引用本文： 丁春曉, 劉小虎, 李淼, 李建華, 范英蘭. 慢性阻塞性肺疾病模型鼠中性粒細胞彈性蛋白酶和黏蛋白 5AC 的表達及病理意義. 華西醫學, 2021, 36(9): 1227-1231. doi: 10.7507/1002-0179.202103298 復制
慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）以慢性咳嗽、咳痰、氣短或呼吸困難為主要臨床癥狀，進展至疾病后期常合并肺源性心臟病、呼吸衰竭甚至危及生命，嚴重危害人類健康[1-4]。世界范圍內慢阻肺患病率為 11.7%，死亡人數約 350 萬/年[5]，據世界衛生組織統計，慢阻肺是世界第四大致死疾病，每年近 6 億患者，且患者數逐年增長[6-7]。在我國，40 歲以上人群患病率為 13.7%，患者數量接近 1 億，為我國疾病死因的第 3 位[3, 8-9]。既往研究顯示慢阻肺與炎癥介質和細胞因子、蛋白酶及抗蛋白酶、氧化物與抗氧化物、自身抗體、肺泡隔自身凋亡及基因多態性均有關系，多環節、多元素共同參與了慢阻肺的發生及發展過程[10]。這其中，氣道黏液高分泌是慢阻肺的重要病理生理表現，其既是引起患者慢性咳痰的要素，也是造成患者易合并肺部感染的獨立危險因素[11]。黏蛋白 5AC（mucin 5AC，MUC5AC）是氣道黏液蛋白的主要成分，中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）是中性粒細胞釋放的蛋白酶，與炎癥損傷及修復相關，二者在氣道黏液分泌過程中均發揮重要作用[12]。因此，本研究通過檢測 NE 及 MUC5AC 在慢阻肺模型鼠氣道上皮細胞中的表達情況，進一步探討慢阻肺氣道黏液高分泌發生機制，旨在為臨床治療提供新思路。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選用雄性無特定病原體級 Sprague-Dawley 大鼠 60 只，體重在 180～220 g，平均體重約 205 g，以上大鼠均來自遼寧長生生物技術股份有限公司，合格證編號為 SCXK（遼）2015-0001。本研究已獲得遼寧省中醫藥研究院實驗動物倫理委員會審查批準，審批號為 2020-12。
1.2 儀器設備及試劑
儀器設備及試劑包括：TP1020 型自動脫水機及切片機（德國徠卡公司），YG-280KX 型烤片機及攤片機（湖北孝感陽光神琦醫用科技公司），JKDP2 型電熱恒溫培養箱（廈門醫療電子儀器廠），BX53 光電顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），自制 60 cm×60 cm×70 cm 透明有機玻璃煙熏箱，枸櫞酸、多聚甲醛、枸櫞酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司），磷酸鹽緩沖液、二氨基聯苯胺濃縮型試劑盒、愛顯藍-雪夫試劑染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），即用型免疫組織化學超敏試劑盒（福建邁新生物技術開發有限公司），大前門牌香煙（上海卷煙廠），兔抗 NE 抗體（PB1114，武漢博士德生物工程有限公司），鼠抗胃黏液素抗體（sc-21701，上海圣克魯斯生物技術公司）。
1.3 實驗環境
遼寧中醫藥大學實驗動物中心，溫度 22～25℃，濕度 55%～60%，許可證號為 SYXK（遼）2012-0010。
1.4 模型制備
