引用本文： 王佳, 高恒波, 林雪容, 羅肖宇, 陳麗君, 韓樹池. 血必凈注射液減輕膿毒癥誘導的小鼠急性肺損傷的作用及機制. 華西醫學, 2021, 36(11): 1533-1538. doi: 10.7507/1002-0179.202109177 復制
膿毒癥是臨床常見的危重癥，由重癥感染、大手術、嚴重創傷等引起，表現為全身炎癥反應激活，可進一步引起多臟器功能損傷及膿毒癥休克，救治難度大、死亡率高[1-2]。肺臟是膿毒癥誘發多器官功能障礙時最常見的受累臟器，表現為急性肺損傷（acute lung injury，ALI），針對膿毒癥誘發的 ALI 進行防治成為近年膿毒癥研究的熱點。血必凈注射液是由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸 5 味中藥組成的復方注射劑，臨床上被用于膿毒癥的治療，能夠顯著降低多種炎癥因子的含量并提高患者存活率[3-4]。相關的基礎研究表明，血必凈注射液對膿毒癥誘導的 ALI 具有保護作用[5-6]，但具體的分子機制尚不十分清楚。自噬是新近受到越來越多關注的生物學過程，具體指細胞通過溶酶體降解蛋白質及細胞器的過程，有利于維持細胞穩態，使細胞在感染、應激等病理因素作用下存活。有研究報道，自噬在膿毒癥誘導 ALI 的過程中明顯激活，使用自噬激動劑雷帕霉素能夠減輕膿毒癥誘導的 ALI，使用自噬抑制劑 3-甲基腺苷（3-methyladenosine，3-MA）能夠加重膿毒癥誘導的 ALI，提示自噬激活可能是膿毒癥誘導 ALI 過程中重要的保護機制[7-8]。血必凈注射液中多種有效成分羥基紅花黃素 A、丹酚酸 A、丹酚酸 B 均被證實具有激活自噬的作用[9-11]，但該注射液是否通過激活自噬在膿毒癥誘導 ALI 中發揮保護作用仍需進一步探究。因此，本研究以膿毒癥 ALI 小鼠模型為對象，分析血必凈注射液調控自噬對 ALI 的影響及機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
BALB/c 雄性小鼠共 80 只，體重 18～20 g，購自菲諾克生物科技（上海）有限公司，生產許可 SCXK（滬）2018-0005。本研究經河北北方學院附屬第一醫院醫學倫理委員會審查通過。
1.1.2 主要試劑
血必凈注射液購自天津紅日藥業股份有限公司，3-MA 購自美國 Sigma 公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）法蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 的酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海西唐公司，Beclin-1、微管相關蛋白輕鏈 3（microtubule-associated protein light chain3，LC3）的一抗購自美國 Abcam 公司。
1.1.3 主要儀器
E200 型正置顯微鏡購自日本 Nikon 公司，Elx800 型多功能酶標儀購自美國 Bio-Tek 公司，LVEM25 型透射電子顯微鏡（電鏡）購自上海研匠生物科技公司，1600R 型電泳系統及凝膠成像系統購自上海天能公司。
1.2 方法
1.2.1 動物分組、造模及給藥
將 80 只 BALB/c 雄性小鼠按照隨機數表分為對照組、模型組、血必凈組、血必凈+3-MA 組，每組各 20 只。后 3 組采用盲腸結扎穿孔術建立膿毒癥 ALI 模型，方法如下：乙醚吸入麻醉后開腹，找到盲腸后在末端用針頭刺破，而后關腹部完成造模。對照組進行麻醉、開腹、分離盲腸但不刺破的假手術操作。造模當天開始，對照組和模型組給予 10 mL/kg 生理鹽水腹腔注射、2 次/d，血必凈組給予 10 mL/kg 血必凈注射液腹腔注射、2 次/d，血必凈+3-MA 組給予 10 mL/kg 血必凈注射液及 10 mg/kg 3-MA 腹腔注射、2 次/d，均連續注射 3 d，給藥過程中觀察小鼠存活情況，末次給藥后 24 h 仍存活的小鼠采用過量麻醉的方法處死，用于取材及指標檢測。
1.2.2 肺組織的 HE 染色
取左肺組織適量，生理鹽水清洗后在 4% 多聚甲醛中固定，石蠟包埋后制作 4 μm 厚度的病理切片，采用 HE 染色試劑盒進行操作、染色后在顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。
1.2.3 肺濕重/干重比的測量
取右肺組織后稱量濕重，放入烘箱烘干至恒重后記錄干重，而后計算肺濕重/干重比。
1.2.4 肺組織中炎癥因子含量的 ELISA 檢測
