引用本文： 鄧志鵬, 王林楠, 張莊, 楊曦, 宋躍明, 汪雷. NEP1-40 和 NT-3 基因共轉染施萬細胞來源外泌體對神經干細胞存活與分化的影響. 華西醫學, 2022, 37(7): 1041-1049. doi: 10.7507/1002-0179.202110120 復制
神經干細胞（neural stem cell，NSC）具有自我更新、多向分化和神經整合等特點，已成為一種治療脊髓損傷的極具吸引力的移植材料。然而，由于局部微環境的變化，移植的 NSC 存活率不高，同時分化為神經元及軸突生長的效率低下[1]。施萬細胞來源外泌體（Schwann cell-derived exosome，SCDE）可參與神經保護、軸突發芽和髓鞘再生[2]。Nogo 胞外肽端殘基 1-40（Nogo extracellular peptide residues 1-40，NEP1-40）是 Nogo 蛋白受體的競爭性拮抗劑，可阻斷 Nogo 蛋白和中樞髓鞘相關蛋白對軸突生長的抑制作用，但對于 NSC 移植后的分化無明顯誘導作用，且對于軸突的生長缺乏必要的營養作用[3]。神經營養因子 3（neurotrophin 3，NT-3）屬于神經生長因子家族，可營養外周和中樞神經系統的神經細胞，促進 NSC 的存活和分化[4]。SCDE 與治療因子 NEP1-40 及 NT-3 的組合可能解決 NSC 移植后的治療缺陷，但目前研究僅限 SCDE 對單一治療因子的加載[5]，能否同時加載 2 種目的因子還需進一步討論。另外盡管研究已明確 NT-3 對 NSC 的作用[4]，但與 NEP1-40 組合后是否也可促進 NSC 的存活與分化尚不清楚。本研究從基因工程角度出發，用 NEP1-40 和 NT-3 雙基因修飾施萬細胞后提取其外泌體并進行鑒定，體外觀察 SCDE 對 NSC 存活與分化的影響，為后續的 SCDE 與 NSC 共移植治療脊髓損傷的體內試驗奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料和儀器
主要材料包括：大鼠施萬細胞（RSC96）細胞系（武漢普諾賽生命科技有限公司）；ExoQuick-TC 外泌體提取試劑盒（美國 Invitrogen 公司）；CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒（日本同仁化學研究所）；CD63、flotillin-1、NEP1-40、NT-3 第一抗體（美國 Proteintech Group 公司）、神經元特異核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）第一抗體（英國 Abcam 公司）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）第一抗體（英國 Abcam 公司）、半乳糖神經酰胺酶（galactosylceramidase，GALC）第一抗體（英國 Abcam 公司）、10%胎牛血清（美國 Gibco 公司）、營養混合液 F-12（美國 Sigma 公司）；NEP1-40 基因慢病毒表達載體及 NT-3 基因慢病毒表達載體為本實驗室前期構建[6]。NSC 采用改良培養法成功培養的 Sprague-Dawley 大鼠室管膜區腦源性 NSC，提取與鑒定為本實驗室前期構建[6-7]。研究獲得四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準（倫理號為 2021493A）。
主要儀器包括：XDS-1A 光學顯微鏡（北京泰克匯光科技有限公司）、XDS-2 倒置生物顯微鏡（北京泰克匯光科技有限公司）、ABI QuantStudio 6 實時熒光定量聚合酶鏈反應儀（美國賽默飛世爾科技公司）、Thermo 酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）、Tecnai G2 生物型透射電子顯微鏡（電鏡）（美國 FEI 公司）、ZetaView 納米粒子追蹤分析儀（德國 Particle Metrix 公司）、水平電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 NEP1-40 及 NT-3 雙基因轉染施萬細胞
