研究也表明，與其他生物材料相比，細菌對鈦合金的附著力較高。本研究結果也發現，細菌對鈦合金的附著力較高，MBIC 為 32 μg/mL，其生物膜 OD 值最高；而氧化鈦 MBIC 為 16 μg/mL，這也表明細菌對氧化鈦的附著力較低。氧化鈦是通過鈦原子電解成四價鈦離子，與氧結合，在表面形成氧化層[32]。與鈦合金和不銹鋼相比，氧化鈦 OD 值最低。鈦氧化過程中形成的氧化膜可能是細菌在表面附著減少的原因。Sharma 等[33]提出了銀納米與氧化鈦的相互作用：氧化鈦能促進 AgNP 釋放銀離子，從而增加納米顆粒的殺菌作用，并且具有降低 AgNP 毒性的能力。這跟我們的結果相符而且能解釋為什么氧化鈦具有最低的生物膜附著力。
相關臨床研究表明，使用銀處理醫療器械后細菌污染可有所減少[34-36]。Paná?ek 等[37]研究發現 AgNP 不同于一般抗菌藥物抗感染等機制，使其可作為一種治療耐藥菌株（如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）的有效替代方案。但 AgNP 的主要缺點是其潛在的毒性，但這還具有爭議。大多數研究認為 AgNP 具有毒性，毒性取決于其大小、形狀和濃度[38]。有研究在大鼠中靜脈注射 AgNP 以監測 20～100 nm 大小顆粒的毒性作用，結果顯示脾臟顯著增大，T 和 B 細胞數量增加，表明較大的顆粒具有嚴重的副作用[39]。本研究使用 AgNP 多在 10～20 nm，這一規格的 AgNP 毒性還需要后續實驗繼續研究。
綜上所述，與氧化鈦和不銹鋼相比，鈦合金上生物膜形成最多，而氧化鈦上最少，不銹鋼則介于兩者之間。AgNP 具有很強的抗菌和抗生物膜特性，可有效抑制內植物上的生物膜形成，但其生物毒性還需進一步研究。根據本研究結果，氧化鈦最適合進行表面改性，因為它與 AgNP 的協同作用具有最好的結果。AgNP 直接修飾植入物以及它們在體內環境中的行為有待進一步研究。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