取左肺組織適量，加入放射免疫沉淀試驗（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液后研磨，研磨液以轉速 12000 r/min、半徑 10 cm 離心 10 min 后取上清液，采用 BCA 試劑盒檢測蛋白含量，采用 ELISA 試劑盒檢測 TNF-α、IL-1β、IL-18 含量，而后計算每毫克蛋白中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量。
1.2.5 肺組織中自噬小體的電鏡觀察及檢測
取左肺組織適量，制成約 1 mm3 的組織塊，在 2.5% 戊二醛溶液中固定并保存，檢測時用 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液沖洗組織塊 3 次，放入 1% 鋨酸中 4℃固定 1 h，70%、80%、95%、100% 乙醇溶液梯度脫水后環氧樹脂包埋，?80℃聚合 24 h，制作 60～70 nm 厚度的切片并用 3% 檸檬酸鉛染色，最后在透射電鏡下觀察，隨機選擇 5 個視野對自噬小體進行計數。
1.2.6 肺組織中自噬基因的蛋白質印跡法檢測
取左肺組織適量，加入 RIPA 裂解液后研磨后提取蛋白，采用 BCA 試劑盒檢測蛋白含量，將含有 30 μg 蛋白的樣本用于蛋白質印跡法檢測，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，電轉移至聚偏氟乙烯膜后用 5% 脫脂牛奶在室溫封閉 1 h，4℃孵育 1∶1000 稀釋的 LC3、Beclin-1 一抗或 1∶2500 稀釋的 β-actin 一抗過夜，洗膜 3 次后室溫孵育 1∶2000 稀釋的二抗 1 h，最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶并計算灰度值，以 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1/β-actin 的比值作為蛋白表達量。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件錄入數據。4 組間小鼠生存情況采用 Kaplan-Meier 曲線表示并進行對數秩檢驗（兩兩比較采用 Bonferroni 調整檢驗水準法）；計量資料經正態性檢驗符合正態分布，以均數±標準差表示，4 組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗。本研究的兩兩比較僅進行模型組與對照組比較（反映造模效果）、血必凈組與模型組比較（反映血必凈的干預效果）以及血必凈+3-MA 組與血必凈組比較（反映 3-MA 的干預效果）。檢驗水準 α=0.05（雙側）。
2 結果
2.1 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠生存率的影響
假手術后，對照組小鼠活動、飲水均正常。造模后，模型組和血必凈+3-MA 組小鼠精神萎靡、覓食活動減少、喘息明顯；與模型組比較，血必凈組小鼠精神狀態明顯改善，覓食活動有所增加，喘息明顯減輕。72 h 內，對照組小鼠無死亡，模型組、血必凈組、血必凈+3-MA 組小鼠分別死亡 10、5、9 只，累積生存率分別為 100%、50%、75% 和 55%。4 組小鼠 72 h Kaplan-Meier 生存曲線及對數秩檢驗結果示，模型組小鼠生存率明顯低于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠明顯高于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠明顯低于血必凈組（P<0.05）。見圖1。
圖1
各組小鼠 72 h 生存的 Kaplan-Meier 曲線
*與對照組比較，
2.2 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠肺組織病理改變及肺濕重/干重比的影響
經 HE 染色觀察肺組織病理改變，對照組小鼠肺組織形態正常，模型組小鼠肺組織出現充血水腫、肺泡間隔增寬、炎癥細胞浸潤，血必凈組小鼠肺組織充血水腫、炎癥細胞浸潤的病理改變均較模型組減輕，血必凈+3-MA 組小鼠肺組織充血水腫、炎癥細胞浸潤的病理改變均較血必凈組加重。見圖2。
圖2
各組小鼠肺組織病理改變的比較（HE ×400）
a. 對照組；b. 模型組；c. 血必凈組；d. 血必凈+3-MA 組
經肺濕重/干重比的測定，模型組小鼠的肺濕重/干重比明顯高于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠的肺濕重/干重比明顯低于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠的肺濕重/干重比明顯高于血必凈組（P<0.05）。見表1。