取對數生長期的施萬細胞，首先使用感染復數為 10 的 NEP1-40 慢病毒載體轉染 48 h，熒光顯微鏡觀察轉染后細胞內熒光表達情況；然后以同樣的方法完成 NT-3 轉染 48 h，根據熒光陽性率確定感染效率。慢病毒轉染細胞的感染復數與轉染時間由前期實驗確定[8]。其中 NEP1-40 帶增強型綠色熒光蛋白標簽，NT-3 帶 mCherry（紅色熒光蛋白）標簽。再通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（所用引物序列見表1）及蛋白質印跡法（以β-actin 為內參），檢測并比較空載質粒轉染施萬細胞（空載質粒組）與 NEP1-40 和 NT-3 雙基因轉染施萬細胞（雙基因組）的信使 RNA 和蛋白質表達差異，結果以目標信使 RNA/內參和目標蛋白/內參表示信使 RNA 和蛋白質的相對表達水平。
表1
實時熒光定量聚合酶鏈反應所用引物序列
1.2.2 雙基因轉染 SCDE 中 NEP1-40 及 NT-3 的表達
① 雙基因轉染 SCDE 的提取和鑒定：培養轉染成功的施萬細胞，利用 ExoQuick-TC 試劑盒提取施萬細胞培養基上清中的外泌體：培養基先經 3 000×g 離心 15 min，去除凋亡細胞和細胞碎片。每 10 mL 培養上層清液中加入 3.3 mL 外泌體沉淀溶液后冷藏過夜，然后將混合液體 10 000×g 離心 30min，棄上層清液；分離的外泌體重懸于磷酸緩沖鹽溶液，儲存于?80℃或直接使用。利用透射電鏡觀察外泌體形態，納米粒子追蹤分析技術分析外泌體直徑分布。
② 檢測 SCDE 中 NEP1-40 及 NT-3 的表達：采用蛋白質印跡法檢測 SCDE 中 NEP1-40、NT-3 蛋白的含量，同時檢測外泌體特異性標志物 CD63 蛋白的含量，以 flotillin-1 為內參，結果以目標蛋白/內參表示蛋白質的相對表達水平。
1.2.3 雙基因轉染 SCDE 對 NSC 存活和分化的影響
選取傳代 3 次的 NSC，以每孔 1.5×105/mL 的密度接種到 24 孔板中，分為常規培養組、單純外泌體培養組和雙基因外泌體培養組。各組分化培養液為：常規培養組（10%胎牛血清+營養混合液 F-12）、單純外泌體培養組（10%胎牛血清+營養混合液 F-12+200 μg 空載質粒修飾 SCDE）、雙基因外泌體培養組（10%胎牛血清+營養混合液 F-12+200 μg NEP1-40 和 NT-3 修飾 SCDE）。取各組細胞懸液 100 μL 接種于 96 孔板中，向每孔中加入 10 μL CCK-8 試劑溶液；培養箱內孵育 4 h。采用酶標儀測定 OD450（450nm 波長的光密度），其值大小代表細胞活性。將各組細胞共培養 7 d 后，通過免疫熒光檢測 NeuN、GFAP 和 GALC 陽性的細胞來評價細胞的存活與分化情況，其中 NeuN 用于判斷 NSC 分化為神經元的情況，GFAP 用于判斷 NSC 分化為星形膠質細胞的情況，GALC 用于判斷 NSC 分化為少突膠質細胞。用 Image J 軟件進行細胞計數。評價細胞存活時，以常規培養組為對照組，計算方法為觀察組染色陽性細胞數/常規培養組染色陽性細胞數，計數結果以相對值表示。評價分化情況時，計算方法為各組染色陽性細胞數/各組細胞總數，計算結果以相對百分比表示。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行分析。計量資料使用均數±標準差表示，滿足正態分布且方差齊性時，兩組之間的數據比較采用 t 檢驗，方差不齊時采用 t’檢驗；多組之間的數據比較采用單因素方差分析，多組比較差異有統計學意義時，兩兩比較采用 LSD 檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 雙基因轉染施萬細胞的信使 RNA 和蛋白表達情況
NEP1-40 轉染施萬細胞 48 h 后，再進行 NT-3 轉染 48 h。由圖1可見，2 種基因的熒光強度均較高，同時細胞形態較好。雙基因組 NEP1-40 和 NT-3 的信使 RNA 和蛋白相對表達水平均高于空載質粒組（P<0.05），見圖2 和表2。
圖1
NEP1-40 和 NT-3 分步轉染施萬細胞的倒置熒光顯微鏡下圖像（自帶熒光標簽 ×100）
圖2
蛋白質印跡法檢測施萬細胞的蛋白表達條帶圖
表2
施萬細胞的信使 RNA 和蛋白相對表達水平（n=3，
）
2.2 雙基因轉染 SCDE 中 NEP1-40 及 NT-3 的表達
透射電鏡觀察可見 SCDE 是一種類圓形雙層膜包裹的小囊泡，內部含低電子密度物質（圖3a）；納米粒子追蹤分析技術顯示，大多數外泌體直徑為 50～200 nm，其中濃度最高的外泌體直徑是 117.4 nm。雙基因組 SCDE 中 NEP1-40 和 NT-3 的蛋白相對表達水平均高于空載質粒組（P<0.05），兩組的 SCDE 中 CD63 的蛋白相對表達水平差異無統計學意義（P>0.05），見圖3b 和表3。
