引用本文： 郭婷婷, 周杰, 郭建. 氟西汀預處理對腦出血模型小鼠的影響研究. 華西醫學, 2022, 37(3): 431-436. doi: 10.7507/1002-0179.202104046 復制
腦出血是導致情緒障礙的常見病因，約 20%的腦出血患者可并發抑郁癥，嚴重影響未來生活質量[1]。選擇性五羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）是目前使用最廣泛的抗抑郁藥物之一。然而，由于 SSRI 有抑制血小板聚集作用，可能增加腦出血風險。既往已經有研究表明 SSRI 可能導致腦出血增加[2-3]，而其他研究卻得出相反的結論[4]。因此，有必要設計一個嚴格、混雜因素可控的動物實驗以進一步探索這一問題。氟西汀是一種強效 SSRI，可通過神經保護作用促進腦卒中后運動恢復而常用于腦出血患者[5]。但目前尚無針對其是否增加腦出血的動物實驗。因此，本研究旨在利用標化的小鼠腦出血模型，考察氟西汀預處理是否有加重腦出血可能。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
42 只 12～14 個月齡無特定病原體級雌性 C57BL/6 小鼠，體質量 25～35 g，購于成都藥康生物科技有限公司，許可證號 SCXK（川）2020-034。所有小鼠健康狀況良好，分籠飼養在通風良好的恒溫環境，給予充足的水和食物，使其能夠自由飲水和進食，并以 12 h/12 h 的晝夜周期循環。動物術前 12 h 禁食，但自由進水。本研究通過四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準，倫理備案號：20211160A。
1.2 方法
小鼠由簡單隨機法分配為氟西汀組（氟西汀預處理，1 mL 生理鹽水稀釋氟西汀腹腔注射，20 mg/kg、1 次/d，美國西格瑪奧德里奇公司）和對照組（生理鹽水 1 mL 腹腔注射，1 次/d），各 21 只。42 只小鼠中，22 只用于腦組織血紅蛋白含量和鼠尾出血時間測定（每組 11 只），20 只用于神經功能、組織病理、出血損傷體積、腦含水量、腦腫脹等其他實驗（每組 10 只）。氟西汀給藥方案基于以前的研究[6]，于腦出血造模前 7 d 每日腹腔注射。
7.1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，所有小鼠仰臥位固定于立體定位儀。膠原酶（0.075 U，美國西格瑪奧德里奇公司）注射至小鼠右側紋狀體誘導腦出血。注射位置選用前囟前 0.40 mm、側 2.00 mm、深 3.00 mm，原因在于該位置不會損傷中央前回，使得神經系統損害評估與腦出血嚴重程度的一致性更強[7]。膠原酶勻速注射 5 min，并保持 10 min 以防止回流。在整個實驗和恢復期均使用熱墊保持小鼠肛溫在（37.00±0.50）°C。
1.3 神經功能評估
在腦出血后第 1 天（建模后第 2 天）和第 3 天，采用神經功能缺損評分（neurologic deficit scoring，NDS）和懸繩實驗盲評小鼠神經功能損傷情況[8]。利用 NDS 對小鼠進行了包括身體平衡、步態、攀爬、繞圈行為、前肢力量和強制繞圈 6 個方面測試。每個測試 0～4 分，最差 24 分。在懸繩實驗中，將小鼠前肢掛于鐵絲（55 cm 寬、2 mm 厚），記錄其完全松開前肢并掉落的時間，用于評估小鼠的握力、平衡和耐力。
1.4 組織病理學
腦出血后第 3 天深度麻醉處死小鼠，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）和 4%多聚甲醛經心臟灌注固定腦組織。整個紋狀體行冠狀位切片后進行勞克堅牢藍-甲苯酚紫雙染（luxol fast blue/cresyl violet，LFB-CV）以檢測腦損傷和髓鞘損傷體積，采用fluoro-jade C（FJC）染色以檢測退化神經元，普魯士藍染色以檢測鐵含量。每只小鼠選擇 3 個連續病灶切片，每個切片選擇 4 個區域共 12 個位置，測量平均髓鞘面積（%）和每平方毫米的 FJC 及普魯士藍陽性細胞數。所有的腦切片均由 1 名研究者盲法進行分析。