共 60 只雄性 Sprague-Dawley 大鼠，采用完全隨機化分組方法，抽樣前對每只實驗動物進行順序編號，運用隨機號表法分成空白組和模型組，每組各 30 只。空白組大鼠不作處理，模型組大鼠運用氣道內滴注脂多糖結合煙熏的方法制備慢阻肺氣道黏液高分泌模型[13]。脂多糖的氣道內滴注：于實驗第 1 天、第 15 天（每隔 2 周 1 次）予 3.5% 水合氯醛腹腔麻醉后，采用一次性氣管插管法氣道內滴注濃度為 1 mL/mg 的脂多糖溶液 0.2 mL。將麻醉大鼠固定在鼠板上，仰臥位頭高尾低呈 45° 角放置，暴露聲門，在光源下將 16 號套管針沿氣管快速插入氣管內，拔出針芯，置一光滑干燥鏡面的小鏡子于導管針接口處，當觀察到鏡面隨大鼠呼吸而出現水霧時，表示氣管插管成功，立即接入 1 mL 注射器，快速注入 0.2 mL 脂多糖溶液。注射完成后，立即將大鼠固定板直立并旋轉及左右搖晃，使脂多糖溶液在肺內均勻分布。煙熏：造模大鼠脂多糖注射當天不進行煙熏，第 2～28 天（第 15 天除外）給予煙熏，放入自制的有機玻璃密閉熏煙箱內，每次 10 只，用 8 支香煙，每日煙熏 30 min。煙熏每天 2 次，每次 30 min。整個實驗過程中，兩組實驗動物均給予基礎飼料喂養，自由飲水。
1.5 標本采集
實驗第 31 天取材，用脊椎脫臼法處死大鼠，打開胸腔，暴露心臟，減掉右心耳，用注射器吸取磷酸鹽緩沖液 50 mL，從心尖刺入左心室后進行灌注，再用注射器吸取甲醛固定液 20 mL，仍從心尖刺入左心室后進行灌注（灌注 10 mL），取右肺各葉組織，用 4% 多聚甲醛溶液固定以備檢。
1.6 實驗方法
1.6.1 蘇木精-伊紅染色
染色方法：肺組織于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 后，將其從固定液中取出，全自動脫水機脫水，然后用石蠟包埋，切片用二甲苯透明，梯度乙醇及蒸餾水浸泡，蘇木精-伊紅染色，水洗、浸泡及透明，中性樹膠封片。將切片置于顯微鏡下，分別用低倍及高倍鏡觀察肺組織及氣道上皮形態。判讀標準：采用病理評分分級方法。診斷標準：按照黏膜上皮的損傷與修復、腺體增生肥大及黏液腺化生、支氣管壁其他組織的慢性炎性損傷 3 項指標綜合進行分級，無以上 3 項者為（?），輕度為（+），中度為（++），重度為（+++），按病理分級計分，（?）為 0 分，（+）為 1 分，（++）為 2 分，（+++）為 3 分。
1.6.2 免疫組織化學染色
染色方法：肺組織石蠟切片，烘烤 4 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇（無水、90%、80%、70%）分別浸泡 5 min，蒸餾水浸泡 5 min。于枸櫞酸鈉緩沖液（pH 值 6.0）中高壓修復 5 min。磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min，滴加 3% 過氧化氫去離子水孵育 10 min。磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min。血清封閉 15 min，加入磷酸鹽緩沖液稀釋的一抗（NE、MUC5AU 均為 1∶200），37℃ 孵育 2 h。磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min。加入生物素標記的二抗，37℃ 孵育 20 min，磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min。滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，37℃ 孵育 30 min。磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min。