圖3
SCDE 相關圖像
a. SCDE 透射電鏡圖（白箭為外泌體）；b. 蛋白質印跡法檢測 SCDE 的蛋白表達條帶圖
表3
SCDE 中蛋白的相對表達水平（n=3，
）
2.3 SCDE 對 NSC 存活與分化的影響
細胞活性方面，雙基因外泌體培養組細胞活性最強，單純外泌體培養組次之，常規培養組最弱，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。細胞存活情況方面，雙基因外泌體培養組的 NeuN 陽性細胞和 GALC 陽性細胞存活情況最佳，單純外泌體培養組次之，常規培養組最差，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）；常規培養組的 GFAP 陽性細胞存活情況最佳，單純外泌體培養組次之，雙基因外泌體培養組最差，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。細胞分化情況方面，雙基因外泌體培養組的 NeuN 陽性細胞和 GALC 陽性細胞分化情況最佳，單純外泌體培養組次之，常規培養組最差，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）；常規培養組的 GFAP 陽性細胞分化情況最佳，單純外泌體培養組次之，雙基因外泌體培養組最差，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表4 和圖4～6。
表4
各組細胞活性、存活與分化情況（n=3，
）
圖4
NSC 向神經元定向分化結果的倒置熒光顯微鏡下圖像（×200）
DAPI：4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚染色；NeuN：神經元特異核蛋白熒光染色；Merge：“DAPI”圖和“NeuN”圖疊加
圖5
NSC 向少突膠質細胞定向分化結果的倒置熒光顯微鏡下圖像（×200）
DAPI：4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚染色；GALC：半乳糖神經酰胺酶熒光染色；Merge：“DAPI”圖和“GALC”圖疊加
圖6
NSC 向星形膠質細胞定向分化結果的倒置熒光顯微鏡下圖像（×200）
DAPI：4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚染色；GFAP：膠質纖維酸性蛋白熒光染色；Merge：“DAPI”圖和“GFAP”圖疊加
3 討論
NSC 移植修復脊髓損傷是一種可行、有效的方法[9]。但隨著相關研究工作的深入，近年來發現由于脊髓損傷處局部微環境的影響，單純的 NSC 移植存在諸多缺陷[10]，主要表現為移植細胞存活有限、神經元分化效率低下、軸突生長受抑。隨著研究的進展，經過基因調控的 NSC 移植一度成為研究熱點[11]。通過轉基因技術將特定的基因片段導入細胞中，可使其在移植部位表達，改善局部微環境，以維持細胞的生存和增殖。Nogo 蛋白是一種重要的軸突生長抑制蛋白，通過與其受體 Nogo 蛋白受體結合，激活下游信號 RhoA/ROCK 通路，從而抑制軸突再生[3]。研究報道，在動物模型中，通過功能阻斷抗體、使 Nogo 蛋白基因缺失或阻滯 Nogo 蛋白受體的中和作用，既能促進受損纖維束的再生，也能促進受損皮質脊髓束和其他神經纖維的代償性萌發，而 NEP1-40 是 Nogo 蛋白受體的競爭性拮抗劑，可阻斷 Nogo 蛋白或中樞髓鞘相關蛋白對軸突生長的抑制作用[12-13]。但 NEP1-40 對 NSC 移植后的分化無明顯誘導作用，同時其對于軸突的生長缺乏必要的營養作用[7]。NT-3 屬于神經生長因子家族，是編碼外周神經系統和中樞神經系統神經元的營養蛋白，在脊髓損傷動物模型中，NT-3 已被發現能夠促進 NSC 的長期存活和增殖，并具有較高的 NSC 向神經元分化的分化率[4]。我們前期成功構建了 NEP1-40 和 NT-3 雙基因修飾的 NSC，并用于脊髓損傷的修復，雖然取得了一定成果，但同時也發現該方法存在一些問題，如致瘤風險增加、細胞活性下降、慢病毒本身的危險性、脊髓損傷局部缺乏有效的微環境的支持和引導等[10]。以上不足大大限制了 NSC 在脊髓損傷修復上的應用，使得我們不得不進一步探索新的 NSC 調控方法。