表1
各組小鼠肺組織肺濕重/干重比、炎癥因子含量及自噬相關指標的比較（
）
2.3 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠肺組織中炎癥因子含量的影響
模型組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量均明顯高于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量均明顯低于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量均明顯高于血必凈組（P<0.05）。見表1。
2.4 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠肺組織中自噬小體形成的影響
模型組小鼠肺組織中自噬小體的數目明顯多于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠肺組織中自噬小體的數目明顯多于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠肺組織中自噬小體的數目明顯少于血必凈組（P<0.05）。見圖3、表1。
圖3
各組小鼠肺組織中自噬小體形成的電鏡觀察比較
a. 對照組；b. 模型組；c. 血必凈組；d. 血必凈+3-MA 組。N 為細胞核；白箭所指為自噬小體；白箭頭所指為自噬溶酶體
2.5 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠肺組織中自噬標志基因表達的影響
模型組小鼠肺組織中 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的表達水平均明顯高于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠肺組織中 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的表達水平均明顯高于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠肺組織中 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的表達水平均明顯低于血必凈組（P<0.05）。見圖4、表1。
圖4
各組小鼠肺組織中 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達的蛋白質印跡法檢測
a：Beclin-1 的條帶；b：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的條帶
3 討論
ALI 是膿毒癥最常見的臟器損傷之一，表現為肺組織充血水腫、炎癥細胞浸潤，可進一步引起呼吸衰竭及多器官功能障礙，死亡率高、救治難度大。血必凈注射液是用于膿毒癥治療的中藥復方注射液，臨床研究顯示，血必凈注射液用于膿毒癥的治療能減少血清炎癥因子含量、提高患者生存率[3-4]；動物實驗顯示，血必凈注射液對膿毒癥大鼠肺臟、心肌、肝臟、腎臟等多個臟器有保護作用[5-6]。本研究采用盲腸穿孔結扎術建立膿毒癥小鼠模型，造模后小鼠肺組織出現了充血水腫、炎癥細胞浸潤等典型的 ALI 病理改變且 72 h 累積生存率明顯降低，而在給予血必凈注射液干預后 ALI 病理改變減輕且 72 h 累積生存率明顯增加，表明血必凈注射液能夠在膿毒癥 ALI 過程中起到保護作用，與既往臨床研究和基礎研究中血必凈注射液的保護作用[3-6]一致。
全身炎癥反應激活、肺組織中炎癥細胞大量浸潤是造成膿毒癥患者發生 ALI 的重要病理生理環節，肺組織中浸潤的炎癥細胞能夠釋放多種炎癥細胞因子并造成肺組織損傷。TNF-α、IL-1β、IL-18 是目前已知與膿毒癥 ALI 密切相關的炎癥細胞因子，膿毒癥患者血清中 3 種細胞因子的含量以及膿毒癥小鼠肺組織中 3 種細胞因子的含量均增多[12-14]，本研究同樣發現模型組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量增加。血必凈注射液在膿毒癥中的保護作用與其抗炎活性密切相關，本研究在使用血必凈注射液治療膿毒癥 ALI 小鼠后觀察到肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量明顯減少，表明血必凈注射液能夠減輕膿毒癥 ALI 小鼠肺組織的炎癥反應，與 HE 染色觀察到炎癥細胞浸潤減少的結果一致并進一步驗證了血必凈注射液在膿毒癥 ALI 中的保護作用。