滴加二氨基聯苯胺顯色劑，自來水漂洗，蘇木精復染 5 min。自來水漂洗 3 s，1% 鹽酸乙醇分化 5 s，自來水漂洗 30 s，再脫水、透明，最后中性樹膠封片。陽性程度判讀：NE 主要表達于肺組織中單核細胞、中性粒細胞等炎性細胞的細胞質內，呈棕黃色即為陽性[14]。MUC5AC 主要表達于氣道上皮細胞的細胞質內，呈棕黃色著色即為陽性。判讀標準：細胞無著色為（?），陽性著色細胞數占總細胞數<10% 為（±），11%～50% 為（+），51%～75% 為（++），≥75% 為（+++）。每張切片選取 5 個高倍視野（×200）對免疫組織化學結果進行判讀。按陽性細胞數分級計分，（?）為 0 分，（±）為 1 分，（+）為 2 分，（++）為 3 分，（+++）為 4 分[15]。
1.6.3 愛顯藍-雪夫試劑染色
染色方法：將肺組織切片常規脫蠟至水，蒸餾水洗 3 次，3% 乙酸溶液洗 3 min，1% 愛顯藍溶液染色 20 min，過碘酸氧化液氧化 20 min，自來水洗完后蒸餾水沖洗，Schiff 溶液染色 20 min，流水沖洗 5 min，經 95% 乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。存在杯狀細胞增生時，其細胞質內黏液經愛顯藍-雪夫試劑染色后呈藍色。結果判讀及標準：空白組與模型組每張切片隨機選取 5 個高倍視野（×200），用 Image-Pro Plus 6.0 軟件計數每個視野下杯狀細胞總數。
1.7 統計學方法
數據用 SPSS 17.0 軟件統計分析，計量資料若符合正態分布用均數±標準差表示，組間比較用獨立樣本 t 檢驗，計量資料若不符合正態分布用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較用 Mann-Whitney U 秩和檢驗。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 實驗動物一般情況
整個實驗過程中兩組實驗動物進食正常，監測體重無明顯變化。無神經異常行為，無意外死亡。
2.2 蘇木精-伊紅染色結果
空白組肺組織支氣管黏膜上皮完整，未見變性、壞死及脫落，支氣管黏膜上皮纖毛未見粘連、變短及倒伏，黏膜腺體排列規則，未見增生及肥大，間質未見充血水腫及炎性細胞浸潤；管腔內未見明顯分泌物；管壁平滑肌連續、完整。與空白組對比，模型組黏膜上皮呈明顯損傷性改變，上皮纖毛粘連、變短、倒伏甚至缺失，上皮細胞變性、壞死、脫落；偶見鱗狀上皮化生；黏膜下腺體增生、肥大及黏液腺化生，杯狀細胞明顯增多；支氣管壁各層組織充血、水腫，淋巴細胞、漿細胞浸潤；嚴重者可見支氣管壁平滑肌束斷裂、萎縮。模型組實驗鼠肺組織均呈現不同程度的上述損傷性變化，均造模成功。結合蘇木精-伊紅染色后的形態病理評分分級診斷標準，空白組評分為 0（0，1）分，模型組評分為 2（2，3）分，組間差異有統計學意義（Z=?6.422，P<0.001）。見圖 1。
圖1
兩組大鼠肺組織病理形態（蘇木精-伊紅染色法）
a. 空白組 ×100；b. 模型組 ×100；c. 空白組 ×200；d. 模型組 ×200
2.3 免疫組織化學染色結果
NE 結果顯示，空白組評分為 0（0，0）分，模型組評分為 2（2，3）分，組間差異有統計學意義（Z=?6.883，P<0.001）。MUC5AC 結果顯示，空白組評分為 0（0，1）分，模型組評分為 2（2，2）分，組間差異有統計學意義（Z=?6.385，P<0.001）。見圖 2、3。
圖2
兩組大鼠 NE 陽性表達情況（免疫組織化學染色法）
a. 空白組 ×100；b. 模型組 ×100；c. 空白組 ×200；d. 模型組 ×200