外泌體在調控 NSC 方面具有重要作用，一方面外泌體具有定向分化的作用，張姣飛等[14]將不同濃度的人羊膜上皮干細胞來源外泌體與小鼠 NSC 共培養。結果顯示，與對照組相比，人羊膜上皮干細胞來源外泌體處理后的 NSC 中有更多的神經元分化，推測可能是由于外泌體中所含活性物質，如神經營養因子、生長因子、微 RNA 等，可能參與 NSC 的分化調控。另一方面，外泌體對 NSC 具有促增殖作用，Zhang等[15]發現人臍靜脈內皮細胞可分泌外泌體，當與 NSC 共培養時，NSC 的增殖增加，而凋亡減少，同時保持了其多向分化的潛能。同樣地，周少婷等[16]的研究也有類似的結果，其發現微血管內皮細胞外泌體能夠提高 NSC 活性，促進其增殖。
施萬細胞是外周神經系統的髓鞘膠質細胞，可引導周圍神經損傷后的軸突再生，施萬細胞與 NSC 聯合移植治療脊髓損傷可引起明顯的神經發生和功能恢復[17-19]。近期越來越多的研究發現施萬細胞參與修復神經損傷主要是分泌外泌體的結果，外泌體中含有利于神經細胞存活和軸突生長的物質[2, 20-21]。外泌體是一種直徑為 30～200 nm 的細胞外小泡，由磷脂雙層膜構成，包裹并保護其所攜帶的核酸、蛋白質和脂質，它們通過細胞的胞吐作用來調節靶向受體細胞[22]。外泌體被廣泛應用于組織再生、藥物、基因傳遞以及疾病診斷等方面的研究。對于脊髓損傷，SCDE 可能是一種新的治療策略。通過 SCDE 的蛋白質組學分析，Wei 等[23]鑒定出 10 種與中樞神經系統修復密切相關的蛋白和 2 種與炎癥抑制相關的蛋白；同時，通過基因組學分析，他們指出外泌體主要參與信號轉導和細胞間通訊，在中樞神經系統修復中發揮重要作用。Lopez-Leal 等[24]對 SCDE 進行了基因測序，觀察到促再生基因在外泌體中高度富集，同時外泌體中含有控制神經生長的微 RNA。由此，他們推測 SCDE 可能參與軸突再生的過程，促進神經損傷修復。但直接使用 SCDE 觀察到其對 NSC 分化能力的改善程度較低，直接將施萬細胞與 NSC 共移植的修復效率不高[25-26]，這可能因為參與修復神經損傷的的因子所占比例太低且量太少，因此直接應用 SCDE 修復脊髓損傷的效率可能不高。而利用基于親代細胞的工程方法設計外泌體，利用基因工程技術將治療性分子加載到外泌體，可能是解決這一問題的有效的生物技術治療策略[27]。
本研究通過將含有 NEP1-40 和 NT-3 基因的慢病毒轉染入施萬細胞，分別在核酸水平和蛋白表達水平進行了實驗。實時熒光定量聚合酶鏈反應結果表明，NEP1-40 和 NT-3 兩種目的基因均成功轉染入施萬細胞，同時通過蛋白質印跡法檢測蛋白質表達情況的結果顯示，施萬細胞能表達兩種目的基因編碼的蛋白。通過外泌體提取與鑒定，說明外泌體能夠有效地運載目的基因 NEP1-40 與 NT-3 的蛋白產物。
NeuN 主要表達于成熟的神經元細胞核，是神經元成熟的標志。本研究結果顯示，雙基因外泌體培養組 NeuN 陽性染色細胞較常規培養組、單純外泌體培養組明顯增多，提示神經元的分化增殖受到促進，這為神經修復提供了根本基礎。GALC 主要存在于中樞神經系統的少突膠質細胞中，是少突膠質細胞的特異性標志物，少突膠質細胞是中樞神經系統的髓鞘形成細胞，維持神經元正常的電生理傳導功能，促進少突膠質細胞的存活，還可促進髓鞘再生及脊髓損傷后的神經恢復[28]。本研究結果顯示，雙基因外泌體培養組 GALC 陽性染色細胞較常規培養組、單純外泌體培養組明顯增多，提示少突膠質細胞的分化增殖受到促進。GFAP 主要存在于中樞神經系統的星形膠質細胞中，是星形膠質細胞的特異性標志物，脊髓損傷后星形膠質細胞活化并分泌多種細胞外基質，共同組成膠質瘢痕，是阻礙神經軸突再生的重要因素[29]。本研究結果顯示，雙基因外泌體培養組 GFAP 陽性染色細胞較常規培養組、單純外泌體培養組明顯減少，提示星形膠質細胞的分化增殖受到抑制，這有利于軸突再生及神經功能恢復。此外，本研究對常規培養組、單純外泌體培養組、雙基因外泌體培養組中 NeuN 與 GFAP 陽性細胞百分比進行了比較，差異均具有統計學意義，說明 NEP1-40 和 NT-3 基因共轉導 SCDE 可促進 NSC 的定向分化。
綜上，本實驗針對單純 NSC 移植的不足，從基因工程角度進行了新方法的探索和研究，結果提示 NEP1-40 和 NT-3 基因共轉染 SCDE 在體外能有效促進 NSC 的定向分化與存活。但本研究未驗證 NEP1-40 對軸突生長的促進作用，后續我們將在大鼠脊髓損傷模型中討論軸突的再生及其對大鼠脊髓損傷后行為學恢復的影響。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