在闡明血必凈注射液對膿毒癥 ALI 的保護作用后，本研究還對相關的分子機制進行了初步探究。自噬是近些年受到越來越多關注的生物學過程，膿毒癥發病過程中自噬可能起到臟器保護作用。自噬是由溶酶體介導的細胞內吞噬，Beclin-1 和 LC3 是自噬標志基因，參與自噬小體的形成，自噬小體形成后能夠水解蛋白質及細胞器并維持細胞內穩態。在感染、應激等病理生理狀態下，自噬的激活是一把雙刃劍，適度的自噬能夠起到細胞保護作用，但過度的自噬則會引起細胞凋亡和損傷[15-16]。目前的研究認為，自噬在膿毒癥 ALI 的過程中明顯激活，且使用自噬激活劑能夠減輕 ALI，使用自噬抑制劑能夠加重 ALI，同時自噬也參與膿毒癥 ALI 過程中多種炎癥因子的調控[7-8, 17]。本研究在膿毒癥 ALI 小鼠的肺組織中觀察到自噬小體增多、自噬標志基因 Beclin-1 及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達增加，與既往研究中膿毒癥 ALI 小鼠自噬激活的結果[17]一致。
血必凈注射液提取自紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸 5 味中藥，其中的活性成分包括羥基紅花黃素 A、丹酚酸 A、丹酚酸 B 等，已有腦缺血再灌注損傷、非酒精性脂肪肝等研究發現，血必凈注射液的活性成分能夠激活自噬并減輕腦損傷、肝損傷[9-11]，提示血必凈注射液可能參與自噬的調控。本研究在使用血必凈注射液治療膿毒癥 ALI 小鼠后觀察到肺組織中自噬小體增多、自噬標志基因 Beclin-1 及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表達增加，表明血必凈注射液對膿毒癥 ALI 小鼠的自噬具有激活作用，結合自噬激活在 ALI 中的保護作用推測：激活自噬可能是血必凈注射液減輕膿毒癥 ALI 的機制。為了驗證這一推測，本研究使用了自噬抑制劑 3-MA，在血必凈注射液干預的同時加用 3-MA 后，小鼠 ALI 的病理改變加重且肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量增加，表明 3-MA 削弱了血必凈注射液對膿毒癥 ALI 的保護作用，進而提示激活自噬可能是血必凈注射液減輕膿毒癥 ALI 的分子機制之一。
綜上所述，血必凈注射液能夠減輕膿毒癥小鼠 ALI，自噬激活是血必凈注射液發揮保護作用的分子機制之一。
膿毒癥是臨床常見的危重癥，由重癥感染、大手術、嚴重創傷等引起，表現為全身炎癥反應激活，可進一步引起多臟器功能損傷及膿毒癥休克，救治難度大、死亡率高[1-2]。肺臟是膿毒癥誘發多器官功能障礙時最常見的受累臟器，表現為急性肺損傷（acute lung injury，ALI），針對膿毒癥誘發的 ALI 進行防治成為近年膿毒癥研究的熱點。血必凈注射液是由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸 5 味中藥組成的復方注射劑，臨床上被用于膿毒癥的治療，能夠顯著降低多種炎癥因子的含量并提高患者存活率[3-4]。相關的基礎研究表明，血必凈注射液對膿毒癥誘導的 ALI 具有保護作用[5-6]，但具體的分子機制尚不十分清楚。自噬是新近受到越來越多關注的生物學過程，具體指細胞通過溶酶體降解蛋白質及細胞器的過程，有利于維持細胞穩態，使細胞在感染、應激等病理因素作用下存活。有研究報道，自噬在膿毒癥誘導 ALI 的過程中明顯激活，使用自噬激動劑雷帕霉素能夠減輕膿毒癥誘導的 ALI，使用自噬抑制劑 3-甲基腺苷（3-methyladenosine，3-MA）能夠加重膿毒癥誘導的 ALI，提示自噬激活可能是膿毒癥誘導 ALI 過程中重要的保護機制[7-8]。血必凈注射液中多種有效成分羥基紅花黃素 A、丹酚酸 A、丹酚酸 B 均被證實具有激活自噬的作用[9-11]，但該注射液是否通過激活自噬在膿毒癥誘導 ALI 中發揮保護作用仍需進一步探究。因此，本研究以膿毒癥 ALI 小鼠模型為對象，分析血必凈注射液調控自噬對 ALI 的影響及機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
BALB/c 雄性小鼠共 80 只，體重 18～20 g，購自菲諾克生物科技（上海）有限公司，生產許可 SCXK（滬）2018-0005。本研究經河北北方學院附屬第一醫院醫學倫理委員會審查通過。
1.1.2 主要試劑