圖3
兩組大鼠 MUC5AC 陽性表達情況（免疫組織化學染色法）
a. 空白組 ×100；b. 模型組 ×100；c. 空白組 ×200；d. 模型組 ×200
2.4 愛顯藍-雪夫試劑染色結果
杯狀細胞計數結果顯示，空白組平均為（6.80±3.19）個，模型組平均為（57.93±7.79）個，組間差異有統計學意義（t=?44.267，P<0.001）。見圖 4。
圖4
兩組大鼠杯狀細胞數量情況（愛顯藍-雪夫試劑染色）
a. 空白組 ×100；b. 模型組 ×100；c. 空白組 ×200；d. 模型組 ×200
3 討論
慢阻肺作為一種常見和多發的慢性病，以慢性炎癥為主要特征，常與其他疾病共存[16-20]。截至目前，慢阻肺的確切病因尚不清楚，一般認為對慢性支氣管炎和肺氣腫有致病的因素都可能參與慢阻肺的發生發展。劉婭欽等[10]經過研究總結發現，炎癥介質與細胞因子、蛋白酶與抗蛋白酶、氧化物與抗氧化物、自身抗體、肺泡隔自身凋亡及基因多態性均參與了慢阻肺的發生與發展，氣道慢性炎癥是慢阻肺的重要病理特征，而在此過程中，氣道內黏液高分泌和中性粒細胞聚集是重要的病理生理基礎，并與其結局和預后密切相關[21-22]。
NE 是中性粒細胞釋放的炎癥介質之一，是一種依賴金屬離子才具有活性的降解酶，通過結合底物，進而降解細胞外基質中的各種蛋白[23-24]。血清中的 NE 在各種炎癥性疾病條件下會增加[25]。有學者研究發現，在生理情況下，NE 能清除肺部病原菌，保護機體免受感染傷害，并保持肺內微環境的平衡穩定；當炎癥發生時，中性粒細胞聚集，大量 NE 釋放，其過度降解細胞外膠原及過度水解彈性蛋白，致使氣道正常結構及纖毛上皮細胞的功能破壞，并誘導上皮內杯狀細胞的化生及黏膜內腺體的增生，進而導致黏液過量分泌，造成氣道的阻塞[26]。因此，黏液異常是許多呼吸系統疾病的特征，包括哮喘、囊性纖維化和慢阻肺[27]。而氣道黏液是一種黏液彈性凝膠，主要由高分子量的黏液糖蛋白和水組成，對維持肺功能和健康具有重要作用，它主要由上皮內的杯狀細胞及固有層的黏液腺分泌。黏蛋白是黏液的主要大分子成分，分為兩大類：凝膠形成的分泌黏蛋白（即 MUC5AC）和膜栓系黏蛋白[28]。其中 MUC5AC 為高度糖基化的分泌黏蛋白，憑借其富含半胱氨酸的重復序列，可以形成分子間和分子內的二硫鍵，從而形成復雜的聚合物，進而在上皮細胞表面形成聚合物黏液凝膠的框架；它是一種具有多種功能的分子，包括對上皮細胞的屏障功能、宿主與病原體的相互作用、免疫細胞對癌前病變或惡性病變部位的吸引以及腫瘤進展等[29]。本研究通過觀察實驗動物支氣管上皮的形態變化，結合愛顯藍-雪夫試劑染色，發現慢阻肺模型鼠杯狀細胞數明顯增多，同時通過免疫組織化學染色發現 NE 和 MUC5AC 的陽性表達模型組均高于空白組，這些結果與上述研究結果相同，究其原因從病理生理角度考慮，在炎癥及其他致病因子的刺激下，中性粒細胞聚集并大量釋放 NE，同時機體對其進行適應性改變，導致杯狀細胞大量明顯化生，進而 MUC5AC 分泌增加，氣道黏液增加，阻力增加，這一系列病理過程導致出現呼吸窘迫等癥狀。此外，在進一步證實了慢阻肺病理性黏液高分泌理論基礎的同時，設想如果把 NE 作為調控靶點，進而從機制上游抑制黏液高分泌，或許能更優地調控 MUC5AC。
綜上，本研究顯示，慢阻肺模型鼠的 NE 陽性表達增高，杯狀細胞數量增多，MUC5AC 的陽性表達增加，黏液分泌增加。然而，鑒于本研究的實驗對象僅為雄性大鼠，研究結果有一定的局限性，未來會在慢阻肺患者人群中進一步探討 NE、MUC5AC 對慢阻肺的影響機制。在基因、分子研究日益常態化的今天，MUC5AC 正在成為各種惡性腫瘤的潛在診斷、治療和預后靶點。在這種趨勢下，未來通過分子領域找到突破口，多方位靶向抑制 MUC5AC 的高分泌，進而減輕患者的氣道阻塞相關癥狀，提高患者生存質量，延長生存期，是未來的重要研究方向，并具有重要的臨床意義。
慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）以慢性咳嗽、咳痰、氣短或呼吸困難為主要臨床癥狀，進展至疾病后期常合并肺源性心臟病、呼吸衰竭甚至危及生命，嚴重危害人類健康[1-4]。世界范圍內慢阻肺患病率為 11.7%，死亡人數約 350 萬/年[5]，據世界衛生組織統計，慢阻肺是世界第四大致死疾病，每年近 6 億患者，且患者數逐年增長[6-7]。在我國，40 歲以上人群患病率為 13.7%，患者數量接近 1 億，為我國疾病死因的第 3 位[3, 8-9]。既往研究顯示慢阻肺與炎癥介質和細胞因子、蛋白酶及抗蛋白酶、氧化物與抗氧化物、自身抗體、肺泡隔自身凋亡及基因多態性均有關系，多環節、多元素共同參與了慢阻肺的發生及發展過程[10]。這其中，氣道黏液高分泌是慢阻肺的重要病理生理表現，其既是引起患者慢性咳痰的要素，也是造成患者易合并肺部感染的獨立危險因素[11]。黏蛋白 5AC（mucin 5AC，MUC5AC）是氣道黏液蛋白的主要成分，中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）是中性粒細胞釋放的蛋白酶，與炎癥損傷及修復相關，二者在氣道黏液分泌過程中均發揮重要作用[12]。因此，本研究通過檢測 NE 及 MUC5AC 在慢阻肺模型鼠氣道上皮細胞中的表達情況，進一步探討慢阻肺氣道黏液高分泌發生機制，旨在為臨床治療提供新思路。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選用雄性無特定病原體級 Sprague-Dawley 大鼠 60 只，體重在 180～220 g，平均體重約 205 g，以上大鼠均來自遼寧長生生物技術股份有限公司，合格證編號為 SCXK（遼）2015-0001。本研究已獲得遼寧省中醫藥研究院實驗動物倫理委員會審查批準，審批號為 2020-12。
1.2 儀器設備及試劑
儀器設備及試劑包括：TP1020 型自動脫水機及切片機（德國徠卡公司），YG-280KX 型烤片機及攤片機（湖北孝感陽光神琦醫用科技公司），JKDP2 型電熱恒溫培養箱（廈門醫療電子儀器廠），BX53 光電顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），自制 60 cm×60 cm×70 cm 透明有機玻璃煙熏箱，枸櫞酸、多聚甲醛、枸櫞酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司），磷酸鹽緩沖液、二氨基聯苯胺濃縮型試劑盒、愛顯藍-雪夫試劑染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），即用型免疫組織化學超敏試劑盒（福建邁新生物技術開發有限公司），大前門牌香煙（上海卷煙廠），兔抗 NE 抗體（PB1114，武漢博士德生物工程有限公司），鼠抗胃黏液素抗體（sc-21701，上海圣克魯斯生物技術公司）。
1.3 實驗環境
遼寧中醫藥大學實驗動物中心，溫度 22～25℃，濕度 55%～60%，許可證號為 SYXK（遼）2012-0010。
1.4 模型制備