1.5 出血損傷體積、腦含水量和腦腫脹
利用 Image pro plus 5.0 軟件對腦出血后第 3 天 LFB-CV 切片進行圖像分析，通過厚度×各切片損傷面積之和，得出損傷體積。通過測定腦含水量以評估腦水腫，對比病側及對側紋狀體，同時以小腦作為內部對照。腦含水量百分比=（濕重?干重）/濕重×100%。腦腫脹通過計算半球增大百分比來量化，即（同側半球體積?對側半球體積）/對側半球體積×100%。
1.6 腦組織血紅蛋白含量
由于血腦屏障破壞后血紅蛋白代謝較快，取腦出血后第 1 天紋狀體行血紅蛋白含量檢測。用 Drabkin 試劑（美國西格瑪奧德里奇公司）溶解紋狀體，以分光光度計在 540 nm 處檢測氰化正鐵血紅蛋白的吸光度，測定血紅蛋白含量。
1.7 鼠尾出血時間
為確定氟西汀是否抑制血小板聚集從而延長出血時間，因此在腦出血后第 1 天檢測兩組鼠尾出血時間，小鼠麻醉后置于恒溫墊上維持體溫，用刀片橫切尾尖 3 mm，并立即浸入溫 PBS［（37.00±0.50）°C］中。監測鼠尾出血時間，當停止出血超過 30 s 時記錄為出血停止時間。鼠尾出血時間大于 15 min 均記錄為 900 s。
1.8 統計學方法
用 GraphPad Prism 7 軟件進行統計處理。計量資料首先進行正態性檢驗，若滿足正態分布則以均數±標準差表示，在滿足方差齊性的同時，組間比較采用成組 t 檢驗，否則采用校正 t 檢驗。若計量資料不滿足正態性，則對原始數據進行對數轉換。對于呈對數正態分布的資料，在滿足方差齊性時采用成組 t 檢驗，反之采用校正 t 檢驗。若對數轉換后仍不滿足正態分布，則采用兩獨立樣本 Wilcoxon 秩和檢驗。計數資料采用只數表示。雙側檢驗水準均為α=0.05。
2 結果
2.1 氟西汀預處理對小鼠腦出血后損傷體積、腦含水量和腦腫脹影響
腦出血后第 3 天，對照組和氟西汀組出血體積分別為（4.59±1.80）mm3 和（6.09±1.08）mm3。由圖1a、1b 可見，與對照組相比，氟西汀組出血體積增加（t=?2.251，P=0.037）。由圖1c、1d 可見，氟西汀組病側紋狀體腦含水量（t=?2.600，P=0.018）和腦腫脹（t=?2.069，P=0.035）均增加。
圖1
氟西汀預處理對腦出血小鼠腦損傷體積、腦含水量、腦腫脹的影響（n=10）
a. 小鼠腦切片 LFB-CV 染色，標尺=5 mm；b. 出血體積；c. 腦含水量；d. 腦腫脹。*與對照組比較，
2.2 氟西汀預處理對小鼠腦出血后 NDS 結果的影響
對照組和氟西汀組小鼠各 10 只，體重分別為（29.71±2.30）g 和（31.23±1.73）g，差異無統計學意義（t=?1.144，P=0.268）。采用 NDS 和懸繩實驗評估小鼠神經功能損傷情況。結果顯示，與對照組相比，氟西汀組在腦出血后第 1 天及第 3 天，NDS 均增高，尤其腦出血后第 1 天對照組和氟西汀組評分分別為（10.10±4.53）、（17.20±3.58）分，兩組比較差異有統計學意義（t=?3.886，P=0.001）。懸繩實驗時間在腦出血后第 1 天，對照組和氟西汀組分別為（52.40±44.46）、（18.30±9.94）s，由于兩組數據不滿足正態性故進行對數轉換，其對數值分別為（3.69±0.75）、（2.79±0.51）s，滿足正態分布和方差齊性，結果顯示與對照組比較，氟西汀組用時降低（t=2.367，P=0.029）。腦出血后第 3 天兩組用時比較差異無統計學意義（t=1.845，P=0.081）。見圖2a、2b。
圖2
氟西汀預處理對腦出血小鼠神經功能（n=10）、懸繩實驗（n=10）、腦血紅蛋白含量（n=11）、鼠尾出血時間（n=11）的影響