血必凈注射液購自天津紅日藥業股份有限公司，3-MA 購自美國 Sigma 公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）法蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 的酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海西唐公司，Beclin-1、微管相關蛋白輕鏈 3（microtubule-associated protein light chain3，LC3）的一抗購自美國 Abcam 公司。
1.1.3 主要儀器
E200 型正置顯微鏡購自日本 Nikon 公司，Elx800 型多功能酶標儀購自美國 Bio-Tek 公司，LVEM25 型透射電子顯微鏡（電鏡）購自上海研匠生物科技公司，1600R 型電泳系統及凝膠成像系統購自上海天能公司。
1.2 方法
1.2.1 動物分組、造模及給藥
將 80 只 BALB/c 雄性小鼠按照隨機數表分為對照組、模型組、血必凈組、血必凈+3-MA 組，每組各 20 只。后 3 組采用盲腸結扎穿孔術建立膿毒癥 ALI 模型，方法如下：乙醚吸入麻醉后開腹，找到盲腸后在末端用針頭刺破，而后關腹部完成造模。對照組進行麻醉、開腹、分離盲腸但不刺破的假手術操作。造模當天開始，對照組和模型組給予 10 mL/kg 生理鹽水腹腔注射、2 次/d，血必凈組給予 10 mL/kg 血必凈注射液腹腔注射、2 次/d，血必凈+3-MA 組給予 10 mL/kg 血必凈注射液及 10 mg/kg 3-MA 腹腔注射、2 次/d，均連續注射 3 d，給藥過程中觀察小鼠存活情況，末次給藥后 24 h 仍存活的小鼠采用過量麻醉的方法處死，用于取材及指標檢測。
1.2.2 肺組織的 HE 染色
取左肺組織適量，生理鹽水清洗后在 4% 多聚甲醛中固定，石蠟包埋后制作 4 μm 厚度的病理切片，采用 HE 染色試劑盒進行操作、染色后在顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。
1.2.3 肺濕重/干重比的測量
取右肺組織后稱量濕重，放入烘箱烘干至恒重后記錄干重，而后計算肺濕重/干重比。
1.2.4 肺組織中炎癥因子含量的 ELISA 檢測
取左肺組織適量，加入放射免疫沉淀試驗（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液后研磨，研磨液以轉速 12000 r/min、半徑 10 cm 離心 10 min 后取上清液，采用 BCA 試劑盒檢測蛋白含量，采用 ELISA 試劑盒檢測 TNF-α、IL-1β、IL-18 含量，而后計算每毫克蛋白中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量。
1.2.5 肺組織中自噬小體的電鏡觀察及檢測
取左肺組織適量，制成約 1 mm3 的組織塊，在 2.5% 戊二醛溶液中固定并保存，檢測時用 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液沖洗組織塊 3 次，放入 1% 鋨酸中 4℃固定 1 h，70%、80%、95%、100% 乙醇溶液梯度脫水后環氧樹脂包埋，?80℃聚合 24 h，制作 60～70 nm 厚度的切片并用 3% 檸檬酸鉛染色，最后在透射電鏡下觀察，隨機選擇 5 個視野對自噬小體進行計數。
1.2.6 肺組織中自噬基因的蛋白質印跡法檢測
取左肺組織適量，加入 RIPA 裂解液后研磨后提取蛋白，采用 BCA 試劑盒檢測蛋白含量，將含有 30 μg 蛋白的樣本用于蛋白質印跡法檢測，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，電轉移至聚偏氟乙烯膜后用 5% 脫脂牛奶在室溫封閉 1 h，4℃孵育 1∶1000 稀釋的 LC3、Beclin-1 一抗或 1∶2500 稀釋的 β-actin 一抗過夜，洗膜 3 次后室溫孵育 1∶2000 稀釋的二抗 1 h，最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶并計算灰度值，以 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1/β-actin 的比值作為蛋白表達量。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件錄入數據。4 組間小鼠生存情況采用 Kaplan-Meier 曲線表示并進行對數秩檢驗（兩兩比較采用 Bonferroni 調整檢驗水準法）；計量資料經正態性檢驗符合正態分布，以均數±標準差表示，4 組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗。本研究的兩兩比較僅進行模型組與對照組比較（反映造模效果）、血必凈組與模型組比較（反映血必凈的干預效果）以及血必凈+3-MA 組與血必凈組比較（反映 3-MA 的干預效果）。檢驗水準 α=0.05（雙側）。