神經干細胞（neural stem cell，NSC）具有自我更新、多向分化和神經整合等特點，已成為一種治療脊髓損傷的極具吸引力的移植材料。然而，由于局部微環境的變化，移植的 NSC 存活率不高，同時分化為神經元及軸突生長的效率低下[1]。施萬細胞來源外泌體（Schwann cell-derived exosome，SCDE）可參與神經保護、軸突發芽和髓鞘再生[2]。Nogo 胞外肽端殘基 1-40（Nogo extracellular peptide residues 1-40，NEP1-40）是 Nogo 蛋白受體的競爭性拮抗劑，可阻斷 Nogo 蛋白和中樞髓鞘相關蛋白對軸突生長的抑制作用，但對于 NSC 移植后的分化無明顯誘導作用，且對于軸突的生長缺乏必要的營養作用[3]。神經營養因子 3（neurotrophin 3，NT-3）屬于神經生長因子家族，可營養外周和中樞神經系統的神經細胞，促進 NSC 的存活和分化[4]。SCDE 與治療因子 NEP1-40 及 NT-3 的組合可能解決 NSC 移植后的治療缺陷，但目前研究僅限 SCDE 對單一治療因子的加載[5]，能否同時加載 2 種目的因子還需進一步討論。另外盡管研究已明確 NT-3 對 NSC 的作用[4]，但與 NEP1-40 組合后是否也可促進 NSC 的存活與分化尚不清楚。本研究從基因工程角度出發，用 NEP1-40 和 NT-3 雙基因修飾施萬細胞后提取其外泌體并進行鑒定，體外觀察 SCDE 對 NSC 存活與分化的影響，為后續的 SCDE 與 NSC 共移植治療脊髓損傷的體內試驗奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料和儀器
主要材料包括：大鼠施萬細胞（RSC96）細胞系（武漢普諾賽生命科技有限公司）；ExoQuick-TC 外泌體提取試劑盒（美國 Invitrogen 公司）；CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒（日本同仁化學研究所）；CD63、flotillin-1、NEP1-40、NT-3 第一抗體（美國 Proteintech Group 公司）、神經元特異核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）第一抗體（英國 Abcam 公司）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）第一抗體（英國 Abcam 公司）、半乳糖神經酰胺酶（galactosylceramidase，GALC）第一抗體（英國 Abcam 公司）、10%胎牛血清（美國 Gibco 公司）、營養混合液 F-12（美國 Sigma 公司）；NEP1-40 基因慢病毒表達載體及 NT-3 基因慢病毒表達載體為本實驗室前期構建[6]。NSC 采用改良培養法成功培養的 Sprague-Dawley 大鼠室管膜區腦源性 NSC，提取與鑒定為本實驗室前期構建[6-7]。研究獲得四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準（倫理號為 2021493A）。
主要儀器包括：XDS-1A 光學顯微鏡（北京泰克匯光科技有限公司）、XDS-2 倒置生物顯微鏡（北京泰克匯光科技有限公司）、ABI QuantStudio 6 實時熒光定量聚合酶鏈反應儀（美國賽默飛世爾科技公司）、Thermo 酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）、Tecnai G2 生物型透射電子顯微鏡（電鏡）（美國 FEI 公司）、ZetaView 納米粒子追蹤分析儀（德國 Particle Metrix 公司）、水平電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 NEP1-40 及 NT-3 雙基因轉染施萬細胞