共 60 只雄性 Sprague-Dawley 大鼠，采用完全隨機化分組方法，抽樣前對每只實驗動物進行順序編號，運用隨機號表法分成空白組和模型組，每組各 30 只。空白組大鼠不作處理，模型組大鼠運用氣道內滴注脂多糖結合煙熏的方法制備慢阻肺氣道黏液高分泌模型[13]。脂多糖的氣道內滴注：于實驗第 1 天、第 15 天（每隔 2 周 1 次）予 3.5% 水合氯醛腹腔麻醉后，采用一次性氣管插管法氣道內滴注濃度為 1 mL/mg 的脂多糖溶液 0.2 mL。將麻醉大鼠固定在鼠板上，仰臥位頭高尾低呈 45° 角放置，暴露聲門，在光源下將 16 號套管針沿氣管快速插入氣管內，拔出針芯，置一光滑干燥鏡面的小鏡子于導管針接口處，當觀察到鏡面隨大鼠呼吸而出現水霧時，表示氣管插管成功，立即接入 1 mL 注射器，快速注入 0.2 mL 脂多糖溶液。注射完成后，立即將大鼠固定板直立并旋轉及左右搖晃，使脂多糖溶液在肺內均勻分布。煙熏：造模大鼠脂多糖注射當天不進行煙熏，第 2～28 天（第 15 天除外）給予煙熏，放入自制的有機玻璃密閉熏煙箱內，每次 10 只，用 8 支香煙，每日煙熏 30 min。煙熏每天 2 次，每次 30 min。整個實驗過程中，兩組實驗動物均給予基礎飼料喂養，自由飲水。
1.5 標本采集
實驗第 31 天取材，用脊椎脫臼法處死大鼠，打開胸腔，暴露心臟，減掉右心耳，用注射器吸取磷酸鹽緩沖液 50 mL，從心尖刺入左心室后進行灌注，再用注射器吸取甲醛固定液 20 mL，仍從心尖刺入左心室后進行灌注（灌注 10 mL），取右肺各葉組織，用 4% 多聚甲醛溶液固定以備檢。
1.6 實驗方法
1.6.1 蘇木精-伊紅染色
染色方法：肺組織于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 后，將其從固定液中取出，全自動脫水機脫水，然后用石蠟包埋，切片用二甲苯透明，梯度乙醇及蒸餾水浸泡，蘇木精-伊紅染色，水洗、浸泡及透明，中性樹膠封片。將切片置于顯微鏡下，分別用低倍及高倍鏡觀察肺組織及氣道上皮形態。判讀標準：采用病理評分分級方法。診斷標準：按照黏膜上皮的損傷與修復、腺體增生肥大及黏液腺化生、支氣管壁其他組織的慢性炎性損傷 3 項指標綜合進行分級，無以上 3 項者為（?），輕度為（+），中度為（++），重度為（+++），按病理分級計分，（?）為 0 分，（+）為 1 分，（++）為 2 分，（+++）為 3 分。
1.6.2 免疫組織化學染色
染色方法：肺組織石蠟切片，烘烤 4 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇（無水、90%、80%、70%）分別浸泡 5 min，蒸餾水浸泡 5 min。于枸櫞酸鈉緩沖液（pH 值 6.0）中高壓修復 5 min。磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min，滴加 3% 過氧化氫去離子水孵育 10 min。磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min。血清封閉 15 min，加入磷酸鹽緩沖液稀釋的一抗（NE、MUC5AU 均為 1∶200），37℃ 孵育 2 h。磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min。加入生物素標記的二抗，37℃ 孵育 20 min，磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min。滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，37℃ 孵育 30 min。磷酸鹽緩沖液漂洗 3 min。滴加二氨基聯苯胺顯色劑，自來水漂洗，蘇木精復染 5 min。自來水漂洗 3 s，1% 鹽酸乙醇分化 5 s，自來水漂洗 30 s，再脫水、透明，最后中性樹膠封片。