2 結果
2.1 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠生存率的影響
假手術后，對照組小鼠活動、飲水均正常。造模后，模型組和血必凈+3-MA 組小鼠精神萎靡、覓食活動減少、喘息明顯；與模型組比較，血必凈組小鼠精神狀態明顯改善，覓食活動有所增加，喘息明顯減輕。72 h 內，對照組小鼠無死亡，模型組、血必凈組、血必凈+3-MA 組小鼠分別死亡 10、5、9 只，累積生存率分別為 100%、50%、75% 和 55%。4 組小鼠 72 h Kaplan-Meier 生存曲線及對數秩檢驗結果示，模型組小鼠生存率明顯低于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠明顯高于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠明顯低于血必凈組（P<0.05）。見圖1。
圖1
各組小鼠 72 h 生存的 Kaplan-Meier 曲線
*與對照組比較，
2.2 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠肺組織病理改變及肺濕重/干重比的影響
經 HE 染色觀察肺組織病理改變，對照組小鼠肺組織形態正常，模型組小鼠肺組織出現充血水腫、肺泡間隔增寬、炎癥細胞浸潤，血必凈組小鼠肺組織充血水腫、炎癥細胞浸潤的病理改變均較模型組減輕，血必凈+3-MA 組小鼠肺組織充血水腫、炎癥細胞浸潤的病理改變均較血必凈組加重。見圖2。
圖2
各組小鼠肺組織病理改變的比較（HE ×400）
a. 對照組；b. 模型組；c. 血必凈組；d. 血必凈+3-MA 組
經肺濕重/干重比的測定，模型組小鼠的肺濕重/干重比明顯高于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠的肺濕重/干重比明顯低于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠的肺濕重/干重比明顯高于血必凈組（P<0.05）。見表1。
表1
各組小鼠肺組織肺濕重/干重比、炎癥因子含量及自噬相關指標的比較（）
2.3 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠肺組織中炎癥因子含量的影響
模型組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量均明顯高于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量均明顯低于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量均明顯高于血必凈組（P<0.05）。見表1。
2.4 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠肺組織中自噬小體形成的影響
模型組小鼠肺組織中自噬小體的數目明顯多于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠肺組織中自噬小體的數目明顯多于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠肺組織中自噬小體的數目明顯少于血必凈組（P<0.05）。見圖3、表1。
圖3
各組小鼠肺組織中自噬小體形成的電鏡觀察比較
a. 對照組；b. 模型組；c. 血必凈組；d. 血必凈+3-MA 組。N 為細胞核；白箭所指為自噬小體；白箭頭所指為自噬溶酶體
2.5 血必凈對膿毒癥 ALI 小鼠肺組織中自噬標志基因表達的影響
模型組小鼠肺組織中 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的表達水平均明顯高于對照組（P<0.05），血必凈組小鼠肺組織中 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的表達水平均明顯高于模型組（P<0.05），血必凈+3-MA 組小鼠肺組織中 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 的表達水平均明顯低于血必凈組（P<0.05）。見圖4、表1。