a. NDS；b. 懸繩實驗；c. 腦組織血紅蛋白含量；d. 鼠尾出血時間。*與對照組比較，
2.3 氟西汀預處理對小鼠腦出血后血紅蛋白含量及血小板聚集能力的影響
腦出血后第 1 天，對照組和氟西汀組紋狀體血紅蛋白吸光度分別為0.94±0.29 和 1.22±0.27，相比對照組，氟西汀組明顯增加，差異有統計學意義（t=?2.259，P=0.035）。腦出血后 1 d 兩組鼠尾出血時間檢測顯示，對照組和氟西汀組分別為（276.73±211.06）、（438.00±236.79）s，雖然與對照組相比差異無統計學意義（t=?1.686，P=0.055），但氟西汀預處理有延長鼠尾出血時間的趨勢。見圖2c、2d。
2.4 氟西汀預處理對小鼠腦出血后組織病理的影響
腦出血后第 3 天的組織病理學發現，氟西汀預處理可增加膠原酶誘導的腦出血髓鞘損傷，使得髓鞘面積減少（t=3.671，P=0.002），可增加鐵沉積（t=?2.151，P=0.045），可加重神經元變性（t=?3.046，P=0.007）。見表1，圖3、4。
表1
兩組小鼠出血后組織病理情況（n=10，
）
圖3
兩組小鼠腦出血后腦組織染色彩色像
LFB-CV，標尺=100 μm；普魯士藍染色，標尺=100 μm；FJC 染色，標尺=50 μm
圖4
氟西汀預處理對小鼠腦出血后髓鞘損傷、鐵沉積及神經元變性的影響
a. 髓鞘面積；b. 鐵染色陽性細胞；c. FJC陽性細胞。*與對照組比較，
3 討論
本研究希望通過建立較穩定的小鼠腦出血模型，考察氟西汀預處理對腦出血的影響。結果發現，與對照組相比，氟西汀預處理 7 d 的腦出血小鼠在出血體積、神經行為學缺損、神經元死亡及變性、血紅蛋白及鐵沉積、腦水腫等方面均更為嚴重。同時鼠尾出血時間有延長的趨勢，提示氟西汀可能導致血小板聚集障礙，從而誘發出血增加。
本研究的主要發現是氟西汀預處理可加重腦出血。既往已有許多研究發現 SSRI 可增加消化道出血，但對腦出血的影響尚存在爭議。一項納入 1 279 例參與者，平均隨訪時間長達 53.2 個月的觀察性研究顯示，使用 SSRI 與腦出血之間存在明顯的聯系，特別是對于顱內影像學多發微出血，或伴有特定易出血基因型的患者[9]。但另外一項納入 24 個隨機對照試驗共計 4 844 090 例被試者的 meta 分析則顯示，并無強有力的證據證明 SSRI 會明顯增加腦出血風險[10]。事實上，在臨床工作中，SSRI 一直被用于治療腦出血后情緒障礙，甚至被認為有利于腦出血后的神經功能恢復[5]。產生這種矛盾結論的原因有很多。首先，由于采用觀察性研究而缺乏隨機對照試驗，在 SSRI 類藥物導致出血增加的病例中存在研究偏倚；其次，腦出血易受多種混雜因素的影響，如不同的基礎疾病、SSRI 不同使用情況等。在這些研究中，所納入患者未進行分組，因此研究結果可能有偏差[11]；此外，之前眾多研究是針對使用 SSRI 的普通抑郁癥而非腦出血患者[12]。普通人群即使在 SSRI 抑制血小板聚集作用下，發生腦出血的風險非常小，難以被檢出。而對于腦出血患者，血腦屏障的損傷可能加重 SSRI 所致的血腫體積增加，從而體現出統計學差異。
本研究發現，氟西汀預處理可加重腦出血。推測其機制在于 SSRI 藥理作用為通過抑制中樞神經系統的五羥色胺轉運體（serotonin transporters，SERT）以提高突觸間隙五羥色胺濃度，從而治療抑郁癥。而此時血小板膜處的 SERT 也受到抑制。血小板無法結合五羥色胺，但位于血小板膜的 SERT 會將五羥色胺轉移到血小板內參與凝血功能。因此，SSRI 會使血小板五羥色胺轉運能力下降，進而損害凝血能力[13]。此外，依賴五羥色胺的促血小板活化細胞內信號轉導通路也會受到 SSRI 抑制，降低血小板黏附功能從而加重出血[14]。相關臨床研究證實，五羥色胺攝取能力抑制越強，誘發腦出血的可能性越大[2]，這與 SSRI 的生物學效應是一致的。眾所周知，氟西汀是一種對五羥色胺再攝取能力強抑制作用的 SSRI 類藥物。因此，本研究選擇氟西汀而不是其他弱抑制劑來進行實驗。此外，SSRI 可影響中樞神經系統血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達[15]。VEGF 促進脆弱新生血管的形成，進一步破壞血腦屏障，這可能是引起腦出血血腫擴大的潛在因素[16]。