陽性程度判讀：NE 主要表達于肺組織中單核細胞、中性粒細胞等炎性細胞的細胞質內，呈棕黃色即為陽性[14]。MUC5AC 主要表達于氣道上皮細胞的細胞質內，呈棕黃色著色即為陽性。判讀標準：細胞無著色為（?），陽性著色細胞數占總細胞數<10% 為（±），11%～50% 為（+），51%～75% 為（++），≥75% 為（+++）。每張切片選取 5 個高倍視野（×200）對免疫組織化學結果進行判讀。按陽性細胞數分級計分，（?）為 0 分，（±）為 1 分，（+）為 2 分，（++）為 3 分，（+++）為 4 分[15]。
1.6.3 愛顯藍-雪夫試劑染色
染色方法：將肺組織切片常規脫蠟至水，蒸餾水洗 3 次，3% 乙酸溶液洗 3 min，1% 愛顯藍溶液染色 20 min，過碘酸氧化液氧化 20 min，自來水洗完后蒸餾水沖洗，Schiff 溶液染色 20 min，流水沖洗 5 min，經 95% 乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。存在杯狀細胞增生時，其細胞質內黏液經愛顯藍-雪夫試劑染色后呈藍色。結果判讀及標準：空白組與模型組每張切片隨機選取 5 個高倍視野（×200），用 Image-Pro Plus 6.0 軟件計數每個視野下杯狀細胞總數。
1.7 統計學方法
數據用 SPSS 17.0 軟件統計分析，計量資料若符合正態分布用均數±標準差表示，組間比較用獨立樣本 t 檢驗，計量資料若不符合正態分布用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較用 Mann-Whitney U 秩和檢驗。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 實驗動物一般情況
整個實驗過程中兩組實驗動物進食正常，監測體重無明顯變化。無神經異常行為，無意外死亡。
2.2 蘇木精-伊紅染色結果
空白組肺組織支氣管黏膜上皮完整，未見變性、壞死及脫落，支氣管黏膜上皮纖毛未見粘連、變短及倒伏，黏膜腺體排列規則，未見增生及肥大，間質未見充血水腫及炎性細胞浸潤；管腔內未見明顯分泌物；管壁平滑肌連續、完整。與空白組對比，模型組黏膜上皮呈明顯損傷性改變，上皮纖毛粘連、變短、倒伏甚至缺失，上皮細胞變性、壞死、脫落；偶見鱗狀上皮化生；黏膜下腺體增生、肥大及黏液腺化生，杯狀細胞明顯增多；支氣管壁各層組織充血、水腫，淋巴細胞、漿細胞浸潤；嚴重者可見支氣管壁平滑肌束斷裂、萎縮。模型組實驗鼠肺組織均呈現不同程度的上述損傷性變化，均造模成功。結合蘇木精-伊紅染色后的形態病理評分分級診斷標準，空白組評分為 0（0，1）分，模型組評分為 2（2，3）分，組間差異有統計學意義（Z=?6.422，P<0.001）。見圖 1。
圖1
兩組大鼠肺組織病理形態（蘇木精-伊紅染色法）
a. 空白組 ×100；b. 模型組 ×100；c. 空白組 ×200；d. 模型組 ×200
2.3 免疫組織化學染色結果
NE 結果顯示，空白組評分為 0（0，0）分，模型組評分為 2（2，3）分，組間差異有統計學意義（Z=?6.883，P<0.001）。MUC5AC 結果顯示，空白組評分為 0（0，1）分，模型組評分為 2（2，2）分，組間差異有統計學意義（Z=?6.385，P<0.001）。見圖 2、3。
圖2
兩組大鼠 NE 陽性表達情況（免疫組織化學染色法）
a. 空白組 ×100；b. 模型組 ×100；c. 空白組 ×200；d. 模型組 ×200
圖3
兩組大鼠 MUC5AC 陽性表達情況（免疫組織化學染色法）
a. 空白組 ×100；b. 模型組 ×100；c. 空白組 ×200；d. 模型組 ×200