取對數生長期的施萬細胞，首先使用感染復數為 10 的 NEP1-40 慢病毒載體轉染 48 h，熒光顯微鏡觀察轉染后細胞內熒光表達情況；然后以同樣的方法完成 NT-3 轉染 48 h，根據熒光陽性率確定感染效率。慢病毒轉染細胞的感染復數與轉染時間由前期實驗確定[8]。其中 NEP1-40 帶增強型綠色熒光蛋白標簽，NT-3 帶 mCherry（紅色熒光蛋白）標簽。再通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（所用引物序列見表1）及蛋白質印跡法（以β-actin 為內參），檢測并比較空載質粒轉染施萬細胞（空載質粒組）與 NEP1-40 和 NT-3 雙基因轉染施萬細胞（雙基因組）的信使 RNA 和蛋白質表達差異，結果以目標信使 RNA/內參和目標蛋白/內參表示信使 RNA 和蛋白質的相對表達水平。
表1
實時熒光定量聚合酶鏈反應所用引物序列
1.2.2 雙基因轉染 SCDE 中 NEP1-40 及 NT-3 的表達
① 雙基因轉染 SCDE 的提取和鑒定：培養轉染成功的施萬細胞，利用 ExoQuick-TC 試劑盒提取施萬細胞培養基上清中的外泌體：培養基先經 3 000×g 離心 15 min，去除凋亡細胞和細胞碎片。每 10 mL 培養上層清液中加入 3.3 mL 外泌體沉淀溶液后冷藏過夜，然后將混合液體 10 000×g 離心 30min，棄上層清液；分離的外泌體重懸于磷酸緩沖鹽溶液，儲存于?80℃或直接使用。利用透射電鏡觀察外泌體形態，納米粒子追蹤分析技術分析外泌體直徑分布。
② 檢測 SCDE 中 NEP1-40 及 NT-3 的表達：采用蛋白質印跡法檢測 SCDE 中 NEP1-40、NT-3 蛋白的含量，同時檢測外泌體特異性標志物 CD63 蛋白的含量，以 flotillin-1 為內參，結果以目標蛋白/內參表示蛋白質的相對表達水平。
1.2.3 雙基因轉染 SCDE 對 NSC 存活和分化的影響
選取傳代 3 次的 NSC，以每孔 1.5×105/mL 的密度接種到 24 孔板中，分為常規培養組、單純外泌體培養組和雙基因外泌體培養組。各組分化培養液為：常規培養組（10%胎牛血清+營養混合液 F-12）、單純外泌體培養組（10%胎牛血清+營養混合液 F-12+200 μg 空載質粒修飾 SCDE）、雙基因外泌體培養組（10%胎牛血清+營養混合液 F-12+200 μg NEP1-40 和 NT-3 修飾 SCDE）。取各組細胞懸液 100 μL 接種于 96 孔板中，向每孔中加入 10 μL CCK-8 試劑溶液；培養箱內孵育 4 h。采用酶標儀測定 OD450（450nm 波長的光密度），其值大小代表細胞活性。將各組細胞共培養 7 d 后，通過免疫熒光檢測 NeuN、GFAP 和 GALC 陽性的細胞來評價細胞的存活與分化情況，其中 NeuN 用于判斷 NSC 分化為神經元的情況，GFAP 用于判斷 NSC 分化為星形膠質細胞的情況，GALC 用于判斷 NSC 分化為少突膠質細胞。用 Image J 軟件進行細胞計數。評價細胞存活時，以常規培養組為對照組，計算方法為觀察組染色陽性細胞數/常規培養組染色陽性細胞數，計數結果以相對值表示。評價分化情況時，計算方法為各組染色陽性細胞數/各組細胞總數，計算結果以相對百分比表示。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行分析。計量資料使用均數±標準差表示，滿足正態分布且方差齊性時，兩組之間的數據比較采用 t 檢驗，方差不齊時采用 t’檢驗；多組之間的數據比較采用單因素方差分析，多組比較差異有統計學意義時，兩兩比較采用 LSD 檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 雙基因轉染施萬細胞的信使 RNA 和蛋白表達情況
NEP1-40 轉染施萬細胞 48 h 后，再進行 NT-3 轉染 48 h。由圖1可見，2 種基因的熒光強度均較高，同時細胞形態較好。雙基因組 NEP1-40 和 NT-3 的信使 RNA 和蛋白相對表達水平均高于空載質粒組（P<0.05），見圖2 和表2。
圖1
NEP1-40 和 NT-3 分步轉染施萬細胞的倒置熒光顯微鏡下圖像（自帶熒光標簽 ×100）
圖2
蛋白質印跡法檢測施萬細胞的蛋白表達條帶圖
表2
施萬細胞的信使 RNA 和蛋白相對表達水平（n=3，）
2.2 雙基因轉染 SCDE 中 NEP1-40 及 NT-3 的表達
透射電鏡觀察可見 SCDE 是一種類圓形雙層膜包裹的小囊泡，內部含低電子密度物質（圖3a）；納米粒子追蹤分析技術顯示，大多數外泌體直徑為 50～200 nm，其中濃度最高的外泌體直徑是 117.4 nm。雙基因組 SCDE 中 NEP1-40 和 NT-3 的蛋白相對表達水平均高于空載質粒組（P<0.05），兩組的 SCDE 中 CD63 的蛋白相對表達水平差異無統計學意義（P>0.05），見圖3b 和表3。