鼠尾出血時間是評價血小板功能的常用工具。而在本實驗中，氟西汀預處理在增加鼠尾出血時間并無統計學差異。可能的原因是鼠尾出血時間受多種因素影響，如小鼠年齡、性別、麻醉情況、小鼠切尾方法、評價方法等[17]。在本實驗中，盡量使用一致的方法來切斷小鼠尾巴，判斷出血時間和程度，但因實驗小鼠在適應環境和氟西汀預處理 1 周后，體重狀況均不同，最終也可能影響結果。不過，與對照組相比，氟西汀組小鼠有尾出血時間延長的趨勢，這提示氟西汀可能通過降低血小板功能引起凝血功能障礙。
本研究也有一定的局限性。首先，沒有同時對雄性和雌性小鼠進行實驗，只納入雌性小鼠。這是因為一些臨床研究認為大多數腦卒中后抑郁癥患者是女性[18]。因此，本研究結果可能僅提示氟西汀可加重女性患者的腦出血，將此結果應用于男性患者還需要更多的證據。其次，本研究僅使用了中年小鼠，因為腦出血患者多為中老年[1]，中年小鼠可以模擬這部分群體的生理特性。另一個局限性是本研究沒有深入研究造成這種現象的機制。因此，未來實驗需詳細觀察氟西汀預處理后外周血和腦脊液中五羥色胺含量、血腫周圍 VEGF 表達的變化等。同時，可利用五羥色胺缺乏，如 TPH2 基因敲除（TPH2?/?）轉基因小鼠進行實驗，以進一步探索氟西汀加重腦出血的機制。
綜上所述，本研究表明氟西汀預處理可能會進一步加重腦出血，其可能原因在于 SSRI 對血小板聚集的抑制作用。因此，腦出血尤其是再出血風險較高的患者應謹慎使用 SSRI 類藥物。未來尚需更多設計精良的雙盲隨機對照實驗以驗證這一結論。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
腦出血是導致情緒障礙的常見病因，約 20%的腦出血患者可并發抑郁癥，嚴重影響未來生活質量[1]。選擇性五羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）是目前使用最廣泛的抗抑郁藥物之一。然而，由于 SSRI 有抑制血小板聚集作用，可能增加腦出血風險。既往已經有研究表明 SSRI 可能導致腦出血增加[2-3]，而其他研究卻得出相反的結論[4]。因此，有必要設計一個嚴格、混雜因素可控的動物實驗以進一步探索這一問題。氟西汀是一種強效 SSRI，可通過神經保護作用促進腦卒中后運動恢復而常用于腦出血患者[5]。但目前尚無針對其是否增加腦出血的動物實驗。因此，本研究旨在利用標化的小鼠腦出血模型，考察氟西汀預處理是否有加重腦出血可能。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
42 只 12～14 個月齡無特定病原體級雌性 C57BL/6 小鼠，體質量 25～35 g，購于成都藥康生物科技有限公司，許可證號 SCXK（川）2020-034。所有小鼠健康狀況良好，分籠飼養在通風良好的恒溫環境，給予充足的水和食物，使其能夠自由飲水和進食，并以 12 h/12 h 的晝夜周期循環。動物術前 12 h 禁食，但自由進水。本研究通過四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準，倫理備案號：20211160A。
1.2 方法
小鼠由簡單隨機法分配為氟西汀組（氟西汀預處理，1 mL 生理鹽水稀釋氟西汀腹腔注射，20 mg/kg、1 次/d，美國西格瑪奧德里奇公司）和對照組（生理鹽水 1 mL 腹腔注射，1 次/d），各 21 只。42 只小鼠中，22 只用于腦組織血紅蛋白含量和鼠尾出血時間測定（每組 11 只），20 只用于神經功能、組織病理、出血損傷體積、腦含水量、腦腫脹等其他實驗（每組 10 只）。氟西汀給藥方案基于以前的研究[6]，于腦出血造模前 7 d 每日腹腔注射。