2.4 愛顯藍-雪夫試劑染色結果
杯狀細胞計數結果顯示，空白組平均為（6.80±3.19）個，模型組平均為（57.93±7.79）個，組間差異有統計學意義（t=?44.267，P<0.001）。見圖 4。
圖4
兩組大鼠杯狀細胞數量情況（愛顯藍-雪夫試劑染色）
a. 空白組 ×100；b. 模型組 ×100；c. 空白組 ×200；d. 模型組 ×200
3 討論
慢阻肺作為一種常見和多發的慢性病，以慢性炎癥為主要特征，常與其他疾病共存[16-20]。截至目前，慢阻肺的確切病因尚不清楚，一般認為對慢性支氣管炎和肺氣腫有致病的因素都可能參與慢阻肺的發生發展。劉婭欽等[10]經過研究總結發現，炎癥介質與細胞因子、蛋白酶與抗蛋白酶、氧化物與抗氧化物、自身抗體、肺泡隔自身凋亡及基因多態性均參與了慢阻肺的發生與發展，氣道慢性炎癥是慢阻肺的重要病理特征，而在此過程中，氣道內黏液高分泌和中性粒細胞聚集是重要的病理生理基礎，并與其結局和預后密切相關[21-22]。
NE 是中性粒細胞釋放的炎癥介質之一，是一種依賴金屬離子才具有活性的降解酶，通過結合底物，進而降解細胞外基質中的各種蛋白[23-24]。血清中的 NE 在各種炎癥性疾病條件下會增加[25]。有學者研究發現，在生理情況下，NE 能清除肺部病原菌，保護機體免受感染傷害，并保持肺內微環境的平衡穩定；當炎癥發生時，中性粒細胞聚集，大量 NE 釋放，其過度降解細胞外膠原及過度水解彈性蛋白，致使氣道正常結構及纖毛上皮細胞的功能破壞，并誘導上皮內杯狀細胞的化生及黏膜內腺體的增生，進而導致黏液過量分泌，造成氣道的阻塞[26]。因此，黏液異常是許多呼吸系統疾病的特征，包括哮喘、囊性纖維化和慢阻肺[27]。而氣道黏液是一種黏液彈性凝膠，主要由高分子量的黏液糖蛋白和水組成，對維持肺功能和健康具有重要作用，它主要由上皮內的杯狀細胞及固有層的黏液腺分泌。黏蛋白是黏液的主要大分子成分，分為兩大類：凝膠形成的分泌黏蛋白（即 MUC5AC）和膜栓系黏蛋白[28]。其中 MUC5AC 為高度糖基化的分泌黏蛋白，憑借其富含半胱氨酸的重復序列，可以形成分子間和分子內的二硫鍵，從而形成復雜的聚合物，進而在上皮細胞表面形成聚合物黏液凝膠的框架；它是一種具有多種功能的分子，包括對上皮細胞的屏障功能、宿主與病原體的相互作用、免疫細胞對癌前病變或惡性病變部位的吸引以及腫瘤進展等[29]。本研究通過觀察實驗動物支氣管上皮的形態變化，結合愛顯藍-雪夫試劑染色，發現慢阻肺模型鼠杯狀細胞數明顯增多，同時通過免疫組織化學染色發現 NE 和 MUC5AC 的陽性表達模型組均高于空白組，這些結果與上述研究結果相同，究其原因從病理生理角度考慮，在炎癥及其他致病因子的刺激下，中性粒細胞聚集并大量釋放 NE，同時機體對其進行適應性改變，導致杯狀細胞大量明顯化生，進而 MUC5AC 分泌增加，氣道黏液增加，阻力增加，這一系列病理過程導致出現呼吸窘迫等癥狀。此外，在進一步證實了慢阻肺病理性黏液高分泌理論基礎的同時，設想如果把 NE 作為調控靶點，進而從機制上游抑制黏液高分泌，或許能更優地調控 MUC5AC。
綜上，本研究顯示，慢阻肺模型鼠的 NE 陽性表達增高，杯狀細胞數量增多，MUC5AC 的陽性表達增加，黏液分泌增加。然而，鑒于本研究的實驗對象僅為雄性大鼠，研究結果有一定的局限性，未來會在慢阻肺患者人群中進一步探討 NE、MUC5AC 對慢阻肺的影響機制。在基因、分子研究日益常態化的今天，MUC5AC 正在成為各種惡性腫瘤的潛在診斷、治療和預后靶點。在這種趨勢下，未來通過分子領域找到突破口，多方位靶向抑制 MUC5AC 的高分泌，進而減輕患者的氣道阻塞相關癥狀，提高患者生存質量，延長生存期，是未來的重要研究方向，并具有重要的臨床意義。