圖3
SCDE 相關圖像
a. SCDE 透射電鏡圖（白箭為外泌體）；b. 蛋白質印跡法檢測 SCDE 的蛋白表達條帶圖
表3
SCDE 中蛋白的相對表達水平（n=3，）
2.3 SCDE 對 NSC 存活與分化的影響
細胞活性方面，雙基因外泌體培養組細胞活性最強，單純外泌體培養組次之，常規培養組最弱，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。細胞存活情況方面，雙基因外泌體培養組的 NeuN 陽性細胞和 GALC 陽性細胞存活情況最佳，單純外泌體培養組次之，常規培養組最差，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）；常規培養組的 GFAP 陽性細胞存活情況最佳，單純外泌體培養組次之，雙基因外泌體培養組最差，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。細胞分化情況方面，雙基因外泌體培養組的 NeuN 陽性細胞和 GALC 陽性細胞分化情況最佳，單純外泌體培養組次之，常規培養組最差，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）；常規培養組的 GFAP 陽性細胞分化情況最佳，單純外泌體培養組次之，雙基因外泌體培養組最差，組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表4 和圖4～6。
表4
各組細胞活性、存活與分化情況（n=3，）
圖4
NSC 向神經元定向分化結果的倒置熒光顯微鏡下圖像（×200）
DAPI：4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚染色；NeuN：神經元特異核蛋白熒光染色；Merge：“DAPI”圖和“NeuN”圖疊加
圖5
NSC 向少突膠質細胞定向分化結果的倒置熒光顯微鏡下圖像（×200）
DAPI：4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚染色；GALC：半乳糖神經酰胺酶熒光染色；Merge：“DAPI”圖和“GALC”圖疊加
圖6
NSC 向星形膠質細胞定向分化結果的倒置熒光顯微鏡下圖像（×200）
DAPI：4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚染色；GFAP：膠質纖維酸性蛋白熒光染色；Merge：“DAPI”圖和“GFAP”圖疊加
3 討論
NSC 移植修復脊髓損傷是一種可行、有效的方法[9]。但隨著相關研究工作的深入，近年來發現由于脊髓損傷處局部微環境的影響，單純的 NSC 移植存在諸多缺陷[10]，主要表現為移植細胞存活有限、神經元分化效率低下、軸突生長受抑。隨著研究的進展，經過基因調控的 NSC 移植一度成為研究熱點[11]。通過轉基因技術將特定的基因片段導入細胞中，可使其在移植部位表達，改善局部微環境，以維持細胞的生存和增殖。Nogo 蛋白是一種重要的軸突生長抑制蛋白，通過與其受體 Nogo 蛋白受體結合，激活下游信號 RhoA/ROCK 通路，從而抑制軸突再生[3]。研究報道，在動物模型中，通過功能阻斷抗體、使 Nogo 蛋白基因缺失或阻滯 Nogo 蛋白受體的中和作用，既能促進受損纖維束的再生，也能促進受損皮質脊髓束和其他神經纖維的代償性萌發，而 NEP1-40 是 Nogo 蛋白受體的競爭性拮抗劑，可阻斷 Nogo 蛋白或中樞髓鞘相關蛋白對軸突生長的抑制作用[12-13]。但 NEP1-40 對 NSC 移植后的分化無明顯誘導作用，同時其對于軸突的生長缺乏必要的營養作用[7]。NT-3 屬于神經生長因子家族，是編碼外周神經系統和中樞神經系統神經元的營養蛋白，在脊髓損傷動物模型中，NT-3 已被發現能夠促進 NSC 的長期存活和增殖，并具有較高的 NSC 向神經元分化的分化率[4]。我們前期成功構建了 NEP1-40 和 NT-3 雙基因修飾的 NSC，并用于脊髓損傷的修復，雖然取得了一定成果，但同時也發現該方法存在一些問題，如致瘤風險增加、細胞活性下降、慢病毒本身的危險性、脊髓損傷局部缺乏有效的微環境的支持和引導等[10]。以上不足大大限制了 NSC 在脊髓損傷修復上的應用，使得我們不得不進一步探索新的 NSC 調控方法。