7.1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，所有小鼠仰臥位固定于立體定位儀。膠原酶（0.075 U，美國西格瑪奧德里奇公司）注射至小鼠右側紋狀體誘導腦出血。注射位置選用前囟前 0.40 mm、側 2.00 mm、深 3.00 mm，原因在于該位置不會損傷中央前回，使得神經系統損害評估與腦出血嚴重程度的一致性更強[7]。膠原酶勻速注射 5 min，并保持 10 min 以防止回流。在整個實驗和恢復期均使用熱墊保持小鼠肛溫在（37.00±0.50）°C。
1.3 神經功能評估
在腦出血后第 1 天（建模后第 2 天）和第 3 天，采用神經功能缺損評分（neurologic deficit scoring，NDS）和懸繩實驗盲評小鼠神經功能損傷情況[8]。利用 NDS 對小鼠進行了包括身體平衡、步態、攀爬、繞圈行為、前肢力量和強制繞圈 6 個方面測試。每個測試 0～4 分，最差 24 分。在懸繩實驗中，將小鼠前肢掛于鐵絲（55 cm 寬、2 mm 厚），記錄其完全松開前肢并掉落的時間，用于評估小鼠的握力、平衡和耐力。
1.4 組織病理學
腦出血后第 3 天深度麻醉處死小鼠，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）和 4%多聚甲醛經心臟灌注固定腦組織。整個紋狀體行冠狀位切片后進行勞克堅牢藍-甲苯酚紫雙染（luxol fast blue/cresyl violet，LFB-CV）以檢測腦損傷和髓鞘損傷體積，采用fluoro-jade C（FJC）染色以檢測退化神經元，普魯士藍染色以檢測鐵含量。每只小鼠選擇 3 個連續病灶切片，每個切片選擇 4 個區域共 12 個位置，測量平均髓鞘面積（%）和每平方毫米的 FJC 及普魯士藍陽性細胞數。所有的腦切片均由 1 名研究者盲法進行分析。
1.5 出血損傷體積、腦含水量和腦腫脹
利用 Image pro plus 5.0 軟件對腦出血后第 3 天 LFB-CV 切片進行圖像分析，通過厚度×各切片損傷面積之和，得出損傷體積。通過測定腦含水量以評估腦水腫，對比病側及對側紋狀體，同時以小腦作為內部對照。腦含水量百分比=（濕重?干重）/濕重×100%。腦腫脹通過計算半球增大百分比來量化，即（同側半球體積?對側半球體積）/對側半球體積×100%。
1.6 腦組織血紅蛋白含量
由于血腦屏障破壞后血紅蛋白代謝較快，取腦出血后第 1 天紋狀體行血紅蛋白含量檢測。用 Drabkin 試劑（美國西格瑪奧德里奇公司）溶解紋狀體，以分光光度計在 540 nm 處檢測氰化正鐵血紅蛋白的吸光度，測定血紅蛋白含量。
1.7 鼠尾出血時間
為確定氟西汀是否抑制血小板聚集從而延長出血時間，因此在腦出血后第 1 天檢測兩組鼠尾出血時間，小鼠麻醉后置于恒溫墊上維持體溫，用刀片橫切尾尖 3 mm，并立即浸入溫 PBS［（37.00±0.50）°C］中。監測鼠尾出血時間，當停止出血超過 30 s 時記錄為出血停止時間。鼠尾出血時間大于 15 min 均記錄為 900 s。
1.8 統計學方法
用 GraphPad Prism 7 軟件進行統計處理。計量資料首先進行正態性檢驗，若滿足正態分布則以均數±標準差表示，在滿足方差齊性的同時，組間比較采用成組 t 檢驗，否則采用校正 t 檢驗。若計量資料不滿足正態性，則對原始數據進行對數轉換。對于呈對數正態分布的資料，在滿足方差齊性時采用成組 t 檢驗，反之采用校正 t 檢驗。若對數轉換后仍不滿足正態分布，則采用兩獨立樣本 Wilcoxon 秩和檢驗。計數資料采用只數表示。雙側檢驗水準均為α=0.05。
2 結果
2.1 氟西汀預處理對小鼠腦出血后損傷體積、腦含水量和腦腫脹影響