圖4
各組小鼠肺組織中 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達的蛋白質印跡法檢測
a：Beclin-1 的條帶；b：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的條帶
3 討論
ALI 是膿毒癥最常見的臟器損傷之一，表現為肺組織充血水腫、炎癥細胞浸潤，可進一步引起呼吸衰竭及多器官功能障礙，死亡率高、救治難度大。血必凈注射液是用于膿毒癥治療的中藥復方注射液，臨床研究顯示，血必凈注射液用于膿毒癥的治療能減少血清炎癥因子含量、提高患者生存率[3-4]；動物實驗顯示，血必凈注射液對膿毒癥大鼠肺臟、心肌、肝臟、腎臟等多個臟器有保護作用[5-6]。本研究采用盲腸穿孔結扎術建立膿毒癥小鼠模型，造模后小鼠肺組織出現了充血水腫、炎癥細胞浸潤等典型的 ALI 病理改變且 72 h 累積生存率明顯降低，而在給予血必凈注射液干預后 ALI 病理改變減輕且 72 h 累積生存率明顯增加，表明血必凈注射液能夠在膿毒癥 ALI 過程中起到保護作用，與既往臨床研究和基礎研究中血必凈注射液的保護作用[3-6]一致。
全身炎癥反應激活、肺組織中炎癥細胞大量浸潤是造成膿毒癥患者發生 ALI 的重要病理生理環節，肺組織中浸潤的炎癥細胞能夠釋放多種炎癥細胞因子并造成肺組織損傷。TNF-α、IL-1β、IL-18 是目前已知與膿毒癥 ALI 密切相關的炎癥細胞因子，膿毒癥患者血清中 3 種細胞因子的含量以及膿毒癥小鼠肺組織中 3 種細胞因子的含量均增多[12-14]，本研究同樣發現模型組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量增加。血必凈注射液在膿毒癥中的保護作用與其抗炎活性密切相關，本研究在使用血必凈注射液治療膿毒癥 ALI 小鼠后觀察到肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量明顯減少，表明血必凈注射液能夠減輕膿毒癥 ALI 小鼠肺組織的炎癥反應，與 HE 染色觀察到炎癥細胞浸潤減少的結果一致并進一步驗證了血必凈注射液在膿毒癥 ALI 中的保護作用。
在闡明血必凈注射液對膿毒癥 ALI 的保護作用后，本研究還對相關的分子機制進行了初步探究。自噬是近些年受到越來越多關注的生物學過程，膿毒癥發病過程中自噬可能起到臟器保護作用。自噬是由溶酶體介導的細胞內吞噬，Beclin-1 和 LC3 是自噬標志基因，參與自噬小體的形成，自噬小體形成后能夠水解蛋白質及細胞器并維持細胞內穩態。在感染、應激等病理生理狀態下，自噬的激活是一把雙刃劍，適度的自噬能夠起到細胞保護作用，但過度的自噬則會引起細胞凋亡和損傷[15-16]。目前的研究認為，自噬在膿毒癥 ALI 的過程中明顯激活，且使用自噬激活劑能夠減輕 ALI，使用自噬抑制劑能夠加重 ALI，同時自噬也參與膿毒癥 ALI 過程中多種炎癥因子的調控[7-8, 17]。本研究在膿毒癥 ALI 小鼠的肺組織中觀察到自噬小體增多、自噬標志基因 Beclin-1 及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達增加，與既往研究中膿毒癥 ALI 小鼠自噬激活的結果[17]一致。
血必凈注射液提取自紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸 5 味中藥，其中的活性成分包括羥基紅花黃素 A、丹酚酸 A、丹酚酸 B 等，已有腦缺血再灌注損傷、非酒精性脂肪肝等研究發現，血必凈注射液的活性成分能夠激活自噬并減輕腦損傷、肝損傷[9-11]，提示血必凈注射液可能參與自噬的調控。本研究在使用血必凈注射液治療膿毒癥 ALI 小鼠后觀察到肺組織中自噬小體增多、自噬標志基因 Beclin-1 及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表達增加，表明血必凈注射液對膿毒癥 ALI 小鼠的自噬具有激活作用，結合自噬激活在 ALI 中的保護作用推測：激活自噬可能是血必凈注射液減輕膿毒癥 ALI 的機制。為了驗證這一推測，本研究使用了自噬抑制劑 3-MA，在血必凈注射液干預的同時加用 3-MA 后，小鼠 ALI 的病理改變加重且肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-18 的含量增加，表明 3-MA 削弱了血必凈注射液對膿毒癥 ALI 的保護作用，進而提示激活自噬可能是血必凈注射液減輕膿毒癥 ALI 的分子機制之一。
綜上所述，血必凈注射液能夠減輕膿毒癥小鼠 ALI，自噬激活是血必凈注射液發揮保護作用的分子機制之一。