外泌體在調控 NSC 方面具有重要作用，一方面外泌體具有定向分化的作用，張姣飛等[14]將不同濃度的人羊膜上皮干細胞來源外泌體與小鼠 NSC 共培養。結果顯示，與對照組相比，人羊膜上皮干細胞來源外泌體處理后的 NSC 中有更多的神經元分化，推測可能是由于外泌體中所含活性物質，如神經營養因子、生長因子、微 RNA 等，可能參與 NSC 的分化調控。另一方面，外泌體對 NSC 具有促增殖作用，Zhang等[15]發現人臍靜脈內皮細胞可分泌外泌體，當與 NSC 共培養時，NSC 的增殖增加，而凋亡減少，同時保持了其多向分化的潛能。同樣地，周少婷等[16]的研究也有類似的結果，其發現微血管內皮細胞外泌體能夠提高 NSC 活性，促進其增殖。
施萬細胞是外周神經系統的髓鞘膠質細胞，可引導周圍神經損傷后的軸突再生，施萬細胞與 NSC 聯合移植治療脊髓損傷可引起明顯的神經發生和功能恢復[17-19]。近期越來越多的研究發現施萬細胞參與修復神經損傷主要是分泌外泌體的結果，外泌體中含有利于神經細胞存活和軸突生長的物質[2, 20-21]。外泌體是一種直徑為 30～200 nm 的細胞外小泡，由磷脂雙層膜構成，包裹并保護其所攜帶的核酸、蛋白質和脂質，它們通過細胞的胞吐作用來調節靶向受體細胞[22]。外泌體被廣泛應用于組織再生、藥物、基因傳遞以及疾病診斷等方面的研究。對于脊髓損傷，SCDE 可能是一種新的治療策略。通過 SCDE 的蛋白質組學分析，Wei 等[23]鑒定出 10 種與中樞神經系統修復密切相關的蛋白和 2 種與炎癥抑制相關的蛋白；同時，通過基因組學分析，他們指出外泌體主要參與信號轉導和細胞間通訊，在中樞神經系統修復中發揮重要作用。Lopez-Leal 等[24]對 SCDE 進行了基因測序，觀察到促再生基因在外泌體中高度富集，同時外泌體中含有控制神經生長的微 RNA。由此，他們推測 SCDE 可能參與軸突再生的過程，促進神經損傷修復。但直接使用 SCDE 觀察到其對 NSC 分化能力的改善程度較低，直接將施萬細胞與 NSC 共移植的修復效率不高[25-26]，這可能因為參與修復神經損傷的的因子所占比例太低且量太少，因此直接應用 SCDE 修復脊髓損傷的效率可能不高。而利用基于親代細胞的工程方法設計外泌體，利用基因工程技術將治療性分子加載到外泌體，可能是解決這一問題的有效的生物技術治療策略[27]。
本研究通過將含有 NEP1-40 和 NT-3 基因的慢病毒轉染入施萬細胞，分別在核酸水平和蛋白表達水平進行了實驗。實時熒光定量聚合酶鏈反應結果表明，NEP1-40 和 NT-3 兩種目的基因均成功轉染入施萬細胞，同時通過蛋白質印跡法檢測蛋白質表達情況的結果顯示，施萬細胞能表達兩種目的基因編碼的蛋白。通過外泌體提取與鑒定，說明外泌體能夠有效地運載目的基因 NEP1-40 與 NT-3 的蛋白產物。
NeuN 主要表達于成熟的神經元細胞核，是神經元成熟的標志。本研究結果顯示，雙基因外泌體培養組 NeuN 陽性染色細胞較常規培養組、單純外泌體培養組明顯增多，提示神經元的分化增殖受到促進，這為神經修復提供了根本基礎。GALC 主要存在于中樞神經系統的少突膠質細胞中，是少突膠質細胞的特異性標志物，少突膠質細胞是中樞神經系統的髓鞘形成細胞，維持神經元正常的電生理傳導功能，促進少突膠質細胞的存活，還可促進髓鞘再生及脊髓損傷后的神經恢復[28]。本研究結果顯示，雙基因外泌體培養組 GALC 陽性染色細胞較常規培養組、單純外泌體培養組明顯增多，提示少突膠質細胞的分化增殖受到促進。GFAP 主要存在于中樞神經系統的星形膠質細胞中，是星形膠質細胞的特異性標志物，脊髓損傷后星形膠質細胞活化并分泌多種細胞外基質，共同組成膠質瘢痕，是阻礙神經軸突再生的重要因素[29]。本研究結果顯示，雙基因外泌體培養組 GFAP 陽性染色細胞較常規培養組、單純外泌體培養組明顯減少，提示星形膠質細胞的分化增殖受到抑制，這有利于軸突再生及神經功能恢復。此外，本研究對常規培養組、單純外泌體培養組、雙基因外泌體培養組中 NeuN 與 GFAP 陽性細胞百分比進行了比較，差異均具有統計學意義，說明 NEP1-40 和 NT-3 基因共轉導 SCDE 可促進 NSC 的定向分化。
綜上，本實驗針對單純 NSC 移植的不足，從基因工程角度進行了新方法的探索和研究，結果提示 NEP1-40 和 NT-3 基因共轉染 SCDE 在體外能有效促進 NSC 的定向分化與存活。但本研究未驗證 NEP1-40 對軸突生長的促進作用，后續我們將在大鼠脊髓損傷模型中討論軸突的再生及其對大鼠脊髓損傷后行為學恢復的影響。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