腦出血后第 3 天，對照組和氟西汀組出血體積分別為（4.59±1.80）mm3 和（6.09±1.08）mm3。由圖1a、1b 可見，與對照組相比，氟西汀組出血體積增加（t=?2.251，P=0.037）。由圖1c、1d 可見，氟西汀組病側紋狀體腦含水量（t=?2.600，P=0.018）和腦腫脹（t=?2.069，P=0.035）均增加。
圖1
氟西汀預處理對腦出血小鼠腦損傷體積、腦含水量、腦腫脹的影響（n=10）
a. 小鼠腦切片 LFB-CV 染色，標尺=5 mm；b. 出血體積；c. 腦含水量；d. 腦腫脹。*與對照組比較，
2.2 氟西汀預處理對小鼠腦出血后 NDS 結果的影響
對照組和氟西汀組小鼠各 10 只，體重分別為（29.71±2.30）g 和（31.23±1.73）g，差異無統計學意義（t=?1.144，P=0.268）。采用 NDS 和懸繩實驗評估小鼠神經功能損傷情況。結果顯示，與對照組相比，氟西汀組在腦出血后第 1 天及第 3 天，NDS 均增高，尤其腦出血后第 1 天對照組和氟西汀組評分分別為（10.10±4.53）、（17.20±3.58）分，兩組比較差異有統計學意義（t=?3.886，P=0.001）。懸繩實驗時間在腦出血后第 1 天，對照組和氟西汀組分別為（52.40±44.46）、（18.30±9.94）s，由于兩組數據不滿足正態性故進行對數轉換，其對數值分別為（3.69±0.75）、（2.79±0.51）s，滿足正態分布和方差齊性，結果顯示與對照組比較，氟西汀組用時降低（t=2.367，P=0.029）。腦出血后第 3 天兩組用時比較差異無統計學意義（t=1.845，P=0.081）。見圖2a、2b。
圖2
氟西汀預處理對腦出血小鼠神經功能（n=10）、懸繩實驗（n=10）、腦血紅蛋白含量（n=11）、鼠尾出血時間（n=11）的影響
a. NDS；b. 懸繩實驗；c. 腦組織血紅蛋白含量；d. 鼠尾出血時間。*與對照組比較，
2.3 氟西汀預處理對小鼠腦出血后血紅蛋白含量及血小板聚集能力的影響
腦出血后第 1 天，對照組和氟西汀組紋狀體血紅蛋白吸光度分別為0.94±0.29 和 1.22±0.27，相比對照組，氟西汀組明顯增加，差異有統計學意義（t=?2.259，P=0.035）。腦出血后 1 d 兩組鼠尾出血時間檢測顯示，對照組和氟西汀組分別為（276.73±211.06）、（438.00±236.79）s，雖然與對照組相比差異無統計學意義（t=?1.686，P=0.055），但氟西汀預處理有延長鼠尾出血時間的趨勢。見圖2c、2d。
2.4 氟西汀預處理對小鼠腦出血后組織病理的影響
腦出血后第 3 天的組織病理學發現，氟西汀預處理可增加膠原酶誘導的腦出血髓鞘損傷，使得髓鞘面積減少（t=3.671，P=0.002），可增加鐵沉積（t=?2.151，P=0.045），可加重神經元變性（t=?3.046，P=0.007）。見表1，圖3、4。
表1
兩組小鼠出血后組織病理情況（n=10，）
圖3
兩組小鼠腦出血后腦組織染色彩色像
LFB-CV，標尺=100 μm；普魯士藍染色，標尺=100 μm；FJC 染色，標尺=50 μm
圖4
氟西汀預處理對小鼠腦出血后髓鞘損傷、鐵沉積及神經元變性的影響
a. 髓鞘面積；b. 鐵染色陽性細胞；c. FJC陽性細胞。*與對照組比較，
3 討論
本研究希望通過建立較穩定的小鼠腦出血模型，考察氟西汀預處理對腦出血的影響。結果發現，與對照組相比，氟西汀預處理 7 d 的腦出血小鼠在出血體積、神經行為學缺損、神經元死亡及變性、血紅蛋白及鐵沉積、腦水腫等方面均更為嚴重。同時鼠尾出血時間有延長的趨勢，提示氟西汀可能導致血小板聚集障礙，從而誘發出血增加。
本研究的主要發現是氟西汀預處理可加重腦出血。既往已有許多研究發現 SSRI 可增加消化道出血，但對腦出血的影響尚存在爭議。一項納入 1 279 例參與者，平均隨訪時間長達 53.2 個月的觀察性研究顯示，使用 SSRI 與腦出血之間存在明顯的聯系，特別是對于顱內影像學多發微出血，或伴有特定易出血基因型的患者[9]。但另外一項納入 24 個隨機對照試驗共計 4 844 090 例被試者的 meta 分析則顯示，并無強有力的證據證明 SSRI 會明顯增加腦出血風險[10]。事實上，在臨床工作中，SSRI 一直被用于治療腦出血后情緒障礙，甚至被認為有利于腦出血后的神經功能恢復[5]。產生這種矛盾結論的原因有很多。首先，由于采用觀察性研究而缺乏隨機對照試驗，在 SSRI 類藥物導致出血增加的病例中存在研究偏倚；其次，腦出血易受多種混雜因素的影響，如不同的基礎疾病、SSRI 不同使用情況等。在這些研究中，所納入患者未進行分組，因此研究結果可能有偏差[11]；此外，之前眾多研究是針對使用 SSRI 的普通抑郁癥而非腦出血患者[12]。普通人群即使在 SSRI 抑制血小板聚集作用下，發生腦出血的風險非常小，難以被檢出。而對于腦出血患者，血腦屏障的損傷可能加重 SSRI 所致的血腫體積增加，從而體現出統計學差異。
本研究發現，氟西汀預處理可加重腦出血。推測其機制在于 SSRI 藥理作用為通過抑制中樞神經系統的五羥色胺轉運體（serotonin transporters，SERT）以提高突觸間隙五羥色胺濃度，從而治療抑郁癥。而此時血小板膜處的 SERT 也受到抑制。血小板無法結合五羥色胺，但位于血小板膜的 SERT 會將五羥色胺轉移到血小板內參與凝血功能。因此，SSRI 會使血小板五羥色胺轉運能力下降，進而損害凝血能力[13]。此外，依賴五羥色胺的促血小板活化細胞內信號轉導通路也會受到 SSRI 抑制，降低血小板黏附功能從而加重出血[14]。相關臨床研究證實，五羥色胺攝取能力抑制越強，誘發腦出血的可能性越大[2]，這與 SSRI 的生物學效應是一致的。眾所周知，氟西汀是一種對五羥色胺再攝取能力強抑制作用的 SSRI 類藥物。因此，本研究選擇氟西汀而不是其他弱抑制劑來進行實驗。此外，SSRI 可影響中樞神經系統血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達[15]。VEGF 促進脆弱新生血管的形成，進一步破壞血腦屏障，這可能是引起腦出血血腫擴大的潛在因素[16]。
鼠尾出血時間是評價血小板功能的常用工具。而在本實驗中，氟西汀預處理在增加鼠尾出血時間并無統計學差異。可能的原因是鼠尾出血時間受多種因素影響，如小鼠年齡、性別、麻醉情況、小鼠切尾方法、評價方法等[17]。在本實驗中，盡量使用一致的方法來切斷小鼠尾巴，判斷出血時間和程度，但因實驗小鼠在適應環境和氟西汀預處理 1 周后，體重狀況均不同，最終也可能影響結果。不過，與對照組相比，氟西汀組小鼠有尾出血時間延長的趨勢，這提示氟西汀可能通過降低血小板功能引起凝血功能障礙。
本研究也有一定的局限性。首先，沒有同時對雄性和雌性小鼠進行實驗，只納入雌性小鼠。這是因為一些臨床研究認為大多數腦卒中后抑郁癥患者是女性[18]。因此，本研究結果可能僅提示氟西汀可加重女性患者的腦出血，將此結果應用于男性患者還需要更多的證據。其次，本研究僅使用了中年小鼠，因為腦出血患者多為中老年[1]，中年小鼠可以模擬這部分群體的生理特性。另一個局限性是本研究沒有深入研究造成這種現象的機制。因此，未來實驗需詳細觀察氟西汀預處理后外周血和腦脊液中五羥色胺含量、血腫周圍 VEGF 表達的變化等。同時，可利用五羥色胺缺乏，如 TPH2 基因敲除（TPH2?/?）轉基因小鼠進行實驗，以進一步探索氟西汀加重腦出血的機制。
綜上所述，本研究表明氟西汀預處理可能會進一步加重腦出血，其可能原因在于 SSRI 對血小板聚集的抑制作用。因此，腦出血尤其是再出血風險較高的患者應謹慎使用 SSRI 類藥物。未來尚需更多設計精良的雙盲隨機對照實驗以驗證這一結論。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
